Mikroskopische Fluoreszezaufnahmen üben einen besonderen Reiz auf den Betrachter aus. Die leuchtenden Farben vor schwarzem Hintergrund, verbunden mit dem Informationsgehalt den dieses Beleuchtungsverfahren zu bieten hat, sind meiner Meinung nach sehr reizvoll. Bei vielen Amateuren kommt daher früher oder später der Wunsch auf, sein Mikroskop dahingehend aufzurüsten.
Zumindest war das bei mir so.
Schnell bemerkt man dann, das dafür ganz bestimmte Filterkombinationen und Fluoreszenzkondensatoren nötig sind. Diese Filterwürfel sind, auch gebraucht, oft noch sehr kostspielig, müssen genau zum Anwendungszweck passen und sind zu guterletzt auch noch anfällig für Alterung/Schäden.
Klar kann man sich auch ein komplettes neues Fluoreszensmikroskop kaufen, aber da bleibt dann sowohl der Bastelspaß, als auch eine Menge Geld auf der Strecke.
Im Folgenden möchte ich hier meine Lösung vorstellen die mit einem gewöhnlichen Auflichtkondensor und einigen relativ einfach zu beschaffenden Filtern zu realisieren ist. Einige Testaufnahmen sollen dabei zeigen welchen jeweiligen Einfluss die einzelnen Komponenten dabei auf die Bildqualität haben.
Ich hoffe dem ein oder anderen so bei seinem Projekt von Nutzen zu sein.
Doch nun erstmal zum eigentlichen Aufbau, einem Zeiss WL mit Auflichttubus:IMG_20230808_140257.jpg
(Nicht der schönste Hintergrund, ich weiß)
Vorteil bei diesem Konstrukt ist, das sich sowohl die LED als auch der Farbteiler sowie die Anregungs und Emissionsfilter getrennt voneinander einfach austauschen lassen.
Perfekt zum pröbeln!
Natürlich funktionieren auch einfachere Varianten des Auflichkondensors:IMG_20241022_143155.jpg
Hauptsache es läßt sich auf Beleuchtungsseite ein Filter zwischen Lichtquelle und Umlenkspiegel einbringen.
Auf der Beobachtungsseite braucht man natürlich dann einen passenden Emissionsfilter.
In dieser Testreihe für Blauanregung wurde bei allen Aufnahmen ein gelber Farbglasfilter mit 530nm Langpass angewendet.
(Hier funktionieren übrigens auch geeignete Gelbfilter aus der Analogfotografie sehr gut.)
Und jetzt zur eigentlich Testreihe.
Alle Aufnahmen wurden am oben gezeigten Mikroskop mit einer Sony a6500 angefertigt. Alle 3Watt LED's bei allen Aufnahmen mit gleicher Leistung versorgt.
Belichtungszeit bei allen Aufnahmen1/15sec, ISO 400
Fragen: Wie wirken sich verschiedene Anregungsfilter auf die Abbildung aus? Kann man bei geeigneter LED vielleicht sogar ganz auf einen Anregungsfilter verzichten? Und was erreicht man über Bildbearbeitung?
Zuerst einmal ganz ohne Anregungsfilter:IMG_20241022_155554.jpg
Hm, naja sieht eher bescheiden aus, obwohl es sich um eine schmalbandige Qualitäts LED handelt. Aber selbst ein kleiner Anteil an langwelligem (grünem) Licht, reicht hier bereits aus, um die Autofluoreszenz des Chlorophylls im Moosblatt komplett zu überstrahlen.
Jetzt mal mit einem alten Farbglasfilter:IMG_20241022_164329.jpg
OK, mit einem 4mm dicken Blaufilter aus Farbglas (BG12 von Zeiss) sieht das schon besser aus. Allerdings ist das Bild (bei gleicher Belichtungszeit) dann auch zappenduster.
Jetzt das ganze mit einem Metallinterferenzfilter (KP490nm von Zeiss Jena):IMG_20241022_163349.jpg
Die deutlich bessere Lichtausbeute des Interferenzfilters ist deutlich zu sehen, und führt nun auch erstmalig zu so etwas wie einem Bild.
Wie schaut es nun mit der Möglichkeit aus das Bild nachträglich zu bearbeiten, indem man den unerwünschten Anteil im Farbkanal einfach herausrechnet:IMG_20241022_165727.jpg
OK, das funktioniert aber natürlich nur bei roter Fluoreszenz. Grüne Emissionen wie beispielsweise bei Acridinorangefärbung sind dann aber auch futsch...
Schauen wir als nächstes ob sich nicht durch die Wahl einer anderen LED doch noch etwas verbessern lässt...
Jetzt das Ganze nochmal mit einer royalblauen LED.
Da ich leider kein Datenblatt zu dieser Variante habe, hab ich sie in den Bildern mit "Eigenbau" betitelt. Leider steht mir kein Spektrometer zur Verfügung um sie vermessen.IMG_20241022_172309.jpgIMG_20241022_172409.jpgIMG_20241022_172432.jpg
Hier zeigt sich das sich die Suche nach einer geeigneten LED definitiv lohnt! Selbst ganz ohne Anregungsfilter sind ganz gute Aufnahmen möglich. Es scheint zumindest bei der Anregung von Chlorophyll als auch bei Acridinorange günstiger zu sein eine royalblauen LED zu verwenden. So zumindest meine Erfahrung.
Zitat von: Spectrum in Oktober 22, 2024, 17:36:16 NACHMITTAGS...
Hier zeigt sich das sich die Suche nach einer geeigneten LED definitiv lohnt! Selbst ganz ohne Anregungsfilter sind ganz gute Aufnahmen möglich. Es scheint zumindest bei der Anregung von Chlorophyll als auch bei Acridinorange günstiger zu sein eine royalblauen LED zu verwenden.
...
Toll dass du was umgesetzt hast. An meiner LED muss ich noch arbeiten.
Grüße
Peter
Vielen Dank für die Blumen.
Frage:
Willst du auch eine Auflichtfluoreszenzbeleuchtung umsetzen?
Vielleicht kann ich dir da weiterhelfen?
Weiter geht's mit der Frage welche Ergebnisse man bei der Verwendung einer Weißlicht LED erwarten kann.
Belichtungszeit und ISO sind gleichgeblieben, also
1/15sec, Iso400. Weißabgleich ist auch bei allen Aufnahmen fest auf Tageslicht eingestellt. Um Abweichungen durch "Anlaufschwierigkeiten" bzw. Ausbleichen des Chlorophylls entgegenzuwirken, wurden alle Aufnahmen mit bereits länger angestrahlter Probe durchgeführt, und erfolgten in kurzen Abständen. Alles in ca 10min. Die "hellsten" Bilder dabei am Ende der Versuchsreihe.
Zuerst mit 4mm dickem Farbglasfilter BG12:IMG_20241024_212734.jpgIMG_20241024_212807.jpg
Funktioniert aber mit starkem Lichtverlust.
Jetzt mit einem alten Interferenzfilters KP490 von Zeiss Jena:IMG_20241024_212851.jpgIMG_20241024_212922.jpg
Hier ist das Bild zwar hell aber komplett rot überstrahlt. Mit blauer LED war das Bild gut! OK, diese Filter sind nicht mehr die jüngsten und bestimmt nicht mit hochwertigen modernen Filtern vergleichbar. Sehen wir mal was passiert wenn wir zwei davon hintereinanderschalten:
IMG_20241024_213002.jpgIMG_20241024_213034.jpg
Jetzt sieht das schon ganz anders aus. Was auch erkennbar wird ist das es auch sichtbare Unterschiede zwischen den verschiedenen weißen LED giebt. Der Blauanteil bei höheren Farbtemperatur en der LED hat auch seinen Einfluss.
Zuguterletzt das ganze ohne jeglichen Anregungsfilter:IMG_20241024_213102.jpgIMG_20241024_213421.jpg
Das wird dann natürlich nix.
Hier eine kleine Zwischenfrage an die Admins und Mitforisten. Ich versuche mit meinen Bildern hier eine Vergleichsübersicht für alle die einen beschädigten Filterwürfel reparieren wollen oder sich selbst etwas einfaches zusammenstellen wollen.
Macht das so Sinn?
Oder bombardiere ich euch hier nur mit einer Flut an Bildern?
Kritik am Versuchsaufbau sind natürlich auch gern gesehen.
Und damit es nicht allzu dröge wird, auch einmal Bilder von Trompetentieren (Stentor coeruleus) mit Acridinorange gefärbt:IMG_20241024_222916.jpg
Alles mit verhältnismäßig einfachen Mitteln umgesetzt.
Hallo Holger,
Stell doch bitte mal deine AO Routine vor. Das Ergebnis überzeugt 🙂👍
Liebe Grüße Daniel
Das "Färbeprotokoll" für diese Aufnahme ist einfach:
Eine winzige Messerspitze AO in 5ml Volvic auflösen. In diese Stammlösung tauche ich dann einen Zahnstocher ein. Damit den Tropfen auf dem Objektträger (in dem Fall eine Stentor Milchkultur), verrühren, fertig.
Das Stentor-Bild gehört auch zu einem Test für verschiedene Filterkombinationen. Die Filterkombination/Beleuchtung hat einen sehr großen Einfluß.
Dieselben Trompeter, gleiche Rahmenbedingungen, nur ein anderer Anregungsfilter...IMG_20240125_204027.jpg
Zum Abschluss geht es heute noch um den Einfluss des Teilerspiegels auf das Fluoreszenzbild. Wieder für die Blauanregung von Chlorophyll.
Frage: Wie gut funktioniert das Ganze wenn man anstatt eines Dichroid ("FT510"), einen einfach verspielten Umlenkspiegel ( in diesem Fall ein "H-Pl" von Zeiss) wie er für gewöhnliches Auflicht genutzt wird, verwendet.
Auch hier gleiche Rahmenbedingungen wie zuvor. Lediglich die Belichtungszeit hat sich etwas geändert (1/25sec):
ORG_DSC00418.JPGDSC00420.JPGIch würde sagen, der Unterschied ist nur sehr gering. Die erreichbaren Verschlusszeiten können sich mit 1/25sec bei Iso400 auch sehen lassen. Allerdings wurden hier auch 3Watt LED's bei voller Leistung und ein sehr lichtstarkes Fluorid Objektiv (Nikon Fluor 10 mit NA 0,5) genutzt aber die Ergebnisse sind trotzdem, glaube ich, gut vergleichbar.
Mein Fazit: Auch mit einem umfunktionierten Auflichkondensors, bzw mit einem unvollständigen Filterwürfel, läßt sich eine leistungsstarke Auflichtfluoreszenzeinrichtung improvisieren. Die richtige Wahl der LED hat dabei einen großen Einfluss. Zumindest bei der Autofluoreszenz von Chlorophyll (nach meiner Erfahrung auch bei Acridinorange), ist eine royalblaue Lichtquelle mit genügend Abstand zur Grenzwellenlänge des Langpassfilters klar im Vorteil.
Weißlicht LED's sind nur bei Verwendung mit sehr guten Anregungsfiltern und gleichzeitig großen Leistungseinschränkungen geeignet.
Liebe Grüße
Holger
Anbei noch das Spektrum der weiter oben als "Eigenbau" bezeichneten LED. Ihr Maximum liegt bei ca 447nm:
IMG_20241118_191551.jpg
Ein Paar Tipps:
1. Falls die Proben und Farbstoffe/Autofluoreszenzen dies zulassen, sind Anregungswellenlängen oberhalb 470 nm günstiger, da dann die Autofluoreszenz der Gläser geringer angeregt wird und dadurch der Hintergrund schwärzer bleibt.
2. Um noch mehr Farbe ins Spiel zu bringen, kann man für vergleichsweise wenig Geld mit einer Lösung mit "Hoechst 33258" die DNA der Zellkerne färben und damit für fast alle biologischen Proben eine zusätzliche Farbe ins Spiel bringen. Zur Anregung eignet sich dann eine UV-LED (365-405 nm).
3. Wer LED mehrerer Wellenlängen kombinieren will, der kann das vorzugsweise mit einem separaten Aufbau und einem Lichtleiter tun, der dann mit geeigneter Optik in den Auflicht-Strahlengang eingekoppelt wird. In dem separaten Aufbau können dann die LED kollimiert, vereinigt und auf den Lichtleiter-Eitritt refokussiert werden. Eine noch simplere Variante besteht darin, einen "dicken", typischerweise Flüssigkeits-gefüllten Lichtleiter mit 2 oder 3 mm Innendurchmesser direkt auf eine RGBW-LED aufzusetzen, der dann auch gleeichzeitig als Homogenisator dient. Ich verwende hierfür gerne die Ostar Stage-LED oder an anderen Mikroskopen auch mal selbst per Rückflusslöten zusammengestellte LED-Kombinationen, die dann auch den UV-Bereich enthalten können (z.B. Lumileds Luxeon Z Color bzw. Z-UV mit einem 4-fach Star). Moderne high-power-LED sind derartig hell, dass man den dabei unvermeidlichen Effizienzverlust bei der Einkopplung leicht verschmerzen kann.
Hallo Michael,
Deine Anmerkungen zum Thema sind sehr interessant.
1.Was die Autofluoreszenz unterhalb 470nm angeht spielt, denke ich auch der Objektivtyp eine entscheidende Rolle. Was denkst du?
2. Stimmt.
3.Welche Belichtungszeiten erreichst du denn bei einem eingekoppelten Lichtleiter wenn dieser nur auf Blau steht in Relation zu einer reinen 3Watt LED (ebenfalls blau)?
Interessierte Grüße
Holger
Hallo Michael,
Punkt 3 finde ich sehr interessant. Ich bin gerade an der Konstruktion eines 6 fach Revolver Systems für das Zeiss Universal. Aber bin mit meiner Konstruktion bisher nicht ganz glücklich. Könntest du mal deinen Aufbau zeigen bitte?
Liebe Grüße Daniel
Zitat von: Spectrum in Januar 19, 2025, 09:26:15 VORMITTAG1.Was die Autofluoreszenz unterhalb 470nm angeht spielt, denke ich auch der Objektivtyp eine entscheidende Rolle. Was denkst du?
Das ist sehr gut möglich. Ich habe das nicht systematisch untersucht, aber ganz los wurde ich die Problematik auch mit Zeiss Fluaren und Neofluaren nicht. Je nach Intensität des Fluoreszenzsignals muss das auch nicht unbedingt stören. Ich "quäle" die Objektive auch maximal, indem ich oftmals eine spezifische Fluoreszenztechnik, die "TIRF-Mikroskopie", anwende, bei der ein Großteil des Anregungslichtes am Deckglas-Proben-Übergang reflektiert wird und dadurch gleich zwei Mal die Linsensysteme z.B. eines 63/1.46 Apochromaten passieren muss. Mein 100x/1.45 alpha Plan-Fluar (oder ein 100x/1.46 Plan-Apochromat) ist in dieser Beziehung allerdings auch nicht besser. Ein 20x/0.8 Plan-Apochromat wirkt, ohne es systematisch geprüft zu haben, im Hintergrund deutlich schwärzer, wird allerdings auch nicht im TIRF-Modus betrieben.
Zitat3.Welche Belichtungszeiten erreichst du denn bei einem eingekoppelten Lichtleiter wenn dieser nur auf Blau steht in Relation zu einer reinen 3Watt LED (ebenfalls blau)?
Das ist ohne normierte Fluorezenzproben kaum allgemein beantwortbar. Spasseshalber hatte ich einmal eine Consumer-Kamera (Sony A7RII) ans Mikroskop adaptiert und damit fluoreszierende Proteine in lebenden Zellen im TIRF fotografiert, was aber keiner normalen Anwendung entspricht und Belichtungszeiten um 1/8 bis 1 s erforderte, um bei basis-ISO den Sensor in den hellsten Strukturen bis zur Sätigungsgrenze zu bringen. Bei den üblicherweise verwendeten wissenschaftlichen Kameras liegen die Belichtungszeiten je nach Fragestellung typischerweise zwischen 1/10 s und 1/2000 s.
Wenn ich die einzelen oder per Dichroit kombinierten LED sauber in den Lichtleiter ein- und auskopple, liegt der Verlust gegenüber Freistrahl bei weniger als 50% der im Freistrahl erreichbaren Leistungsdichte (die "power density" wird in der Fokalebene als W/cm² gemessen oder berechnet). Wenn ich den Lichtleiter gleichzeitig als Homogenisator für eine am Lichtleitereingang direkt aufgesetzte RGWB-LED einsetze, dann sind die Verluste erheblich größer und man kommt dann auf ca. 1/5 der Leistungsdichte. Bei niedrig vergrößernden Objektiven mit in Relation zur Maßstabszahl immer noch hoher NA wären diese Verluste geringer, da deren hintere Fokalebene ("back focal plane") einen größeren Durchmesser hat, als ein 100x oder 63x-Objektiv. Nachdem ich die direkte Lichtleiter-Einkopplung nicht mit einer 3-Watt-LED, sondern mit ca. 9-10 Watt elektrischer Leistung pro LED-die und im Fall von Royalblau einer heftigen 2,6-2,8 W radiant power mache, ist an den non-TIRF-Systemen meist trotzdem noch ein Neutralgrau- oder Polfilter eingeschwenkt, um die extreme Power etwas zu dämpfen und die Proben bei Mikroskopie mit hochaperturigen Öl-Immersionsobjektiven nicht allzuschnell auszubleichen. Bei den spezialisierten TIRF-Systemen, die aufgrund des speziellen Strahlenganges einen Verlust von ca. 85-90% der Anregungsleistung mit sich bringen, ist mir diese Einkopplungsvariante hingegen zu schwach und ich bevorzuge den Freistrahl, um in der Fokusebene auf maximale Leistungsdichten zu kommen.
Falls die Lichtleistung ein Problem sein sollte, hätte ich noch ein besonderes "Schmankerl": die miniaturisierte, kühl-weiße remote phosphor-Lichtquelle von Kyocera SLD mit 1.000 Lumen ist ein echter Brecher und kann aufgrund ihrer kleinen Étendue auch in hoch vergrößernde Objektive mit kleiner back focal plane nahezu verlustfrei eingekoppelt werden. Aufgrund des breiten Spektralverhaltens kann man mit dieser Lichtquelle zwischen 430 nm (die Wellenlänge der beiden on-chip Pumplaser; insgesamt ist das ein Klasse-II-Laser-Device!) und in dem breiten Phosphorpeak bis ca. 620 nm über entsprechende Anregungsfilter fast alles abgreifen, was man für eine FLuoreszenz-Anregung so braucht. Das Ding kostet zwar knapp 200 € und erfodert eine saubere Spannungs- und Strom-kontrollierte Treiberelektronik und auch eine gute Kühlung (z.B. per passivem CPU-Kühler), aber in Sachen Einkopplungseffizienz ist sie aktuell durch nichts zu schlagen, was nicht direkt ein Laser wäre.
Zitat von: Daniel Scheibenstock in Januar 19, 2025, 11:24:22 VORMITTAGPunkt 3 finde ich sehr interessant. Ich bin gerade an der Konstruktion eines 6 fach Revolver Systems für das Zeiss Universal. Aber bin mit meiner Konstruktion bisher nicht ganz glücklich. Könntest du mal deinen Aufbau zeigen bitte?
Welcher Aufbau interessiert Dich besonders? Die 4er-LED mit direkter Lichtleitereinkopplung oder die Variante mit Strahlvereinigung durch dichroitische Spiegel?
Hallo Michael,
Für mich sind das ja mal Einblicke in eine ganz andere Liga der Fluoreszenzmikroskopie, wow!
Interessant ist da grundsätzlich zunächst einmal alles, auch die Verwendung von extrem hochaperturigen Objektiven für TIRF.
Für meine doch eher bescheidenen Versuche der In Vivo Färbung mit mehreren Fluorochromen gleichzeitig, würde mich aber vor allem die von dir angesprochenen Einkopplung über Dichroit bzw. Lichtleiter interessieren.
1. Frage:
Damit müsste es doch theoretisch möglich sein, sehr effizient zwei verschiedene Anregungswellenlängen simultan einspeisen zu können, oder? Beispielsweise um eine Probe die mit Hoechst33342 und Acridinorange gleichzeitig gefärbt wurde, auch gleichzeitig mit den erforderlichen Wellenlängen anregen zu können.
2. Frage:
Ist das Prinzip bei dem Dichroide verwendet werden mit dem Colibri System von Zeiss vergleichbar?
Ein Bild oder eine Skizze deines Aufbaus wäre da sehr interessant.
3. Frage:
Wie genau spiegelt du das Licht in die back focal plane ein?
4. Frage:
Solch ein System ermöglicht doch dann auch eine Feinregulierung der Leistung beider Wellenlängen in Relation zueinander, oder?
5. Frage:
Erspart solch ein System dann auch einen aufwändigen Teilerspiegel mit mehreren Bändern, wenn man die Anregung "schmal genug" vorfiltert?
Neugierige Grüße Holger
Zitat von: MS19 in Januar 19, 2025, 19:10:18 NACHMITTAGSZitat von: Daniel Scheibenstock in Januar 19, 2025, 11:24:22 VORMITTAGPunkt 3 finde ich sehr interessant. Ich bin gerade an der Konstruktion eines 6 fach Revolver Systems für das Zeiss Universal. Aber bin mit meiner Konstruktion bisher nicht ganz glücklich. Könntest du mal deinen Aufbau zeigen bitte?
Welcher Aufbau interessiert Dich besonders? Die 4er-LED mit direkter Lichtleitereinkopplung oder die Variante mit Strahlvereinigung durch dichroitische Spiegel?
Beides gleichermaßen 🙂 sehr interessant was du uns da schreibst 👍
Hui, gleich eine ganze Batterie von Fragen ...
Zitat von: Spectrum in Januar 19, 2025, 21:04:28 NACHMITTAGS1. Frage:
Damit müsste es doch theoretisch möglich sein, sehr effizient zwei verschiedene Anregungswellenlängen simultan einspeisen zu können, oder? Beispielsweise um eine Probe die mit Hoechst33342 und Acridinorange gleichzeitig gefärbt wurde, auch gleichzeitig mit den erforderlichen Wellenlängen anregen zu können.
Prinzipiell ist das so, aber es müssten dann a) beide Anregungswellenlängen sauber gefiltert sein, entweder jede für sich oder mit einem Dualband-Anregungsfilter, b) im Filterwürfel ein passender Dualband-Dichroit befindlich sein und c) die Anregungswellenlängen per Dualband-Emissionsfilter weggeblockt sein, damit die Kamera nicht die Anregungswellenlängen mit abbekommt. Mit einer Bayer-Matrix-Farbkamera können dann hinreichend divergente Farben auch ordentlich aufgzeichnet werden. Ich selber nutze fast ausschließlich Monochrom-Kameras und muss daher entweder sequentiell belichten oder die Emissionsbänder über eine Sekundäroptik teilen und mit entsprechenden Bandpass-Filtern geputzt als Halbbilder nebeneinander auf dem Kamerasensor abbilden (Sekundäroptik = DualView oder OptoSplit). Wer zwei Kameras hat, kann freilich auch einen Teilerwürfel mit zwei Kameraports nutzen. Aber mal Hand aufs Herz: wann braucht man denn überhaupt eine echte Gleichzeitigkeit? Bei fixierten und gefärbten Proben eigentlich nie! Bei meinem Lieblings-Genre, der Mikroskopie schneller zellbiologischer Funktionen in lebenden Zellen kann das mal nötig werden, aber bei vielen Anwendungen ist ein Umschalten zwischen den Fluoreszenzbändern innerhalb 0,2-4 s kein echtes Problem.
Zitat2. Frage:
Ist das Prinzip bei dem Dichroide verwendet weren mit dem Colibri System von Zeiss vergleichbar?
Ein Bild oder eine Skizze deines Aufbaus wäre da sehr interessant.
Ja, Colibri, CoolLed, Lumencor, ... "licht engines sind nichts anderes als das: kollimierte LED (oder Laser bzw. andere solid state-Lichtquellen), die per Dichroiten vereinigt werden. Skizze für 4 LED könnte ich gerne anfügen, aber ich finde in der "Schnellantwort" gerade keine Möglichkeit, ein JPEG hochzuladen!?
Zitat3. Frage:
Wie genau spiegelt du das Licht in die back focal plane ein?
Das Mikroskop benötigt dafür schon einen Auflicht-Strahlengang mit einem Halter/Schieber/Revolver zum Einsetzen eines Filterwürfels. Die Lichtquelle wird kollimiert (bei LED z.B. über eine asphärische Kondensorlinse mit 7-20 mm Brennweite und einer NA von 0,5-0,8), dann wieder fokussiert mit einer Linse, die das Licht in die back focal plane fokussiert. Je nach Bauweise des Mikroskops und Zugänglichkeit im Auflicht-Strahlengang kann dies z.B. eine achromatische Linse mit 90-200 mm Brennweite sein, deren Durchmesser hinreichend ist, um die zur Auslauchtung des gesamten Sehfeldes erforderliche NA aufzuweisen. Bei unendlich-korrigierten Systemen wäre diese Optik telezentrisch zu gestalten, bei endlicher Tubuslänge auf die jeweilige Geometrie des Systems angepasst eine entsprechende Position der Pupillen. Ob man den Fokus in die back focal plane geschafft hat, wird erkennbar, indem man das Anregungslicht an der Zimmerdecke ("quasi-unendlich") betrachtet und dort die Struktur des LED-die gut erkennt.
Zitat4. Frage:
Solch ein System ermöglicht doch dann auch eine Feinregulierung der Leistung beider Wellenlängen in Relation zueinander, oder?
Ja, das System kann dann entweder elektronisch gedimmt werden (Variante 1 über Konstantstrom-Treiber unterschiedlicher mA-Zahl oder Variante 2 über Pulsweiten-Modulation) oder man kann über Graufilter einzelne Kanäle abschwächen.
Zitat5. Frage:
Erspart solch ein System dann auch einen aufwändigen Teilerspiegel mit mehreren Bändern, wenn man die Anregung "schmal genug" vorfiltert?
Wenn man starke Lichtquellen und Fluoreszenzsignale hat, kann man dann in der Tat an Stelle eines Multiband-Farbteilers auch einen halbdurchlässigen 80:20- oder 70:30-Spiegel nutzen. Optimal ist´s natürlich nicht, aber machbar schon. Dies gilt natürlich nicht nur für den Haupt-Teilerspiegel im Mikroskop, sondern auch davor, bei der Kombination verschiedener LED-Wellenlängen. Ich mache das nicht so, da in meinem Sammelsurium an Farbteilern und Filtern immer noch irgendetwas zu finden ist, was besser als ein halbdurchlässiger Spiegel wäre, aber machbar ist´s. Man muss sich auch vergegenwärtigen, dass in manchen Spezialmikroskopen bis zu Quad- oder Pentaband-Filtern verbaut werden, die zwar bequem sind, da man die Farbteiler/Filter nicht mehr hin- und herwechseln muss, dabei aber die Exitations- und Emissionsbänder vieler Fluoreszenzfarbstoffe oftmals nicht ideal getroffen bzw. mehr oder weniger stark beschnitten werden, so dass die Sensitivität hinter etwas einfacher gestalteten Geräten zurückbleibt.
BTW: in einem nicht-mikroskopischen Fluoreszenz-Messsystem, bei dem ich die LED-Arrays leicht schräg einkoppeln kann, habe ich bei den jüngsten Gerätegenerationen den Teilerspiegel sogar ganz hinausgeworfen und arbeite ausschließlich mit scharfbandigen Filtern. Das System übertrifft in quasi allen Aspekten ein kommerzielles FLIPR-Penta-System (ca. 350 t€) mit deutlichem Abstand und hat weniger als ein Zehntel davon gekostet. ;-)
LED hub.jpg
So, jetzt habe ich die Upload-Funktion entdeckt. Hier ein sehr schematisches Bild meines ersten LED-Vereinigers, der mit Qioptiq-Schienen- und Mikrobank-Komponenten aufgebaut war und in einen 3-mm-Flüssig-Lichtleiter (Lumatec) einkoppelte. Die starker gekrümmten Linsen direkt vor den LED sind Plastik-Asphären von Edmund Optics mit f=17,5mm und d=25mm. Die am unteren Grafikrand zu erkennende Linse ist ein Achromat mit f=50mm. Die im 45°-Winkel stehenden Elemente sind dichroitische Spiegel im Standardmaß von ca. 36mm x 25mm, die in Klemmhaltern von Edmind Optics auf selbst gefrästen Sockeln stehen und auf dem FLR40-Schienensystem von Qioptic platziert sind. Das Ganze wurde zunächst auf einer Aufbauplatte mit M6-Gewinden im 20-mm-Raster und später auf einer selbst zugerichteten 10-mm-Aluplatte aufgebaut und mit einer hinterlüteten schwarzen Umhausung versehen, damit nicht der ganze Raum erleuchtet wird.
Heute bin ich weniger ehrgeizig und kombiniere für "normale Fluoreszenzanwendungen" entweder vier auf einem Star/MCPCB eng beieinander platzierte LED unterschiedlicher Wellenlängen mit aufgesetztem Lichtleiter oder bei hohen Anforderungen an die Anregungsintensität nur noch jene LED-Wellenlängen, die ich für einen methodischen Ansatz auch wirklich benötige. Letzteres dann ohne Lichtleiter auf einer Rail, die ich direkt hinter dem Mikroskop aufbaue oder auf einem Stangensystem, welches ich direkt am Stativ befestigen kann. Ein solches Stangen- und Tubussystem (Qioptiq-Mikrobank) werwende ich auch, um den zum Mikroskop geführten Lichtleiter zu kollimieren und in die back focal plane zu fokussieren. Zwischen diesen beiden Linsensystemen kann dann konjugiert zur Fokalebene auch noch eine Irisblende eingesetzt werden, die dann als Feldblende fungiert und vagabundierendes Licht vom System abhält.
Guten Morgen Michael,
Zu meiner großen Freude habe ich gerade deine umfangreichen Antworten gelesen.
Zunächst einmal ein großes Dankeschön für die Zeit und Mühe deinerseits um meine "Fragenbatterie" zu beantworten.
Das du dein umfangreiches Fachwissen, hier in diesem Forum, so bereitwillig mit ambitionierten Hobbymikroskopikern teilst, ist wirklich toll.
Ich hätte sicherlich noch einen ganzen Haufen weitere Fragen...
Um den Rahmen nicht zu sprengen, beschränke ich mich wohl besser auf einige konkrete Fragen zu meiner Anwendung, und beschreibe kurz welche (einfachen) Mittel mir zur Verfügung stehen.
Mein Ziel ist es die Zellorganellen lebender Einzeller simultan mit Fluorochromen wie Acridinorange, Hoechst33342, Rhodamin 6G/ Rhodamin123 etc. anzufärben, um im Anschluss dann Videoaufnahmen dieser Organismen zu erstellen, auf denen alle angefärbten Organellen gleichzeitig zu sehen sind.
So wie in diesem Beitrag hier:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=search2
In diesem konkreten Beispiel wurde mit Acridinorange und Hoechst33342 gefärbt, angeregt wurde mit UV.
Ausserdem sieht man hier auch die Autofluoreszenz des Chlorophylls der endosymbiotischen Algen, die im Zellinneren von Paramecium bursaria leben.
Ich denke das es dabei von großem Vorteil wäre das Anregungslicht gezielt auf die einzelnen Banden der Anregungsmaxima der Fluorochrome abzustimmen, und die jeweiligen Kanäle auch in Ihrer Intensität regulieren zu können.
Die Lichtbelastung (Phototoxizität) wäre dann geringer und unerwünschte Überstrahlungen einzelner Emissionen, wie beispielsweise die des Chlorophylls, ließen sich gezielt unterdrücken.
Thilo Bauer der diese Doppelfärbung anwendet, nutzt zu diesem Zweck einen speziellen Triple-Band-Filtersatz vom Typ F66-412 (Semrock).
Die einzelnen Banden dieses Filters liegen dabei hinreichend günstig um bei einer Anregung durch eine 385nm LED die gewünschten Emissionen des AO und Hoechst33342 durchzulassen und gleichzeitig auch die Autofluoreszenz des Chlorophylls etwas zu dämpfen.
Bestimmte Farbstoffkombinationen, deren Anregungsbereiche sich nicht so günstig überlappen, lassen sich aber überhaupt nur dann simulten abbilden, wenn sie über verschiedene weit auseinander liegende Kanäle angeregt werden.
Dazu würde ich mir gerne einen Aufbau "zusammenfrickeln" der es ermöglicht einzelne LED's gezielt vorzufiltern und damit dann zeitgleich, den mit zwei (ggf auch drei) Farbstoffen angefärbten Organismus, zu bestrahlen.
Folgende Rahmenbedingungen wären dabei wichtig bzw stehen mir dazu zur Verfügung:
1. Als Stativ nutze ich ein altes Zeiss-WL mit Auflichtkondensor. Ein Foto meiner eigenwilligen Konstruktion findest du am Anfang dieses Beitrags. Neben dem dort abgebildeten einfachen Auflichtkondensor, habe ich auch noch eine köhlerbare Variante des Auflichtkondensors. Die Filterkombination aus Emissionsfilter. Strahlteiler und Sperrfilter sind in diesen alten Versionen der Auflichtkondensoren nicht fest in einem Würfel verbaut, sondern lassen sich frei und unabhängig voneinander, wie auf einer optischen Bank, austauschen. Auch innerhalb von Sekunden im laufendem Betrieb während einer Aufnahme. Es lassen sich prinzipiell alle auf dem Markt befindlichen Planglasfilter in Größen von 18mm bis 32mm in diesen Aufbau integrieren. Auch ein Dichroit lässt sich ab einer lichten Größe von 18mm in einen leeren Einschob montieren und in den Strahlengang bringen.
2.Die Aufnahme erfolgt mit einer einfachen Consumer Kamera (Sony a6500) mit Bayer Sensor. Eine zeitlich versetzte Aufnahme der einzelnen Farbkanäle mittels spezieller monochromer Kamera kommt leider nicht in Frage da es sich um Videoaufnahmen handelt. Eine zeitgleich Aufnahme zweier Farbkanäle, mit zwei monochromen Kameras, wäre natürlich was die Empfindlichkeit angeht, ein riesen Vorteil, sprengt aber meinen finanziellen Rahmen.
3.Ich verfüge über verschiedene LED-Einschübe, die ich frei mit den derzeit auf dem Markt befindlichen LED Varianten bestücken kann. Damit kann ich in gewissen Grenzen je nach spektraler Verteilung der LED die Anforderungen an die Güte der Filter beeinflussen. (Siehe Überschrift des Beitrags).
Als Kollimatoroptik stehen mir die Leuchtrohre der sogenannten Leuchte 15 aus der Zeiss-Standard Reihe zur Verfügung:
IMG_20250120_230929.jpg
(*edit: Neues Foto, diesmal mit korrektem Winkel des Dichroid zur Strahlvereinigung)
Ich habe da auch welche übrig, um sie beispielsweise im rechten Winkel zueinander anzuordnen um über einen Dichroid (alternativ auch ein Teilerspiegel oder Teilerprisma) zwei verschiedene Anregungsbänder zu vereinigen. Ich hab das auf den Foto mal so angedeutet.
4. Als Optik stehen mir lichtstarke endlich Fluorid Objektive von Nikon die speziell für Fluoreszenzanwendungen gebaut wurden zur Verfügung:
10/0.5
20/0.75
40/0.85
40/1.15 WI
40/1.4Öl
Jetzt zu meiner eigentlichen Frage:
Denkst du mein geplanter Aufbau bringt den gewünschten Mehrwert?
Und falls ja, worauf sollte ich achten.
Wäre hier ein Aufbau mit Lichtleiter oder eher mit Dichroid wie in dem beschrifteten Foto von Vorteil?
Über eine Einschätzung/Tips von deiner Seite würde ich mich sehr freuen.
LG Holger
Hier die "aufgesetzte Version" mit einem 2-mm-Lichtleiter:
IMG_2351[1].JPG
Man kann diese Version natürlich auch chic in einem mini-ITX-Computergehäuse verpacken und damit auch das Netzteil, die Gehäuselüfter und das Gehäuse selbst als Kühlkörper für die Konstantstromtreiber nutzen:
IMG_2355.JPG
Hier der 4-fach-LED-Chip auf Star:
IMG_2359.JPG
Die Auskopplung des Lichtleiters per f=30mm-Achromat zur Kollimation und einem ein- bzw. ausklappbaren Neutralgraufilter ...
IMG_2356.JPG
... und so gehts hinter der Leuchtfeldblende via Tubus weiter, um das Bild des Lichtleiteraustritts per 120mm-Linse in 4-facher Vergrößerung in die back focal plane des Objektivs zu fokussieren (hier meist ein 40x/1.3 oder ein 63x/1.4-Ölimmersionsobjektiv).
IMG_2353.JPG
Und zum Abschluss noch Strahlvereinigungs-Varianten mit dichroitischen Spiegeln.
Hier eine ziemlich windschief hingefrickelte Variante (meine lieben Mitarbeiter gehen manchmal recht achtlos mit den Dingen um!) auf Industrieprofil-Basis mit einem 3-mm-Lichtleiter:
IMG_2349.JPG
Hier eine Variante auf einem sub-Breadboard, momentan nur mit 2 LED bestückt, könnte aber bis zu 4 Stück aufnehmen:
IMG_2362.JPG
Und wer immer noch nicht genug haben mag, für den hier noch der aktuelle TIRF-Overkill mit zusatz-Breadboard für lokalisierte UV-Anregung oder zur Einkopplung eines Kyocera-SLD-Chips (die Rail mit massivem CPU-Kühler an deren Ende):
IMG_2357.JPG
Zitat von: Spectrum in Januar 20, 2025, 09:39:49 VORMITTAGMein Ziel ist es die Zellorganellen lebender Einzellern simultan mit Fluorochromen wie Acridinorange, Hoechst33342, Rhodamin 6G/ Rhodamin123 etc. anzufärben um im Anschluss dann Videoaufnahmen dieser Organismen zu erstellen auf denen alle angefärbten Organellen gleichzeitig zu sehen sind.
So wie in diesem Beitrag hier:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=50504.msg368870#msg368870
In diesem konkreten Beispiel wurde mit Acridinorange und Hoechst33342 gefärbt, angeregt wurde mit UV ...
Thilo Bauer der diese Doppelfärbung anwendet, nutzt zu diesem Zweck einen speziellen Triple-Band-Filtersatz vom Typ F66-412 (Semrock).
Die einzelnen Banden dieses Filters liegen dabei hinreichend günstig um bei einer Anregung durch eine 385nm LED die gewünschten Emissionen des AO und Hoechst33342 durchzulassen und gleichzeitig auch die Autofluoreszenz des Chlorophylls etwas zu dämpfen.
Wenn die Färbung so balanciert ist, dass man mit einer einzigen UV-Anregung und einer einzigen Belichtungszeit alle Emissionsbänder hinreichend gut abfotografieren bzw. im Video einfangen kann, dann ist das natürlich eine "einfache" Option, die ohne komplexe Vereinigung auskommt.
ZitatBestimmte Farbstoffkombinationen, deren Anregungsbereiche sich nicht so günstig überlappen, lassen sich aber überhaupt nur dann simulten abbilden, wenn sie über verschiedene weit auseinander liegende Kanäle angeregt werden.
Dazu würde ich mir gerne einen Aufbau "zusammenfrickeln" der es ermöglicht einzelne LED's gezielt vorzufiltern und damit dann zeitgleich, den mit zwei (ggf auch drei) Farbstoffen angefärbten Organismus, zu bestrahlen.
Das leuchtet ein.
ZitatEine zeitlich versetzte Aufnahme der einzelnen Farbkanäle mittels spezieller monochromer Kamera kommt leider nicht in Frage ...
Denkst du mein geplanter Aufbau bringt den gewünschten Mehrwert? Und falls ja, worauf sollte ich achten.
Wäre hier ein Aufbau mit Lichtleiter oder eher mit Dichroid wie in dem beschrifteten Foto von Vorteil?
Das kann durchaus funktionieren. Bei der Freistrahl-Variante müsstest Du nur noch sicherstellen, dass der zusätzliche Raum, den die Halterung eines weiteren Dichroiten einnehmen würde, nicht zu einer massiven Beeinträchtigung des Strahlenganges führen sollte. Die Positionen der entsprechenden konjugierten Ebenen (der ziemlich festen focal plane FP bzw. FP* bzw. der je nach Objektiv etwas variable back focal plane BFP bzw. BFP*) sollten Dir klar sein. Wo diese liegen, ist gar nicht so schwer zu bestimmen, wenn Du z.B. einen feinen Schraubendreher oder Pinzettenspitzen in den Anregungsstrahlengang hältst und mit einem fluoreszierenden Sample im Okular bzw. auf der Kamera betrachtest, in welcher Position gehalten deren Abbildung scharf wird. Das ist dann die FP*. Wenn Du hingegen das Sample herausnimmst und das Anregungslicht an der Raumdecke oder umgespiegelt an einer Wand betrachtest und dort die scharfe Abbildung der LED oder einer in den Strahlengang gehaltenen Pinzettenspitze siehst, dann ist dort die BFP*. Der LED-die oder ein Lichtleiteraustritt sollte in der BFP* liegen, die FP* sollte um die Brennweite der Kollimationslinse vor jener liegen, zumindest aber nicht sehr weit davon entfernt und keinesfalls auf einer Filterfläche, da dann jedes Staubkorn scharf abgebildet in der Probe schattierend wirkt.
Wenn also die konjugierten Ebenen gut im Griff sind und Du dennoch den Platz für einen im Freistrahl verbauten Dichroiten hast, dann ist das für die Einkopplungs-Effizienz allemal besser. Denke auch daran, dass die Kollimations- und Refokussierungs-Linsen geeignete Brennweitenverhältnisse aufweisen, so dass die LED-dies passend vergrößert in die BFP Deiner sehr schön hellen Objektive projeziert werden. Das 40x/0.85 hat dabei den kleinsten BFP-Durchmesser von ca. 7 mm. Das 10x/0.5 den größten mit ca. 16 mm. Damit das gesamte Sehfeld ausgeleuchtet wird, sollte die Re-Fokussierung im Auflichtkondensor mit einer NA von ca. 0,06-0,07 geschehen. Steht eine asphärische Kondensorlinse hoher NA zur Verfügung (z.B. NA=0,7), dann empfiehlt sich bei einer 1-mm-LED eine ca. 8- bis 10-fache Vergrößerung bei der Abbildung der Lichtquellen auf die BFP der meist genutzten Objektive. Wird ein Lichtleiter genutzt, dann muss die Projektion entsprechend des Durchmessers dieses Lichtleiters angepasst werden (z.B. 3,3-fach bei 3-mm-Lichtleiter) und die kollimierende Linse muss nur noch eine NA von ca. 3,3 x 0,06 = 0,2 aufweisen.
Eine Einkopplung über Lichtleiter ist natürlich was den Austausch der LED angeht wesentlich bequemer, da man dann nicht immer wieder am Auflichtkondensor nachjustieren muss. Die Einkopplung in den Lichtleiter sollte mit einer NA geschehen, die man an dessen Austritt wiederfinden möchte. Gleichzeitig haben die Lichtleiter ihrerseits auch eine begrenzte NA-Akzeptanz. Ein "under-fill" ist dabei etwas weniger Intensitäts-schädlich, als ein "over-fill". Als erste Orientierung kann man eine NA knapp unter der maximalen Akzeptanz wählen, damit liegt man nie ganz verkehrt. Lichtleiter mit größeren Durchmessern sind in der Regel Flüssigkeits-gefüllte Lichtleiter und im Neukauf von z.B. Lumatec nicht billig (ca. 300-600 €). Mit etwas Glück kann man so etwas auch mal zum Schnäppchenpreis bei Ebay angeln.
Ok,
Das ist ja mal eine große Hilfe was meine Pläne angeht. Vor allem deine praktischen Tips um die konjugierten Ebenen in den Griff zu bekommen sind wohl Gold wert. Dazu hätte ich dann auch gleich wieder ein paar Fragen an dich:
Wenn ich mir meine Leuchtrohre 15 und meine verschiedenen Auflichtkondensoren so anschaue, dann beobachte ich das das Leuchtrohr bei eingeschobener LED diese in ein paar Metern scharf und vergrößert auf der gegenüberliegenden Wand abbildet. Man erkennt den Umriss und die Struktur des Emitters:IMG_20250120_115753.jpg
Es scheint also eine Kollektoroptik mit großer Brennweite zu sein welches die Lichtquelle in großer Entfernung nahe Unendlich abbildet. Durch geringes Vor und zurückschieben des LED-Einschubs um wenige mm kann eine Abbildung von hyperfokal bis über unendlich hinaus erreicht werden. Dieses Strahlenbündel wird dann zunächst ohne weitere Linsen in den Kondensor eingespeist.
Sehe ich das richtig das dieses nahezu parallele Strahlenbündel eine gute Möglichkeit bietet hier einen Dichroid zur Strahlvereinigung einzubringen, ohne das die besagten konjugiertn Ebenen trotz zusätzlicher Weglängen, allzusehr von der ursprünglichen von Zeiss vorgesehenen Stelle abweichen?
Die eigentliche Kondensoroptik folgt dann erst später im Gehäuse des Auflichtkondensors.
Ich habe dazu drei verschiedene Varianten:
1.Diese einfachste Form des Auflichtkondenssors besteht aus einer einfachen auf Beleuchtungsseite mattiert Asphäre, diese befindet sich auf einem Schieber der in den Strahlengang eingeschoben wird. Die hintere Brennebene wird damit diffus ausgeleuchtet:
IMG_20250120_124922.jpgIMG_20250120_125148.jpg
Weitere Optik ist in diesem Kondensor nicht verbaut.
2. Köhlerbarer Auflichtkondensor mit Leuchtfeld und Aperturblende.
Dieser besitzt eine erste Linse direkt nach dem Leuchtrohr, in dem gewinkelten Ansatzstück, sowie weitere einschiebbare Linsen um unterschiedliche hintere Brennebenen auszuleuchten:
IMG_20250120_130219.jpgIMG_20250120_130629.jpgIMG_20250120_130701.jpgIMG_20250120_130544.jpg
3. Die dritte Variante ist eigentlich für das Universal/Phomi gedacht und erst nachträglich für das WL "passend gemacht" worden.
Auch hier gibt es eine zusätzliche Linse die für bestimmte Objektive eingeschoben werden kann, ausserdem eine zentrierbare Blende. Die eigentliche Kondensoroptik ist ebenfalls klar:
20250120_111626.jpg20250120_111731.jpg20250120_111712.jpg
Was ich leider nicht so genau weiß, ist ob der Beleuchtungsstrahlengang der am Universal/ Phomi austritt dieselben Charakteristika hat wie der Beleuchtungsstrahlengang am WL.
Vielleicht weiß ja einer der Zeiss West-Kenner etwas zu dem Thema...
Grüße Holger
Ach und noch was, lieber Michael:
Deine Aufbauten sind ja der absolute Wahnsinn!
Das mußte ich mir heute morgen erstmal genüsslich zu Gemüte führen.
Absolut beeindruckend!
Steht da TTL auf dem Controller...?
Und für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?
Neugierige Grüße Holger
Hallo Holger,
die Lichtwege der Auflichtansätze mit Köhlerbeleuchtung dürften bei den Modellen Standard WL und Phomi/Universal gleich sein.
Herzliche Grüße
Christoph
Hallo Christoph,
Danke für deine Antwort.
Der vordere Teil beider köhlerbarer Auflichtkondensatoren sieht auch baugleich aus, aber bei dem Auflichtkondensor der umgebauten Universal/Phomi-Teil (3.) fehlt die Leuchtfeldblende und auch die Linse die in dem gewinkelten Ansatz des köhlerbaren Auflichtkondensor (2.) sitzt (siehe Katzenbild) fehlt.
Sind diese Teile eventuell im Inneren der Universal/Phomis verbaut?
Ich werde heute Abend nach der Arbeit mal mit einem Leuchtrohr+LED testen. Wie es geht hat mir Michael ja schon geschrieben:
Zitat:"Ob man den Fokus in die back focal plane geschafft hat, wird erkennbar, indem man das Anregungslicht an der Zimmerdecke ("quasi-unendlich") betrachtet und dort die Struktur des LED-die gut erkennt."
Dann sehe ich auch ob ein Abstand von ein paar cm die Abbildung an der Decke verändert...
Versuch macht klug...
LG Holger
Zitat von: Spectrum in Januar 20, 2025, 12:22:00 NACHMITTAGSDas ist ja mal eine große Hilfe was meine Pläne angeht. Vor allem deine praktischen Tips um die konjugierten Ebenen in den Griff zu bekommen sind wohl Gold wert. Dazu hätte ich dann auch gleich wieder ein paar Fragen an dich:
Wenn ich mir meine Leuchtrohre 15 und meine verschiedenen Auflichtkondensoren so anschaue, dann beobachte ich das das Leuchtrohr bei eingeschobener LED diese in ein paar Metern scharf und vergrößert auf der gegenüberliegenden Wand abbildet. Man erkennt den Umriss und die Struktur des Emitters:IMG_20250120_115753.jpg
Es scheint also eine Kollektoroptik mit großer Brennweite zu sein welches die Lichtquelle in großer Entfernung nahe Unendlich abbildet.
Grob-inhltlich stimme ich Dir zu: die Kollimation ist recht gut gelungen. Die Brennweite der Kollimations-Optik wird jedoch nicht notwendigerweise groß sein, sondern zum Abstand der LED von der Kollimationsoptik passend, so dass die Projektion einer nah an der Optik positionierten Lichtquelle an die Zimmerwand gelingt.
ZitatSehe ich das richtig das dieses nahezu parallele Strahlenbündel eine gute Möglichkeit bietet hier einen Dichroid zur Strahlvereinigung einzubringen, ohne das die besagten konjugiertn Ebenen trotz zusätzlicher Weglängen, allzusehr von der ursprünglichen von Zeiss vorgesehenen Stelle abweichen?
Ja, die Schlussfolgerung ist zutreffend, da Du Dich dort im "quasi-unendlich-Raum befindest" und für einen Dichroiten zusätzlich eingebrachte Distanzen von 3-5 cm eine relativ geringe Auswirkung auf die Strahlführung haben werden. Der Dichroit selbst sollte natürlich geegenüber https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=370516 um 90° gedreht positioniert werden, so dass nicht die eine Lichtquelle in die andere scheint. ;-)
Zitat von: Spectrum in Januar 20, 2025, 14:40:01 NACHMITTAGSSteht da TTL auf dem Controller...?
Und für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?
Zu a) TTL: ja, das steht TTL aber bitte die Abkürzung TTL="transistor-transistor logic" nicht mit TTL="through the lens" verwechseln. in meiner Vorrichtung ist die transistor-transistor logic gemeint und nicht eine Belichtungsautomatik seitens der Kamera.
ZitatUnd für welchen Eisatzzweck genau werden diese Anlagen gebaut?
Insgesamt betreiben wir fast ausschließlich Lebendzellmikroskopie an Zellkulturen oder isolierten Zellverbünden bzw. Gewebeschnitten. Die Einsatzgebiete sind sehr unterschiedlich und reichen von der visuellen Beurteilung einer zellulären Fluoreszenz über quantitative Analysen der Einzelzell-Signale bis hin zu subzellulären Auflösungen schneller intrazellulärer Signalprozesse oder der Einzelmolekül-Spektroskopie.
Dies mit Amateur-haften DIY-Aufbauten zu vergleichen, wäre unfair, da wir bei Filtern, Objektiven und insbesondere bei den Kameras im obersten Segment unterwegs sein dürfen. Bei den Fluoreszenz-Anregungen hingegen sind die meisten unserer Aufbauten im low-cost-Bereich angesiedelt und mit etwas technischem Verständnis auch durch interessierte Laien realisierbar. Ja, wir haben und nutzen auch kommerzielle Lichtquellen wie Lumencor Sola, Spectra oder Celesta (Preissegmente zwischen 8.000 und 42.000 €), aber bei bestimmten Wellenlängen sind LED im Preissegment von 3-30 € in keinster Weise unterlegen. Dies in größerer Breite nutzbar zu machen, sollte IMO hier das Ziel sein.
Zitat von: MS19 in Januar 20, 2025, 20:32:30 NACHMITTAGSDer Dichroit selbst sollte natürlich geegenüber https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=370516 um 90° gedreht positioniert werden, so dass nicht die eine Lichtquelle in die andere scheint. ;-)
Da hast du natürlich vollkommen recht, hab ich beim Erstellen der Bildbeschriftung vermasselt, und nicht bemerkt. Ich hab's inzwischen korrigiert. Sorry
Hier meine ersten Versuche mit meinen zwei köhlerbaren Kondensoren.
Der Auflichtkondensor wirft dabei auf Anhieb ein Abbild des LED-Emitters an die Zimmerdecke, die Variante für das Phomi jedoch nicht:
IMG_20250121_191234.jpg
Halte ich den Ansatz mit der Feldlinse in einigen Zentimeter Abstand davor so wie hier:
IMG_20250121_191110.jpg
Dann funktioniert es auch mit dieser Variante:
IMG_20250121_191338.jpg
Genug Raum um einen Dichroit unterzubringen scheint vorhanden zu sein...
Das schaue ich mir aber nochmal in Ruhe an. Dank Michael weiß ich ja jetzt welche Bedingungen erfüllt sein müssen.🙂
(Meine vorherige Aussage was die Brennweite der Kollektoroptik anging bezieht sich nicht auf die Abbildung nahe Unendlich, sondern darauf das das Abbild der LED relativ zur Entfernung nicht allzusehr vergrößert wird, also geringer Bildwinkel bzw. relativ große Brennweite der Kollektoroptik im Leuchtrohr. So war's gemeint.)
Sieht alles bisher so aus als ob das Vorhaben umsetzbar ist. Dann bräuchte ich nur noch einen Würfel mit dem ich die zwei Leuchtrohre im rechten Winkel einschrauben kann mit einer Aufnahme für den Strahlteiler.
Hm...
Danke
Holger
Eine erstaunlich aufwändige mächtige Arbeit, um an einige Anregungs-Wellenlängen-(Bereiche) für die Fluoreszenz zu kommen...
Mit einem anderen Ansatz könnte man das einfacher haben: Man nehme einen Breitbandstrahler (Xenon) und einen Monochromator zur Wellenlängenwahl. Mit 2 oder 3 Austrittsspalten kann man auch 2 oder 3 Wellenlängen simultan erhalten. Die Licht-Weiterleitung und Querschnittswandlung kann über Quarz-Lichtleitfasern (UV-Bereich) erfolgen. Damit entfallen auch die vielen teuren Farbteiler und die Konstruktion wird einfacher.
Das soll keine Kritik sein, nur eine Anregung - Werner
Hallo Werner,
Danke für den Hinweis auf den Monochromator.
Mit denen liebäugel ich auch schon eine ganze Weile...
Ich befürchte aber das dieser Lösungsansatz zwar superflexibel ist, was die Wahlmöglichkeit der Wellenlänge angeht (großer Pluspunkt).
Was die reine Lichtleistung angeht, dürfte der Monochromator aber selbst bei einer sehr starken Weißlichtquelle nicht mit einer guten LED/Filterkombination mithalten können (behaupte ich mal).
Und die ist, wenn man filmen will, oder Bewegungsunschärfe bei Fotos vermeiden will, allerhöchstens noch durch Apertur und/oder Kameraempfindlichkeit zu ersetzen.
Zum austüfteln der besten Filterkombination für ein bestimmtes Fluochrom ist so ein Monochromator aber bestimmt super. Ein zweiter Monochromator als Sperrfilter noch besser.
Aber das sind alles nur Vermutungen.
Vergleichsbilder zwischen einer Monochromator- und einer Interferenzfilterlösung im direkten Vergleich wären echt mal interessant...
Grüße Holger
Beitrag gelöscht, da im falschen Faden gepostet.
@Holger:
Die Lichtstärke von UV-Monochromatoren hängt von Spiegelgröße ab. Ein Taschenmonochromator kann da nicht viel liefern.
Vor 50 Jahren gab es mal bei Perkin-Elmer Fluoreszenzgeräte für 10-mm-Küvetten in groß und teuer und in einfach. Lichtquelle jeweils 150-W-Xenon. Die einfachen waren nur etwa 30x30x25 cm groß und hatten doch zwei motorgetriebene Monochromatoren (Excitation und Emission) und waren doch narrisch hell. Die Spektralauflösung mit 2-10 nm reicht für die doch breiten Banden in Lösung.
Heute könnte man die noch einfacher und lichtstärker bauen, weil es Konkavgitter gibt, die keine weiteren Hohlspiegel brauchen. In kleiner gibt es komplette Geräte als HPLC-Detektoren.
Gruß - Werner
@Werner,
Deine "Anregung" (im wahrsten Sinne des Wortes) in Bezug auf die Benutzung eines Monochromators um verschiedene Wellenlängenbereiche abzugreifen hat ja, zumindest auf den ersten Blick, wirklich einiges für sich. Es müsste sogar möglich sein, nicht nur verschiedene Wellenlängenbereiche simultan für die Anregung abzugreifen (vorausgesetzt die Spaltblenden liegen weit genug auseinander um die zwei Lichtbündel dann auch effizient "einfangen" zu können).
In der Theorie könnte man darüberhinaus sogar über die Breite des Spaltes die Bandbreite des Anregungslichts anpassen...
Das klingt zumindest in der Theorie ja wirklich toll.
Trotzdem werden, soweit ich weiß für die klassische Fluoreszensmikroskopie (Auflicht/Weitfeld) wohl fast immer Interferenzfilter genutzt.
Auch die professionellen Aufbauten die Michael hier gezeigt hat, nutzen alle Interferenzfilter.
Ich frage mich ob es dafür (abgesehen vom viel einfacheren handling) auch noch weitere Gründe gibt...🤔
Kennt denn jemand einen Aufbau der für ein *bildgebendes* System einen solchen Monochromator einsetzt?
Ich kenne das eigentlich nur für Photometrische Messverfahren.
Inspirierte Grüße Holger
Zitat von: Spectrum in Januar 24, 2025, 12:20:08 NACHMITTAGSAuch die professionellen Aufbauten die Michael hier gezeigt hat, nutzen alle Interferenzfilter. Ich frage mich ob es dafür (abgesehen vom viel einfacheren handling) auch noch weitere Gründe gibt...🤔
Kennt denn jemand einen Aufbau der für ein *bildgebendes* System einen solchen Monochromator einsetzt?
Aber klar doch!
Der bekannteste Hersteller solcher Anregungs-Lichtquellen war TILL Photonics mit dem umtriebigen Münchner Biologen und Erfinder Prof. Rainer Uhl als Gründervater und Ideengeber. Die Geräte hießen "Polychrome" und kamen in 5 Generationen auf den Markt, von denen ich Generation 1, 2, 4 und 5 kenne und nutz(t)e. Der Gag bei diesen Geräten lag in der ultraschnellen Wellenlängen-Wahl durch Montage des diffraktiven Gitters auf einem galvanometrischen Scanner, der einen Ansprung jeglicher Wellenlänge zwischen ca. 320 nm und 680 nm innerhalb 2-4 ms erlaubte bzw. durch Anspringen von 280 nm eine "pseudo-Shutter-Funktion" aufwies. Die jüngsten Generationen Poly IV und Poly V arbeiteten mit 150 W Xenon-Kurzbogenlampen, die älteren mit 75 W Xenonlampen.
Warum schreibe ich das alles in Vergangenheitsform? Die Firma wurde 2008 verkauft und die Produktlinie durch die neuen Besitzer quasi instantan eingestellt. Das war´s dann leider ...
Zur Idealzeit hatten wir 5 dieser Systeme (unterschiedlicher Generationen) parallel in Betrieb, doch mit der Zeit legte der Elektronik-Tod eine nach der anderen Einheit lahm, so dass wir aktuell nur noch zwei regelhaft arbeitende Systeme und einen mit Analogansteuerung am Leben erhaltenen Monochromator weiterbetreiben können. Für die quantifizierende Mikroskopie haben die Systeme einen eklatanten Vorteil gegenüber DIY-LED-Anregungen: die Wellenlängen und Intensitäten sind extrem stabil und über Monate hinweg reproduzierbar, so dass bei zellbiologischen Untersuchungen kalibrierte Ca2+-Konzentrationsbestimmungen, genaue Bestimmungen von FRET (Förster-Resonanz-Energietransfer), mathematische Trennung spektral überlappender Floreszenzsignale, ... damit sehr gut möglich sind. Zudem nutzen wir in manchen Fällen die Möglichkeit des Aufzeichnens kompletter Anregungsspektren.
Diese Systeme sind schnell im Umschalten, hinken aber in der Lichtintensität meilenweit hinter den aktuelleren LED- bzw. remote Phosphor- oder Laser-gestützten Lichtquellen hinterher. Wenn man ein System mit verstellbarem Spalt hat, kann man auf Kosten der spektralen Definition etwas mehr Power herausholen, aber für Videos mit einer Consumer-Kamera müssten die Proben schon hervorragend hell gefärbt sein. Für Doppelanregungen mit zwei Wellenlängen waren sie zumindest im Standard-Aufbau nicht vorgesehen.
Werner schreibt zu recht, dass es auf die Spiegelgröße - genauer die NA - des Monochromators und der Einkopplung in diesen ankommt, wie viel Licht an dessen Austrittsspalt ankommt. Das ist natürlich korrekt und mag bei den Polychromen nicht maximal ausgenutzt worden sein, auch wenn die Czerny-Turner-Optik der Geräte beileibe nicht miniaturisiert ist. Ein Leistungsverlust dürfte bei den TILL Photonics-Geräten dadurch begründet sein, dass nicht die gesamte Höhe des am Ausstritt ankommenden "Regenbogenstreifen" genutzt wird, sondern nur der Anteil, der in den bei diesen Geräten recht dünnen Lichtleiter fällt. Berechnet waren die Lichtleiterdurchmesser und die NA der Einkopplung für die Ausleuchtung des Sehfeld-Anteils einer 40x/1.3-Optik, welcher durch die 2/3"-interline-CCD-Kameras (TILL Imago = PCO Sensicam) aufgezeichnet wird.
In der praktischen Nutzung haben wir, um mit dem Monochromator auch Anregungswellenlängen von 20-30 nm unter der Öffnung des Emissionsfilters noch ausnutzen zu können, trotzdem zusätzlich noch ein Kurzpass-Anregungsfilter (z.B. 500 nm short pass) eingebracht, damit der Hintergrund auch wirklich schwarz bleibt.
Hallo,
Auf deine Expertiese lieber Michael, hab ich gewartet. Das ist das tolle hier in diesem Forum!
Geballtes Fachwissen und gegenseitige Hilfe, super.
Dann weiß ich ja jetzt wo da der Haken ist.
Trotzdem sehr interessanter Ansatz.
Vielen Dank Werner und Michael.
Bei der Gelegenheit hätte ich natürlich auch gleich erneut die nächste Frage zum Thema Effizienz von LED's.
Wie sieht es da in den Bereichen außerhalb des sichtbaren Spektrums aus?
Zum einen im Bereich von 250-400nm und dann auch bei 950nm.
Sind da die klassischen Lichtquellen im Vergleich doch noch unter gewissen Vorraussetzungen im Vorteil (Stichwort Hg-Linie z.b.)?
Grüße Holger
Zitat von: Spectrum in Januar 24, 2025, 19:59:22 NACHMITTAGSWie sieht es da in den Bereichen außerhalb des sichtbaren Spektrums aus? Zum einen im Bereich von 250-400nm und dann auch bei 950nm.
Unterhalb 350 nm gibt es nur noch Spezielobjektive, die dann noch eine gute Transmission zeigen. Fluare gehen typischerweise noch bis ca. 330 nm herunter, dann aber ist auch damit ein Ende. Im Infrarot-Bereich ist die Transmission meist nicht so abrupt endend, so dass hier einige Objektive noch gut weiterarbeiten, insbesondere dann, wenn sie auch für die 2-Photonen-Mikroskopie optimiert sind. Wer im UV-B oder gar im UV-C-Bereich anregen will, tut dies besser mit einer externen Lichtquelle, die nicht über das Objektiv eingekoppelt wird. Im Infrarot-Bereich kommt es auf einen Versuch an, was dort noch erreichbar sein mag. Oft sind die Objektive dabei weniger limitierend, als die digitalen Kameras, die ohne einen speziellen Umbau typischerweise mit einem Infrarot-Sperrfilter ausgestattet sind.
Ok, die Limitierung durch die Objektive im unteren UV-B und UV-C Bereich ist klar. Da braucht man dann spezielle Optiken z.b. aus Quarzglas. Ich glaube bei Zeiss gab es auch spezielle Ultrafluare für diesen Zweck.
Zitat von: MS19 in Januar 24, 2025, 20:07:39 NACHMITTAGSWer im UV-B oder gar im UV-C-Bereich anregen will, tut dies besser mit einer externen Lichtquelle, die nicht über das Objektiv eingekoppelt wird.
Wie sieht denn da die Umsetzung konkret aus? Durchlicht mit Quarzkondensoren, bzw. mit einem zweiten Spezialobjektiv als Kondensoroptik?
Aber zurück zu meiner eigentlichen Frage. Ganz konkret.
Wie verhält sich beispielsweise eine Nichia 3Watt LED im Vergleich zu einer klassischen Quecksilberdampflampe?
Ist eine LED selbst da noch überlegen?
Viele Filterwürfel und die darin befindlichen Filter sind ja häufig auch immer noch auf die typischen Linien der alten Beleuchtungen ausgerichtet (365nm, 386nm)
Grüße Holger
Was meine konkrete Fragestellung für den IR Bereich bei 950nm angeht, weiß ich, daß ich da um einen Kamera Umbau oder eine Industriekamera nicht herumkomme. Aber was ich nicht genau weiß, ist ob ich was die Beleuchtung angeht besser mit einer Halogenleuchte und passendem Filter bedient bin, oder ob sich die Adaption einer 3Watt IR LED (Oslon Black) lohnen würde. Laut Datenblatt hätte die eine "radient Intensity" von 1340mW unter Vollast , wobei der Strahlwinkel und die Emittergröße gut zu meiner Beleuchtungsoptik passen würden.
Aber da schweife ich jetzt auch schon vom ursprünglichen Thema dieses Fadens ab. Ich würde damit gerne den Chitinpanzer von Insekten durchleuchten. Wäre toll wenn da auch für Filmaufnahmen genug Leistung ankommt.
Aber das hat nichts mit Fluoreszenz zu tun.
LG Holger
Hallo in die Runde,
danke auch für die interessante Diskussion. Ich beschäftige mich nicht so wirklich mit biologischen Proben und Fluoreszenz, habe aber an meinen Hobby-Mikroskopen (Leica DMI6000, Leica DM6000) einige Filterwürfel und zwei Spezial-Lichtquellen. Eine Schott-HXP120 und eine Andor AMH-200-F0/6S, mit 200W Metal-Halide-Lampe. Die Andor-Quelle hat gleich 4 schnell schaltbare Filter eingebaut und auch einen Lumatec Flüssiglichtleiter. Die ist schon ziemlich hell und war ursprünglich bei einem Andor Revolution DSD2 Confocal-Modul dabei. Leider hat die DSD2 den Transport aus den USA nicht überlebt, die Spinning-Disk-Scheibe war leider zerbrochen. Die DSD2 hat die zur Andor-Quelle passenden 3 Fluoreszenzfilterwürfel eingebaut. Vielleicht hast du, Michael, diesbezüglich auch ein paar Tipps oder Erfahrungen.
Aber natürlich soll der Faden nicht gekapert werden.
Lg Tino
Zitat von: Spectrum in Januar 24, 2025, 20:40:39 NACHMITTAGSWie sieht denn da die Umsetzung konkret aus? Durchlicht mit Quarzkondensoren, bzw. mit einem zweiten Spezialobjektiv als Kondensoroptik?
Ja, so oder mit schräger Beleuchtung (zur Fluoreszenzanregung) würde ich es versuchen. Durchlicht im eigentlichen Sinn würde natürlich ein von Dir bereits erwähntes Ultrafluar erfordern. Bei Fluoreszenz hätte man ja die längerwellige Emission, die dann vielleicht auch mit normalen Objektiven eingefangen werden kann. Schräg, um dem Problem der Autofluoreszenz der Gläser aus dem Weg zu gehen.
ZitatWie verhält sich beispielsweise eine Nichia 3Watt LED im Vergleich zu einer klassischen Quecksilberdampflampe?
Ist eine LED selbst da noch überlegen?
Viele Filterwürfel und die darin befindlichen Filter sind ja häufig auch immer noch auf die typischen Linien der alten Beleuchtungen ausgerichtet (365nm, 386nm)
Die Quecksilberdampflampen hatte ich aufgrund der geringen Standzeiten und der für die quantitative Spektroskpie teils ungünstig liegenden Bänder schon herausgeworfen, bevor ich ein ordentliches Powermeter hatte und kann daher keine konkreten Zahlen hierzu liefern. Mal sehen, ob ich einen Brenner samt Vorschaltgerät aus dem Keller hochangeln kann (und will). Irgendwo müsste auch noch eine ältere X-Cite herumstehen, die ich mal bei Ebay geangelt hatte und deren Lumatec-Lichtleiter wir weiterverwenden.
Bei aktuell üblichen 3W-LED liegen die Lichtleistungen in einem mit NA = 0,7 kollimierten Strahl je nach Wellenlänge um ca. 50-600 mW, das ist knapp die Hälfte der nominellen Gesamtleistung eines Lambert´schen emitters (also ohne Halbkugellinse). Nichia habe ich nicht, sondern nur Lumileds (Luxeon Z, Luxeon CZ), LedEngin (LZ4 3 Ampère/10 W high-current RGBW und LZ4 365nm), Osram Ostar Stage 3A RGBW und kürzlich auch Cree XE G (3A) sowie Luminus SST UV-LED.
Einzelbeispiele kollimierter Lichtleistungen mit Konstantstromangaben sind:
540 mW bei Luminus 367 nm (1A)
640 mW bei Luminus 407 nm (1A)
1300 mW bei LedEngin 447 nm (3A)
960 mW bei Cree 470 nm (Blue oder PC Blue; beide 3A)
440 mW bei Cree 495 nm (Cyan; 3A)
270 mW bei Ostar Stage oder LZ4 525 nm (3A)
90 mW bei Luxeon Z 590 nm (Amber; 1A)
ca. 600 mW bei Weiß in LedEngin oder Ostar Stage (3A)
ca. 430 mW im gelben Phosphor-Band einer "fully converted" (RGBY) Ostar Stage (3A)
Zum Vergleich:
- Ein TILL Photonics Poly V bringt am kollimierten Lichtleiter im Peak (470 nm) etwa 12 mW, bei 365 nm gerade mal ca. 3-4 mW.
- Die Light Engines von Lumencor bringen je nach Modell und Version am Lichtleiterausgang gemessene 460-800 mW bei jeder der 7 Wellenlängenbänder der Spectra III (mit Ausnahme der wesentlich schwächeren 348 nm in der "Fura-2-Spezialversion" mit nur ca. 45 mW) oder 650-800 mW bei der Laser-gestützten Celesta.
Wie viel braucht man aber überhaupt?
Wenn Du eine 1 x 1 mm² LED mit NA 0,7 kollimierst, kannst Du sie ca. 10-fach vergrößert in die BFP projezieren und behältst dann immer noch die Ausleuchtung des gesamten Sehfeldes bei. Das bedeutet, dass Du die komplette Lichtleistung in ein 10x/0.5 eingekoppelt bekommst. Bei angenommener 500 mW Lichtleistung und einem 20-mm-Sehfeld sind das in der Fokalebene dann 0,5 W / (Pi * 0,1 cm²) = 15,9 W/cm². Selbst mit einem 20x/0.8 oder einem 40x/1.3, die etwas kleinere BFP-Radien haben, kannst Du noch einen großen Teil der Lichtleistung ausschöpfen und erzielst damit in der Fokusebene entsprechend hohe Lichtleistungen von ca. 60 W/cm² beim 20er oder fast 200 W/cm² beim 40er. In der Lebendzell-Mikroskopie bleichen wir bei 100 W/cm² ein "enhanced green fluorescent protein" innerhalb weniger Sekunden um mehr als 50% weg. Fixierte, mit stabilen Fluorochromen gefärbte und mit Antifade eingedeckelte Proben werden zwar deutlich stabiler sein, aber davon wollen wir a) keine Videos machen und könnten b) für ein Einzelbild auch länger belichten, so dass man die hohen Leistungsdichten ebenfalls nicht benötigt.
Fazit: sauber eingekoppelte LED bringen genug oder mehr als genug Licht für eine Lebendzell-Videomikroskopie in Epifluoreszenz.
Zitat von: TStein in Januar 24, 2025, 21:20:08 NACHMITTAGSVielleicht hast du, Michael, diesbezüglich auch ein paar Tipps oder Erfahrungen.
Leider nein; ein spinning disc confocal hatte ich mir immer gewünscht, ist aber nie wahr geworden. Willst Du das Gerät reparieren? Falls nein: die Lichtquelle sollte aber auch für normale Epifluoreszenz sehr gut geeignet sein!? Ob man hierfür die Filter aus dem Konfokalmodul herausoperieren und weiterverwenden kann, weiß ich leider auch nicht.
Die Andor-Kamera ist ja in jedem Fall sehr gut und könnte direkt ans Mikroskop angesetzt entweder mit Andor Solis oder MicroManager angesteuert werden.
Hallo Michael,
Zitat von: MS19 in Januar 25, 2025, 07:22:01 VORMITTAGWie viel braucht man aber überhaupt?
Das ist wohl die eigentliche Kernfrage bei der ganzen Diskussion.
Meine bisherige Erfahrung hat gezeigt das die Leistung meines eigenwilligen Selbstbaus bis jetzt zumindest ausreichend war.
Was meine Videoaufnahmen lebender Einzeller angeht, hat man es, zumindest bei UV und Blauanregung, sowieso sehr schnell mit der Phototoxizität zu tun.
Das ist in der Regel das größte Problem!Meist schon lange bevor sich Photobleaching bemerkbar macht. Das führt dann dazu das sich die beobachteten Organismen innerhalb kurzer Zeit (wenige Sekunden) unter der Lichteinwirkung regelrecht auflösen. Wie schnell genau hängt dabei offensichtlich von vielen Faktoren ab:
1. Art und Dosierung der Färbung:
Unterschiedliche Fluorophore wirken sich unterschiedlich auf die Lichtempfindlichkeit der gefärbten Einzeller aus. Ich hab da bisher noch nicht allzuviele Vergleichsmöglichkeiten konnte aber soweit schonmal feststellen, daß Acridinorange schneller zu Problemen führt als beispielsweise Rhodamin 6G. Die Dosisierung spielt auch eine große Rolle.
Auch habe ich bei Thilo Bauer gelesen, das es von Vorteil sein soll die Färbung (im konkreten Beispiel ging es auch um Acridinorange) erstenmal über einen längeren Zeitraum einwirken zu lassen. Thilo Bauer beschäftigt sich schon eine ganze Weile mit dieser Art der Lebendfärbung und weiß sicher wovon er da spricht. Dazu habe ich selbst aber noch nicht genug Erfahrungswerte.
2.Die individuelle Fitness:
Ja ganz recht, es ist tatsächlich eindeutig zu beobachten daß Individuen von Paramecium bursaria, die wohlgenährt und agil aus einer gut laufenden Kultur stammen, *deutlich* wiederstandsfähiger sind als Exemplare die schon eine Weile ohne Licht ausharren mussten). Ein fittes Exemplar verträgt z.b. die vollen 3Watt UV Licht über die Kondensorvariante mit Mattglaslinse über einen Zeitraum von 1/2-1min. So sind auch die Aufnahmen in meinem Beitrag entstanden. Dieselbe Kultur stand inklusive den Farbstoffen (Acridinorange+Hoechst33342) für weitere 3Tage im Kühlschrank. Dort haben sie sich sogar geteilt und waren augenscheinlich auch agil. Allerdings hatten sie bereits begonnen ihre endosymbiotischen Algen zu verdauen. Diese Exemplare hielten exakt die gleiche Lichtmenge keine 2Sekunden durch.
3. Die jeweilige Art des Einzellers/Mikroorganismus:
Verschiedene Arten sind sehr unterschiedlich robust, was UV und Blaulicht angeht. Amöben lösen sich schon bei 250-500mA (Stromstärke des Steuergeräts nicht Leistung der kollimierten Lichts!!! Zweiteres kann ich leider nicht messen) nach allerkürzester Zeit auf. "Fitte" Paramecien deutlich länger, und Stentor coeruleus nach meiner Erfahrung noch länge, Bärtierchen ewig, da wäre noch mehr Lichtleistung schon ganz nett, zumindest während der Zeit der der Filmaufnahme.
Damit könnte ich die hohen Isowerte die ich mit meiner Sony benötige etwas reduzieren.
Entsprechende Aufnahmen dazu habe ich übrigens hier auch schon gezeigt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=49992.msg365587#msg365587
Zu meinen Volvox Kolonien kann ich noch nichts verbindliches sagen da muss ich einmal schauen wie lange die pulsierenden Vakuolen und Flagellen unter Lichtbelastung noch funktionieren. Die Einzellzellen desintegrieren auch nach minutenlanger Bestrahlung nicht. Allerdings leidet dann die Autofluoreszenz sichtlich.
Grundsätzlich bin ich aber mit meiner Lösung bisher schon ganz gut aufgestellt, in manchen Situationen stoße ich aber dann doch an Grenzen. Von anderen eventuell noch lichtschwächeren Farbstoffen ganz zu schweigen. Deshalb wäre es von Vorteil in bestimmten Situationen die Lichtleistung für den Zeitraum der Aufnahme noch etwas höher schrauben zu können. Von dem getrennten Anregen über verschiedene Wellenlängen verspreche ich mir *sowohl* hellere Emissionen als auch gleichzeitig *weniger* Lichtbelastung.
Ausserdem werde ich mich in nächster Zeit auch eingehender mit der köhlerbaren Version des Kondensors beschäftigen, da dürfte einiges mehr möglich sein....
Sofern die Phototoxizität mir nicht schon früher einen Strich durch die Rechnung macht.
Danke auch für die konkreten Angaben der gemessenen Lichleistung der kollimierten Lichtquellen Michael, sowas ist besonders aufschlussreich.
Grüße Holger
Hallo Michael,
ich versuche derzeit die Andor-DSD2 zu reparieren. Ist im Grunde keine klassische Confocal Spinning-Disk, mit Nipkow-Scheibe, sondern eher eine etwas komplexere strukturierte Beleuchtung, wie das Zeiss Apotome. Nur dass hier die Strahlengänge aufgeteilt werden, daher sind auch die Fluoreszenzfilterblocks eher speziell. Ein Strahlengang schaut durch die rotierende mit einem groben metallischen Gitter strukturierte Scheibe in Transmission. Der andere Strahlengang tastet die Scheibe in Reflexion ab und beide Strahlengänge werden nebeneinander auf den Kameraport abgebildet. Mit einem bisschen Bildmathematik der beiden Bildhälften, bekommt man dann ein konfokalähnliches Bild. Die Scheibe hat es aber leider beim Transport zerlegt. Ich schaue aber, ob ich eine auf Arbeit herstellen kann. Wohl dem, der in einer Mikrostrukturierungsabteilung arbeitet.
Lg Tino