Hi zusammen,
ich wollte euch ein paar Aufnahmen meiner Epithelzellen aus dem Mundraum zeigen. Die Zellen sind mit Acridinorange gefärbt, und ich habe sie mit einem selbstgebauten Xenon-Brenner sowie einem Zeiss IM35 Mikroskop aufgenommen.
Für die, die mit Acridinorange nicht so vertraut sind: Acridinorange färbt verschiedene Strukturen in unterschiedlichen Farben, was bei der Analyse der Zellen und Bakterien hilfreich ist. In diesen Aufnahmen erscheinen die Zellkerne der Epithelzellen in einem kräftigen Grün, während bakterielle DNA in leuchtendem Orange bis Rot dargestellt wird. So lassen sich die Bakterien deutlich von den Körperzellen abgrenzen.
Zusätzlich habe ich noch eine Hellfeldaufnahme hinzugefügt, um einen besseren Vergleich zu ermöglichen und die Strukturen im Kontext zu sehen.
Ich freue mich auf euer Feedback und vielleicht Tipps zur Optimierung der Aufnahmen!
Liebe Grüße Daniel
Die Bilder sehen doch schon ganz gut aus. Vor allem das letzte Bild. Du hast den Zeiss Filtersatz 09 verwendet, richtig?
Schön schwarzer Hintergrund, wurde das nachträglich bearbeitet? Falls ja, wäre die Originalaufnahme noch interessant, zwecks Tips.
Die roten Punkte auf dem letzten Bild dürften wohl Bakterien sein.
Was die Effizienz angeht dürfte mit 1/4 sec bei Iso8000 eventuell noch etwas Luft nach oben sein. Versuch doch mal anhand einer Probe mit frischem Chlorophyll (Moosblättchen), ob du mit einer Justage der Beleuchtung noch kürzere Belichtungen erreichen kannst.
Was das Acridinorange angeht, kann man die Konzentration hier höher ansetzen als bei lebenden Einzellern. Auch die Einwirkzeit und der ph-Wert spielen beim Ergebnis eine Rolle. Versuch die Färbelösung einmal mit Essigsäure (1%) anzusäuern.
Ebenfalls denkbar wäre bei Buccalzellen auch das Fixieren und Anfärben eines Ausstrichs. Suche im Forum mal nach "Bakterien in der Fluoreszenzfärbung" da beschreibt Ralf Feller so ein Verfahren.
Und bei Blauanregung bin ich persönlich überzeugt, das eine LED Beleuchtung mit einer geeigneten royalblauen LED nochmals eine deutliche Leistungssteigerung bringt. Einen Halter für den Kürbis anzufertigen dürfte relativ einfach umzusetzen sein.
Ansonsten sieht das, wie schon gesagt, ganz ok aus.
Grüße Holger
Der Filter müsste der 9er sein ext.450-490. Das war auf dem inversen da sind die Objektive stellenweise recht dunkel. Am Universal habe ich schon eine neofluar Satz zusammen getragen.
Danke für deine Ideen ☺️
Wo du es gerade ansprichst, das Objektiv wäre auch noch interessant zu erfahren. Das spielt bei der Auflichtfluorestenz nämlich gleich doppelt eine Rolle. Zum einen fungiert es ja als Kondensor und projiziert das Anregungslicht auf die Probe, zum anderen sammelt es das zurückgestrahlte Licht auch wieder ein. Was meinst du mit "dunkel"? Was steht denn genau auf dem für die Aufnahmen verwendeten Objektiv drauf. (am besten machst du mal ein Foto).
Neofluare sind genau die Objektivklasse die Zeiss für die Fluoreszenzmikroskopie vorgesehen hat. Eine gute Wahl, die v.a. auch für den kurzwelligen Bereich besser geeignet sind.
Versuch doch einmal Vergleichsaufnahmen zwischen einem Neofluar und einem der Objektive an dem inversen Stativ zu machen. Natürlich bei gleicher Vergrößerung.
Und wenn du aussagekräftige Tips suchst, solltest du auch die unbearbeiteten Originalbider mit Angabe von ISO und Belichtungszeit einstellen. Sonst wird eine Aussage dazu schwierig.
LG Holger
Hier Mal ein unbearbeitetes bsp. Das objetive ist das speziellem Zeiss West 40 für Petrischalen mit Korrektur ring
Ich seh den Unterschied schon am IM35 da habe ich ein 10 neofluar drauf
Es is t ein Plan 40x60
Ok, das zuletzt gezeigte Bild sieht bis auf die Unterbelichtung schon recht gut aus.
Was mir aufgefallen ist: Es wurde mit 1/20sec aufgenommen, das gleiche Motiv aus der ersten Bilderserie aber mit einer längeren Belichtungszeit von 1/4sec.
Das wäre dann mein nächster Tip. Versuch einmal mit verschiedenen Belichtungszeiten das Bildergebnis zu optimieren. So hell wie möglich belichten ohne das Details überstrahlt werden, ist das Ziel.
Das Automatikprogramm deiner Kamera ist für Fluoreszenzaufnahmen völlig ungeeignet. Stell am besten alles manuell ein. Deine Sony ist wegen ihres guten Rahschverhaltens sehr gut bei hohen ISO Werten nutzbar. ISO 8000 ist da noch völlig ok, je nachdem auch mehr. Aber bei Motiven die sich nicht bewegen ist eine niedrigere ISO doch die bessere Wahl. Bei beweglichen Motiven mußt du dann natürlich doch auch die Belichtungszeit mitbeachten, damit es keine Bewegungsunschärfe gibt.
Bei unbewegten Motiven kannst du aber die Belichtungszeit so lange wählen bis es passt.
Viel Erfolg
* Hast du eigentlich inzwischen mal geschaut ob dein Aufbau tatsächlich auch UV dicht ist? Ich hatte dir ja den Rat mit den photochromen Brillengläsern gegeben. Falls du die nicht verfügbar hast giebt es beim Versandhaus mit "A" auch sogenannte UV-Testkarten/Aufkleber. Ich meine die welche sich lila verfärben.
Kosten <5€. Damit kannst du deine Xenon Lampe und die Stelle an der sich der Objektträger befindet und der Lichtaustritt am Okular auch auf unbeabsichtigt Lecks "abchecken".
Vergleichen lassen sich nur zwei Objektive mit gleicher Vergrößerung.
Also ein 40er Plan mit einem 40er Neofluar.
Hallo zusammen,
lieber Daniel, gefällt mir gut. Ich habe mit Acridinorange Ähnliches versucht, aber meine Ergebnisse zeigten keine Rotfärbungen von Bakterien.
Möglicherweise passte die Verdünnung nicht. Man liest auch (teilweise) deutlich unterschiedliche Rezepturen die Konzentration von Acridinorange in Aqua dest. angehend.
Noch wahrscheinlicher ist Meiner Ansicht nach ein pH-Wert, der für eine rötliche Färbung von an DNA-reichen Strukturen nicht gepasst hat, denn dieser, der pH-Wert, kann sehr unterschiedliche Ergebnisse hervorrufen.
Zu diesem Thema hat Alexander (Aljoscha) einen sehr lesenswerten Beitrag verfasst:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=45777.msg337604#msg337604
Du hast mich nun daran erinnert, so eine Versuchsreihe nochmals zu probieren. Dabei werde ich es mit unterschiedlich eingestellten pH versuchen (mit Sörensen Puffer). Vielleicht gehe ich auch mit der Konzentration auf 1:10000 hoch.
Bei solchen Bildern sicher auch ein mögliches Thema:
Zur Verbesserung des Kontrasts und der Schärfe wird bekanntlich in der Fluoreszenzmikroskopie nicht selten mit Deconvolution gearbeitet.
Dabei entsteht (für mich) das Problem: ,,Wie komme ich zu der PSF (point spread function) meines genutzten Objektivs?"
Dafür genutzte Methoden mit fluoreszierenden ,,Micro Beads" in der Größe von ca 1 bis 2 µm zur Bestimmung der Beugungsscheibchen sind ausgesprochen kostspielig. Und: Eine synthetisch errechnete PSF ist zu einem gewissen Teil Glückssache.
Wenigstens existiert mit ImageJ eine kostenfreie Software, die auch so etwas ermöglicht. Das vorkonfigurierte Paket ,,Fiji" ist dafür besonders anzuraten.
ImageJ ist nicht unbedingt eine intuitiv zu bedienende Software, aber es existieren Tutorials.
Ach ja, ich füge Bilder meines Versuchs bei, der leider keine rot gehaltenen Bakterien zeigt. Das muss sich ändern ... ;D ;)
Liebe Grüße
Jakob
Zitat von: Spectrum in November 13, 2024, 20:44:03 NACHMITTAGSVergleichen lassen sich nur zwei Objektive mit gleicher Vergrößerung.
Also ein 40er Plan mit einem 40er Neofluar.
Ich habe mal mit normalem deckglas und dem Neofluar das 40er verglichen schon etwas besser als das LWD40. Probleme machen am meisten das plan 2,5 und das LWD20
Zitat von: Spectrum in November 13, 2024, 20:42:13 NACHMITTAGSDas Automatikprogramm deiner Kamera ist für Fluoreszenzaufnahmen völlig ungeeignet.
* Hast du eigentlich inzwischen mal geschaut ob dein Aufbau tatsächlich auch UV dicht ist? Ich hatte dir ja den Rat
Ich Fotografiere am Mikroskop immer Manuell da ja die Automatik wegen der fehlenden Blendensteuerung, meiner bevorzugten Belichtungmessung (spot) eh nur noch Blödsinn macht :-X
ich habe das tatsächlich Ignoriert da mein Filter frisch vom Fachhändler ist, das UV Schutzrohr an der Xenon nicht demontiert wurde und ich ja eventuell eh auf LED umbauen werde, aber dsa mit den aufkleber werde ich am Universal mit der UV led eh machen müssen (da habe ich dann tatsächlich repekt!)
liebe Grüße Daniel
Hallo Jakob,
danke für dein Tipp mit Fiji, das hat mich jetzt sehr beschäftigt..... .....ohne Ergebnis :D
ich bleib dran ;)
Deine Fotos errinern mich an meine Probe nach etwa 30 minuten. die besten Kontraste hatte ich kurz nach dem Färben, die ergebnisse von Alexander sind auch intressant, meine Probe war nicht fixiert und der pH wert neutral, ich habe heute Mittag vor mal das ganze anzusäuern, ich werde später berichten ;-)
liebe Grüße Daniel
Zitat von: Daniel Scheibenstock in November 14, 2024, 09:46:26 VORMITTAGProbleme machen am meisten das plan 2,5 und das LWD20
Hallo Daniel,
Das ist so. Die Lichtausbeute von Objektiven bei Auflichtfluoreszenz kann mit der Formel NA^4/Vergrößerung^2 beschrieben werden. die NA geht also mit der 4. Potenz ein. Lichtschwache Objektive sind nicht gut geeignet. Du verwendest ein 2.5x/0.08. Im Vergleich liefert das 5x/0.25, das ich einsetze 25x so viel Fluoreszenzlicht.
Viele Grüße
Alexander
Hallo Alexander,
schön auf den Punkt gebracht, oder wie es bei den Fluoreszenzlern so schön heißt: sowenig Fluorchrom wie nötig (wegen des unspez. Hintergrundes) und soviel Apertur wie möglich, deshalb gibt es ja 10er, 25er und 40er W bzw. Öl-Immersionen mit hoher Apertur (leider rar und teuer) ;)
Beste Grüße Stefan
gleich folgen die Bilder des Mittagsexperiment ;-)
Ablauf:
Probe wurde mit Zahnstocher gewonnen und auf einem Obj.Tr. verstrichen.
neuer Zahnstocher wurde in 80% Essigsäure getaucht und mit dem Speichel gemischt.
Neuer zahnstocher wurde in AO (AO-Wassergemisch) getaucht und mit der Probe gemischt.
das ganze wird schon besser :-)
Liebe Grüße Daniel
Bilder:IMG_7573.jpeg
DSC08918.jpeg
DSC08918.jpegDSC08928.jpeg
Je ein bearbeitetes und eines direkt aus der Kamera. 10 neofluar und 40 x60
Hallo Fluorenzler,
Sehr interessant was sich hier entwickelt. Den Beitrag von Alexander mit den unterschiedlichen ph-Werten kannte ich noch gar nicht. Welche Farbstoffkonzentration hast du dort angewendet?
Ich habe 2 Tage frei und werde auch Testaufnahmen beisteuern.
Bereite gerade fixierte Ausstriche vor. Würde zunächst eine Versuchsreihe mit absteigenden Konzentration des AO anfertigen. Beginnend mit 0.04g auf 100ml Aqua bidest. Einmal am Ausstrich und einmal an der frischen Probe. Dann weiter in Reihe verdünnen um den Faktor 10.
Hier spielen so viele Faktoren eine Rolle:
1.ph-Wert
2.Farbstoffkonzentration
3.Einwirkzeit
4.Photobleaching
5.Zusammensetzung des Anregungslichts ("Breite" des Anregungslichts)/Filterkombination
Vielleicht können wir uns ja auch absprechen, bin für Vorschläge offen.
Grüße Holger
Hallo Holger,
Welche Methode verwendest du für die Fixierung?
Lg Daniel
Ps mit Fiji bin ich schon weiter. Habe mal einen Versuch gemacht mit deconvulation und ist auf jeden Fall spannend
Die Ergebnisse der Testreihe in Bezug auf die Konzentration sind fertig:
-Alle Bilder Ausschnitte unbearbeiteter jpeg Dateien aus der Sony a6500.
-Fixer Weißabgleich
-Belichtungszeit 1/60sec
-ISO Automatik
-LED 467nm +-11nm.
-Objektiv Nikon Fluor 20, 0,75
Je ein Bildpaar eines frischen Präparats und eines Ausstrichs.
Das frische Präparat wurde aus Abstrichmaterial gewonnen. Abstrich aus meinem Mundraum, suspendiert in NaCl 0,9%.
0.05ml Suspension mit 0.05ml Acridinorangelösung vermischt.
2min Einwirkzeit.
Das ausgestrichene Präparat wurde aus eben dieser Suspension gewonnen. Bei 40° getrocknet, mit Ethanol fixiert. Im Anschluss in Aqua bidest gereinigt.
2min in Acridinorangelösung angefärbt. Dann in Aqua bidest für weitere 2min gespült.
Mit Deckglas zügig unter Auflichfluoreszenz fotografiert
Acridinorangelösung 0.04% (0.04g/100ml Aqua bidest):
Frischpräparat:
IMG_20241114_192643.jpg
1/60 sec, ISO 2500
Ausstrich:
IMG_20241114_201911.jpg
1/60sec, Iso1000
Da isse die Rotfärbung. Bakterien lassen sich bei dieser sehr hohen Konzentration und den sonstigen Bedingungen bereits zumindest bei dem Ausstrich gut erkennen. Aber eben Rot auf Rot.
Acridinorangelösung 0,0.04% (0,004g/100ml Aqua bidest):
Frischpräparat:
IMG_20241114_203134.jpg
1/60sec, ISO 250
Ausstrich:
IMG_20241114_204448.jpg
1/60sec, ISO 1640
Bei dieser Verdünnungsstufe werden Zytoplasma Zellkerne und Bakterien auch farblich gut differenziert.
Acridinorangelösung 0,0004% (0.004g/100ml Aqua bidest):
Frischpräparat:
IMG_20241114_211400.jpg
1/60sec, ISO 3200
Ausstrich:
IMG_20241114_211838.jpg
1/60sec, ISO 5000
Bei dieser Verdünnungsstufe erscheint das unbearbeitete Bild überwiegend grün. Auch die emittierte Lichtmenge nimmt ab.
Weiter verdünnt habe ich dann nicht mehr. Zwei Ausstriche habe ich noch. Ich könnte diese ja mal bei gleicher Verdünnung aber jeweils in leicht saurem und leicht alkalischem Bereich färben. Aber das hat Alexander ja schon recht anschaulich getan. Bin für Vorschläge offen.
Ausserdem noch ein paar allgemeine Beobachtungen:
-Der Unterschied zwischen frischem und fixierte Präparat war überraschender Weise nur gering.
-Bakterien sind nur auf einem kleinen Teil der Probe zu finden. Auf der Mehrzahl der Epithelzellen konnte ich keine entdecken.
-Bei größeren Zellverbänden im Frischpräparat sieht man deutlich, daß es eine ganze Weile dauert bis die Färbelösung ins Innere vordringen konnte. Das daraus resultierende Konzentrationsgefälle sieht dann so aus:
IMG_20241114_214243.jpg
Holger, das ist wirklich anschaulich. Danke fürs Zeigen und Deinen Einsatz!
Übrigens: Manche dieser Deiner Bilder haben einen sehr großen Anteil an Rot, wobei die Farbinformation des Grünanteils durch die Komplementärfarbe unsichtbar bleibt. Doch sie ist vorhanden. Nun stellt sich zwar die Frage, ob man beim Wegnehmen von Rotanteilen das Bild viel zu stark manipuliert oder nicht.
Jedenfalls ist es vielleicht durchaus interessant, zu sehen wie das Bild eben bei Dämpfung von Rot aussieht. Zusätzlich habe ich noch eine Deconvolution mit einer errechneten PSF versucht und auch sonst das Bild etwas bearbeitet.
Wenn es Dir lieber ist, dass ich das Bild wieder entferne, Holger: Bitte sagen, ist überhaupt kein Problem.
Liebe Grüße
Jakob
Hallo,
Grundsätzlich bitte immer gerne mein Bildmaterial weiterverarbeiten. (Hab ich auch extra in meine Signatur geschrieben). Genau davon kann man doch lernen. Ausserdem ist das hier Daniels Faden. Ich persönlich finde das total super wie hier jeder was zum Thema beiträgt.
LG Holger
Zitat von: Spectrum in November 14, 2024, 16:41:12 NACHMITTAGSWelche Farbstoffkonzentration hast du dort angewendet?
Hallo Holger,
Ich verwende eine Gebrauchslösung 0,001 % und ich fixiere die Proben vor dem Färben.
Viele Grüße
Alexander
@holger: das ist nicht mein Faden sondern unser aller Faden. Wie sagen die Engländer? The more the merrier !
Ich werde morgen mal eine Reinkultur (Bakterien) färben. Dann können wir vergleichen wie das aussieht. Ich habe bei den großen Zellkernen irgend wie das Gefühl das sie das ganze gern etwas überstrahlen. Man sieht es m.E. Gut bei Jakobs Beitrag (das deconvulierte)
Da haben die Engländer wohl recht😄👍
Ich habe jetzt noch die beiden letzten Ausstriche gefärbt und dabei etwas überraschendes gefunden. Der erste wurde mit 0.004% Acridinorangelösung angefärbt, mit einem ca1% igem Anteil an Essigsäure:
IMG_20241114_235854.jpg
Da hätte ich mir mehr erhofft.
Für das letzte Bild habe ich mir aus Ermangelung einer Pufferlösung mit "Emser Inhalationslösung" beholfen.
Laut Hersteller ist diese leicht basisch (ph 8-10). Welchen ph Wert die Mischung mit der 0,004%igen Acridinlösung hatte kann ich nicht genau sagen, aber das Ergebnis überzeugt:
IMG_20241115_000042.jpg
Helle Fluoreszenz, klar differenzierte Zellkerne und rot gefärbte Bakterien.
Könnte es sein das sich das AO unter den nur leicht basischen Bedingungen an den Bakterien besonders gut ablagert? Und wenn ja, warum?
Ganz schon vertrackt dieses Acridinorange...🤔
Hallo,
Schichten aus mehreren Lagen Zellen erschweren die Beobachtung. Daher empfiehlt es sich, die Speichelprobe mit Ringerlösung oder PBS zu verdünnen und dann auszustreichen. Einzeln liegende Zellen ergeben sehr viel bessere Bilder als mehrlagige Zellklumpen.
Viele Grüße
Alexander
Ja, das stimmt. Deshalb habe ich die Probe auch verdünnt (in meinem Fall mit NaCl 0,9% anstatt Ringer) und mittels feiner Pipette vermischt. Trotzdem bleiben an manchen Stellen auch noch "Klumpen" aus Zellverbänden bestehen.
Guten Morgen zusammen:
,,The outstanding characteristic of acridine orange is its pronounced metachromasia. This is a consequence of the " con.eentration effect" (S t r u gget 1949). The mldissociated acridine orange molecule presents green fluorescence. However, depending on pH, acridine orange becomes dissociated (completely between pH = .65 to 6 0, and still 85%o at pH = 8: el. Sehiimmelfeder, Krogh and Ebsehner 1958). The cation is strongly metachromatic: Concentrated solutions (higher than 5 X 10-3M) fluoresce red, weaker solutions (less than 10 -4 M) green. The color change is based upon the formation of dimers and polymers of the dye occurring in higher concentrations."
Zitat aus:
Bertalanffy, L. Acridine orange fluorescence in cell physiology, cytochemistry and medicine. Protoplasma 57, 51–83 (1963)
Viele Grüße
Jürgen
Morgen Jürgen,
Die zitierte Textstelle erklärt sehr gut die Beobachtung.
Die rote Anfärbung der aufsitzenden Bakterien, die bevorzugt in leicht basische Millieu, oder bei eher hohen Konzentrationen auftritt, erklärt sich dann wohl mit einer erhöhten H+ Konzentration an der Membran der Bakterien. (Stichwort "elektrogene Pumpe"). Ist das umgebende Medium selbst auch leicht sauer fehlt das H+ Gefälle um dort bevorzugt Farbstoff anzulagern. Dementsprechend bleiben die Bakterien deshalb in saurem Milieu auch grün, richtig?
Grüße Holger
Hallo Holger,
der bathochrome Effekt ("Rot-Verschiebung") tritt durch die lokale, sehr kleinräumige, auf molekularer Ebene auftretende Konzentrationserhöhung und Überlappung der Moleküle auf.
Damit eng verknüpft ist ob AO als Mono-, Oligo- oder Polymer vorliegt. Das ist wiederum beeinflusst von AO-Konzentration, Lösungsmittel /Puffer und Aufnahme in Zelle und Zellmilieu sowie der Struktur an die sich AO anlagert.
So führt u.U. Anlagerung an einzelsträngige Nukleinsäuren (einzelsträngige RNA oder 'aufgebrochene' DNA) eher zu orange bis rot, an Doppelsträngen zu grün, dies ist jedoch, wie festgestellt sehr Protokoll-abhängig!
Als Ergänzung zu der o.g. Literatur:Updating Ortho- and Metachromatic Acridine Orange Fluorescence in Cytochemical Chromosome Staining... (https://www.mdpi.com/2227-9040/11/10/540) v.a Abschnitt 3.
und nicht nur für die Ciliatenfreunde ein Hinweis auf
Interpretation der Acridinorange-Färbung von Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des Bodens von Thilo Bauer (https://www.researchgate.net/publication/283239856_Interpretation_der_Acridinorange-Farbung_von_Ciliaten_Ciliophora_des_Susswassers_und_des_Bodens)
Beste Grüße Stefan
Hallo Stefan,
Der Artikel von Juan C. Stockert und Alfonso Blázquez-Castro ist ja eine wahre Fundgrube! Tausend Dank dafür.
Den Artikel von Thilo Bauer kenne ich schon. Damit ging es bei mir mit dem Hobby, insbesondere mit dem Interesse für Fluoreszenz erst so richtig los. Hochinteressant!
An dieser Stelle würde ich übrigens gerne auch auf das, ich nenne es einmal Schwesterforum, hinweisen.
Momentan hängt der Fortbestand des z.Z. noch von Thilo Bauer geführten "Tümpler-Forums" wohl am seidenen Faden.
Ich persönlich empfand dieses Forum immer als tolle Ergänzung zu dem Forum hier.
Vielleicht findet sich ja doch noch eine Lösung.
Grüße Holger
Hi Zusammen,
ich habe weiter getestetIMG_6645.jpeg
Leider ging einiges schief und ich kann nur mit wenigen Bildern Dokumentieren:DSC08936.jpeg
DSC08940.jpegDSC08947.jpeg
Ich habe die Ausstriche frisch in selber hergestellten Puffer verdünnt. Dieser bestand aus 0,9% NaCl und wurde im pH wert eingestellt.
Leider war der Kamera Akku leer und bis wieder Strom da war schon eine Veränderung der Probe feststellbar :-(
Liebe Grüße Daniel
Dein Ergebnis passt ja gut ins Gesamtbild.👍
Schöne Bildergebnisse.
Grüße Holger
P.s. Handschuhe? (Sorry, kann's nicht lassen)
Ja Handschuhe hab ich schon da 8) sehe hier aber nicht wirklich die Notwendigkeit. Das AO ist schon verdünnt, und wurde mit einem Zahnstocher aufgenommen und in die Probe eingebracht. Wenn das fahrlässig ist bitte um Hinweis an mich :-)
Ich werde den Versuch nochmals wiederholen. Und dann wahrscheinlich mit deckglas und umgekehrtem Objektträger, mal das 40er Neofluar einsetzen.
Schönen Sonntag an alle Kollegen, Daniel
Naja, vielleicht bin ich eher von der übervorsichtigen Sorte, du hast recht die Lösung ist recht stark verdünnt und so akut giftig ist das AO jetzt nicht, aber es interkaliert halt mit DNA. Deshalb ist eine Genschädigung nicht auszuschließen.
Und Handschuhe tragen tut ja nicht weh. Genauso wie eine wasserfeste Unterlage. Das eingesparten Krebsrisiko ist mit einem Steak vom Grill besser angelegt.
Gutgemeinte Grüße Holger
Hallo,
mit großem Interesse bin ich diesem Faden gefolgt und habe die letzten Abende viele Stunden mit Experimenten verbracht, um das hier gezeigte nachzuvollziehen. Ich erlaube mir daher mal, zwei Bilder beizutragen.
Das Präparat ist ein Mundhölenausstrich. Fixierung: Hitzefixierung (10 Minuten am Rand des Kaminofens). Verdünnte Acridinorange-Lösung mit Essigsäure auf pH 5 gebracht. 10 Minuten Einwirkzeit. Beleuchtung: LED 3W 450 nm (die Fluoreszenz war hier stärker, als bei 430 nm).
Filterwürfel CZJ (schwarze Serie, steht nur 450 drauf, ist ein Anregungsfilter B422 und ein Sperrfilter G245 verbaut). Zusätzlich unter dem Bino ein G242. Belichtung 1 s bei 1000 ASA.
Schönen Abend,
Carsten
Hallo,
vor ein paar Wochen habe ich mal mit AO ein paar Mundschleimhautzellen behandelt. Unwissenschaftlicher gehts nicht: Etwas Abstrichmaterial von der Wange auf einen Objektträger gebarcht. Nicht ausgestrichen. Etwas AO-Lösung "frei Schnauze" verdünnt, ein Tropfen darauf und dann ein Decklgas aufgelegt. Normale 100 Watt Halogenleuchte, Leica Filtersatz I3.
Herzliche Grüße
Peter
Screenshot_20241117_204001_Gallery.jpg
Hallo Carsten, Hallo Peter,
2 tolle Beiträge. Ich finde an Carstens Fluo2 Bild toll die differenzierten Bakterien. Good Job 🙂👍 @Peter für frei Schnauze sieht das aber schon beachtlich gut aus😉
Hallo Carsten,
Toller Farbkontrast. Und der Hintergrund tiefschwarz. Wie hast du das hingekriegt? War das Bild von Anfang an schon so?
Hallo Peter,
Die Barch-Methode hab ich auch gleich mal ausprobiert, und mich nochmal in das Reich der ästhetischen Mundfäule begeben.
0.04% AO (also recht stark konzentriert) mittels Durchziehen unterm Deckglas ein Konzentrationsgefälle hergestellt und dann nach interessanten Stellen gesucht:IMG_20241117_222823.jpg
Die Bilder sind mit einem Nikon Fluor 40/1,30 Öl an meinem Fluo-Frankenstein entstanden. Bildausschnitt und nachbearbeitet.
Grüße
Guten Morgen.
@Holger: ja, der Hintergrund ist so dunkel. Sieht auch im Okular so aus, auch die Bakterien. Für eine geringe Hintergrundfluoreszenz sollte das Präparat von überschüssigem AO frei gespült werden.
Grüße
Carsten
Hallo liebe Runde,
etwas spät, aber doch einige Ergebnisse von mir.
Wobei ich bitte anmerken möchte, dass ich Probleme hatte, die Epifluoreszenz-Einrichtung (IV FL) für ZEISS STANDARD Typen ordentlich zu zentrieren, da die Verbindung mit dem Mikroskop sehr wackelig war. So etwas wirkt sich durch den Abstand zum Tubus weiter hinten bei der Beleuchtung merkbar aus (eine 3 Watt Cree, die in ein ZEISS Lampenhaus 60 Watt eingebaut wurde).
Gewissermaßen ein ,,Durchhängen" und zu wenig Licht.
Die AO-Mischung mit Aqua dest. war nach Schätzung konzentriert. Der pH auf 6,2 (Messstreifchen) eingestellt. Die Belichtung unbequem lange dauernd (40 Sekunden).
Aber seht bitte selbst ... ;) :)
Liebe Grüße
Jakob
Hallo Jakob,
Das Ergebnis ist aber prächtig 🙂👍🏻
Liebe Grüße Daniel
Danke Dir Daniel,
das ist wirklich nett von Dir!
Bei künftigen Aufnahmen werde ich allerdings wieder mit der HBO 50 Einrichtung arbeiten. LEDs hin oder her, die HBOs liefern einfach satte Leistung, Helligkeit.
Natürlich ist die Lebensdauer der Brenner ein Thema, sofern man aber eine Planung für durchzuführende Aufnahmen betreibt, lässt sich die Sache zumindest (Kosten für Brenner) einigermaßen begrenzen.
Und: Diese Methode der Beleuchtung deckt für Fluoreszenzmikroskopie von UV bis Grün (Anregung) alles ausreichend ab. Ich möchte nämlich sehr gerne auch mit UV arbeiten, obwohl die Filter dafür extrem schwierig zu bekommen sind. ;) :(
Danke nochmals, Daniel, liebe Grüße
Jakob