Mikro-Forum

Hallo zusammen,

habe heute Abend den ersten Teil meiner Suche nach Standardpräparaten für DIC und ggf. andere Kontrastverfahren im Unterboard Mikro-Know-How / Technik eingestellt.

Über Rückmeldungen gute wie kritische freue ich mich wie immer.

EDIT durch Moderation: Hier das PDF zu den o.ä. "Standardpräparaten":

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=dlattach;attach=50248

Hallo Jürgen,

Mein Standartpräparat sind die Ephitelzellen.

Warum?

Immer dabei!
Mit Bakterien!
Einfache Präparation!


Schönen Abend,

Daniel IMG_5722.jpeg

Hallo Daniel,

ich hatte geschrieben in dem PDF, warum das für mein Vorhaben nicht geht. ;D

Ok, habs gelesen und verstanden. 🙈

Hmm, das macht die Sache doch verzwickter. Ich würde mal Insektenflügel probieren, ungefärbte   Dünnschnitte von Pflanzen, Pollenpräparate oder queerschnitte von Haaren. Aber ehrlich gesagt keine Ahnung was am besten ist🙈

Hallo Jürgen,

ein interessanter Ansatz diese Glaskügelchen, sie zeigen ähnlich  wie Luftblasen schön die Interferenzstreifen direkt im Präparat.
Da ich aber nicht erkennen kann, wie hiermit etwa

• Amplituden oder evtl besser Kantenkontrast
• Reliefeffekt, also der Phasenkontrast des DIK
• Optische Schnitte, bei höheren Vergrößerungen

gut beurteilt werden könnten, finde ich die Kügelchen als zusätzliche Ergänzung interessant, allein würde ich sie jetzt nicht verwenden.

Hubert hatte bei seiner Abhandlung z. schiefen Beleuchtung, Bild 21 (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41469.0) schon einmal Geschmacksknospen gezeigt, Michael hatte Mundschleimhautepithelien in Glyceringelantine (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=48811.0) verwendet.
Ich vermute und befürchte mal das eine geeignetste Präparat wird sich nicht finden lassen. Vor allem nicht über die ganze Bandbreite der Vergrößerungen.
Selbst in einem der klassischen Paper zum DIK, werden die verschiedensten Präparate von Diatomeen, über befruchtete Pflanzensamen, Hinnervenkerne, Drosophila-Chromosomen und Rädertier verwendet:
R D Allen, G B David, G Nomarski; The Zeiss-Nomarski differential interference equipment for transmitted-light microscopy; Z Wiss Mikrosk 1969 Nov;69(4):193-221. (https://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/referencelibrary/pdfs/Allen_etal_Zeit_Wissen_Mikro_Tech_69-193-1969.pdf)

Beste Grüße Stefan
 

Hallo Jürgen,

danke, dass du deine "Suche nach Standardpräparaten für DIC und ggf. andere Kontrastverfahren" mit uns teilst.

Ich verwende gerne ein Präparat mit Flügelschuppen von Maniola jurtina L. eingedeckt in Entellan; Zwiebelhäutchen Eindeckmittel nicht angeschrieben und Diatomeenpräparate.

Aus meiner Sicht ist die Herausforderung in der Praxis der Amateure ein geeignetes, reproduzierbares Objekt zur Hand zu haben das in einer minimalen, sprich optimalen Schichtdicke eingedeckt ist.
Dies gilt aus meiner Sicht für DIC und Phasenkontrast.

Grüsse Arnold

Hallo Jürgen,

was wäre denn theoretisch ein perfektes Prüfpräparat?

Ich habe keinen Dic zu Hause. Aber es scheint ja so, dass der Dic die geometrische Realität nicht immer genau abbildet und anfällig für höhere Schichtdicken ist.

Also müßte man mit bekannten geometrischen Strukturen(Kugel ist schon mal gut) arbeiten und diese dann zusätzlich mit Varianten aufdoppeln/unterlegen. Vielleicht kann man sogar organische und anorganische Strukturen mischen.

Da der Strahl ja durch das Prisma geteilt wird, und materialabhängig ist, wäre es noch sinnvoll mit verschiedenen Materialen zu arbeiten.

???

Liebe Grüße
Rudolf

Hallo,

an dem Beispiel des optischen Schnitts in Glashohlkugeln sieht man schon einmal einen Teilaspekt der unterschiedlichen Abbildungsqualität verschiedener Kontrastverfahren. Ich habe aus Jürgens Aufnahmen das zentrale Objekt für Phasenkontrast (links), schiefe Beleuchtung (Mitte) und DIK (rechts) herausvergrößert (und etwas im Bildkontrast modifiziert).

Dass Phasenkontrast für dicke Objekte nicht gut geeignet ist, ist ja bekannt. Bei diesem Beispiel fällt das allerdings weniger auf da praktisch keine Phasenstrukturen, oder zumindest keine strukturierten, außerhalb der Schärfenebene des Objektivs allzu störend interferieren. Allerdings ist der Haloeffekt natürlich ausgeprägt.

Dagegen finde ich die schiefe Beleuchtung relativ gut und objektgetreu, vor allen Dingen wenn man weiß dass sie Phasensprünge systematisch durch helle oder dunkle Übergänge quer zur Symmetrieachse zeigt. Das gilt für die äußeren Ränder der Glashohlkugel, weil dort der Phasensprung zwischen Glas und Eindeckmedium relativ gering ist (im Gegensatz zum inneren Übergang zu Luft, für den eigentlich kein Phasenkontrastverfahren erforderlich wäre). Eigentlich wird nach diesen Grundsätzen die Hohlkugel sehr gut interpretierbar dargestellt.

Beim DIK ist doch der Halo im Vergleich zur schiefen Beleuchtung, die ja auch ein differentielles Phasenkontrastverfahren ist, eher unschön stark ausgeprägt. Mich wundert etwas dass hier der Reliefeffekt überhaupt nicht vorhanden ist. Und auch der innere Hohlkugelrand wird durch stärkere, zu diesem parallel verlaufende Artefakte gestört (das 2. DIK-Bild hatte den Halo nicht, war mir aber hier zur Demonstration etwas zu Dunkel).

Wenn man das Preis-Leistungsverhältnis der Verfahren betrachtet, hat hier m.E. die schiefe Beleuchtung gewonnen.  ;)

PhaKo SchBel DIK Glashohlkugel.jpg

Hubert

Hallo,

Jürgen herzlichen Dank für Deinen sehr interessanten Beitrag!

Ganz nach Herrn Preisler: "Wichtig ist auf'm Platz!" sind für mich als Praktiker biologische Präparate zur Beurteilung der DIK Eignung intutiv besser geeignet.
Für eigene Tests habe ich zwei ungefärbte histologische Dünnschnitte von 4 bzw 8 Mikrometern Stärke als Referenzobjekte verwendet.

Ein anderes gut geeignetes Präparat,  welches jeder Nutzer ohne Gefahr von Schleimhautläsionen im Mund immer wieder herstellen kann,  sind Proben von Schimmelpilzen, -'Gewebe', -Hyphen bzw. Sporen die im Präparat in unterschiedlicher Dicke vorliegen.
Die Möglichkeit optischer Schnitte/Reliefbildung im DIK lässt sich aus meiner Sicht sehr gut testen und im Hellfeld, Phasenkontrast, Df, usw. vergleichen.
Ein weiteres wichtiges Kriterium ist für mich die Stärke des Helligkeitsgradienten im Bild. Objektive bei denen mit dem 'neuen'  Zeiss Schieber' DIK ein deutlicher Gradient nicht vermieden werden konnte, habe ich als wenig geeignet eingestuft.

Grüße,

Michael/M59

Hallo Jürgen,
ich Rätsele etwas; wir sehen ja durch die "Hohlkugellinse", quasi wie ein Hilfsmikroskop auf Präparateebene, auf das Streifenfeld des unteren, kondensorseitigen Prismas. Gibt es unterhalb des Präparates irgendetwas Doppelbrechendes, war da noch ein Verzögerer? Ich frage weil ein Verstellen des Polarisators allein, nicht das seitliche ( n. N-O) auswandern der Streifen, sondern ein "Verblassen" bewirken würde
1.jpg2.jpg

Bei Verwendung der 𝞴-Platte zeigt sich ja, wie erwartet, ein weiteres Wandern der Streifen, jedoch ist der Hintergrund senfgelb und nicht rot, was auch für zusätzlich Verzögerndes spricht:
3.jpg
Beste Grüße Stefan

Hallo,

die Effekte der Glaskügelchen sind zweifellos interessant, allerdings für mich doch etwas abstrakt. Für den Physiker und den primär an theoretischen Effekten Interessierten mögen sie durchaus Aussagen liefern, allerdings reicht meine Phanatasie oder Interpretationsfähigkeit nicht aus, hieraus Rückschlüsse auf die Qualität eines DICs oder sonstiger Kontrastverfahrens zu ziehen.

Die Frage an Jürgen Boschert lautet auch, w a s genau Du an dem von Dir gewünschen "Standardobjekt" beurteilen können möchtest. Kontrast? Auflösung? Qualität des optischen Schnittes?

Sehe ich es richtig, dass die Mundschleimhautzellen grundsätzlich schon das ideale Objekt dazu wären, wenn es nur eine Möglichkeit gäbe, diese so zu fixieren und einzudecken, dass sie keinen Veränderungen durch weitere Austrockung etc. unterliegen?

Herzliche Grüße
Peter

Ich bin gespannt auf die Vollkugeln in Einbettmedium. Die Dicke der Hohlkugelnzusammen mit dem hohen Brechungsindexunterschied zwischen Luft und Einbettmedium/ Glas scheint mir zuviel zu sein.
Warum machst Du einen extra Thread auf, aus dem man nicht direkt auf Dein Dokument zugreifen kann? Wenigstens ein Link wäre nicht schlecht, dass man das nicht mühsam suchen muss.

Viele Grüsse
Florian

Hallo Florian,

in habe den Link zum PDF über die "Standardpräparate" noch einmal Jürgens Eingangsposting in diesem Thread als EDIT hinzugefügt.

Herzliche Grüße
Peter

Hallo Florian,

ZitatDie Dicke der Hohlkugelnzusammen mit dem hohen Brechungsindexunterschied zwischen Luft und Einbettmedium/ Glas scheint mir zuviel zu sein.

natürlich ist die gesamte Dicke der Kugeln zu groß für jede Art Phasenkontrastverfahren. Aber der innere Teil, wo Glas an Luft angrenzt ist auch weniger der interessante Aspekt, sondern der äußere Übergang zwischen Glas und Eindeckmedium. Wenn diese Brechungsindizes genau übereinstimmen würden, dann wäre der äußere Kugelrand praktisch unsichtbar, auch für Phasenkontrastverfahren. Aber natürlich haben übliche Eindeckmedien einen mehr oder weniger abweichenden Brechungsindex, und der reicht dann bei etwas dickeren Objektstrukturen wie z.B. das am Kugelrand angeschnittene Segment innerhalb der Auflösungsgrenze des Objektivs aus, um einen starken (eventuell zu starken) Phasensprung zu erzeugen.

Ich habe mit Glasfasern, eingebettet mit Immersionsöl, experimentiert. Die waren im Hellfeld mit geöffneter Blende absolut unsichtbar. Erst z.B. mit schiefer Beleuchtung erschienen sie mit relativ weichem Kontrast am Rand, jedenfalls nicht als rein schwarz-weiße Kante.

Hubert

Hallo zusammen,

erst einmal möchte ich mich dafür entschuldigen, dass ich meinen Technikbeitrag hier nicht verlinkt hatte. In diesem Zusammenhang herzlichen Dank an Peter V., dass er das für mich nachgeholt hat.
Über die doch rege Resonanz freue ich mich wirklich.

Es kam die Frage auf, was nach meiner Auffassung ein ideales Standardpräparat sei. Meine Idee war, eine schlichte Objektform zu haben, an der man die Effekte der verschiedenen Kontrastverfahren nachvollziehen, evtl. sogar vermessen kann. Damit sollte auch eine reproduzierbare Vergleichbarkeit erreicht werden. Entsprechende, evtl. mögliche Berechnungen werde ich selbst nicht anstellen können, da mir persönlich hierfür der physikalisch-mathematische Hintergrund fehlt; aber vielleicht wird ja in dieser Richtung ein anderer in diesem Forum dann weitermachen können.
Das Schleimhautpräparat ist nicht unbedingt in diesem Sinne ideal, aber es hat unbestreitbare Vorteile: Es ist ein weit und hinlänglich bekanntes Objekt, für das die meisten von uns auch ein gewisses" intuitives Gefühl" entwickelt haben; es ist leicht und jederzeit herstellbar und weist sowohl große wie auch sehr feine Strukturen auf. Reproduzierbarkeit im strengen Sinne ist damit nicht zu erzielen. Da sich die Verhältnisse im Präparat über die Zeit ändern, ist es auch für längere Untersuchungen nicht ohne weiteres geeignet.
Ursprünglich hatte ich die Idee eine Suspension von Eindeckharz und einer darin nicht löslichen Flüssigkeit mit anderem Brechungsindex (z.B. Wasser) heranzuziehen, das erschien mir aber nicht so einfach, insbesondere was eine reproduzierbare Größe der Einschlüsse anbelangt; werde es demnächst einfach mal testen.
So kam ich letztlich auf die Glaskugeln.

Was hoffe ich damit beurteilen zu können: 1. Zunächst die Objekttreue der Abbildung.
2. Dann aber auch die Qualität und das Ausmaß der Kontrastierung; dazu sollte der Brechungsunterschied zwischen Objekt und Eindeckmedium gering sein; das ist ja bei den Hohlkugeln nicht der Fall, wohl aber bei den Vollglaskugeln, wie wir noch sehen werden. Man kann das natürlich noch präzisieren, wenn man Glas genau definierter Brechkraft verwendet und mit dem Eindeckmedium quasi optisch titriert (da wird's dann aber technisch professionell).
3. Erkennen sollte man auch die Separierung verschiedener Ebenen in der Z-Achse, d.h., inwieweit Objekte ober- und unterhalb der Fokusebene sich störend überlagern. Im Idealfall sind optische Schnitte möglich.
4. Spezielle Effekte eines Kontrastverfahrens wie beispielsweise der Pseudo-3D-Effekt sollte erkennbar, evtl. sogar quantifizierbar sein.

Nun noch speziell zu purkinjes Beitrag (#9) in diesem Faden:

Nein, da ist nichts weiter doppelbrechendes im Strahlengang. An Polarisator- und Analysatorstellung habe ich nichts verändert, sondern das Hauptprisma in der Horizontalen verschoben; dabei war mir eben aufgefallen, dass der Interferenzstreifen 0. Ordnung bei maximaler Dunkelstellung des Hintergrundes exakt mittig in der Kugel lag. Dass in der Luft in den Hohlkugeln die Interferenzstreifen sichtbar sind, liegt sicher daran, dass hier eine zusätzliche Linse in das System eingebracht, in diesem Areal die Objektivbrennweite verändert wurde und damit innerhalb der Hohlkugel die Bedingungen für einen homogenen Hintergrund nicht mehr gegeben waren.
Im Farbkontrast -dieser wird durch Einschieben einer Lambdaplatte erzielt- ändert sich die Hintergrundfarbe ebenfalls mit der lateralen Position des Hauptprismas; mir hat da halt Senfgelb besser gefallen als die anderen Farben.

Hallo Jürgen,
okay, Dank Dir für die Erläuterung. Es wandern die sichtbaren Streifen also mit der Verstellung des oberen, objektivseitigen Prismas. Dann ist das, wie von Dir geschildert, der Linseneffekt des Hohlraums der das Streifenfeld durch Umfokussierung sichtbar macht und es nicht zur Kompensation kommt. Man sieht also nicht nur das untere Prisma allein, wie ich fälschlicherweise annahm, sondern den phasenverschiebenden Gesamteffekt mit dem oberen Prisma. Das macht diese Ansicht natürlich spannender.
Beste Grüße Stefan

Lieber Jürgen,

wenn es ein solches Stadardpräparat geben sollte, wäre das natürlich schön. Ich fände "sich nicht mehr verändernde" Schleimhautepithelien schon recht nahe am Ideal. Solche Präparate lassen sich aber wohl nicht herstellen.

Die Vorteile hast Du bereits allesamt aufgezählt und ich kann das auch nur unterstreichen. Gerne nutze ich auch die sich bei sehr flachen und langsam trocknenden Schleimhautpräparaten einstellende Fältelung der Oberfläche und die kleinen "gezähnten" Strukturen an Zellmembranrändern. In der Tat habe i c h mich auf diese Präparate am ehesten "eingesehen" und kann damit am ehesten eine z.B. korrekte DIK-Einstellung etc. beurteilen. Reproduzierbarkeit ist da natürlich nie gegeben, das ist der Nachteil.

Hier werden mir oft Bilder von Diatomeen gezeigt, wenn es um die Einstellung eines DIC geht, mit denen ich  aber - ehrlich gesagt - nichts anfangen kann. Ich bitte dann immer, mir doch ein Bild von Mundschleimhautepithelien zu schicken.

Herzliche Grüße
Peter

Hallo Jürgen,

eine weitere mögliche Alternative zu sphärischen Objekten, jedoch auch nahe am Brechungsindex von Glas sind Zaponlackstriche/-streifen. Zur Beurteilung des Kantenkontrasts tauchen diese in der frühen Literatur zur Theorie des Phasenkontrastes auf. Optische Schnitte sind hier natürlich nicht das Thema, auch stellt sich bei höheren Vergrößerungen die von Dir angesprochene Frage nach einem passenden Eindeckmedium.
zaponstreifen.jpg
Aus Handbuch der Physik  E. Bergstrand, A. Maréchal, M. Françon, H. Wolter - Grundlagen der Optik 1956 S.597
Beste Grüße Stefan

Der Linseneffekt von Kugeln in Immersion ist übrigens schon lange bekannt. Bereits vor 1892 hat man diesen Effekt ausgenutzt um Interferenzfiguren sehr kleiner Objekte herzustellen, wobei man damit ohne irgendelche weiteren Operationen von orthoskopischen zum konoskopischen Strahlengang wechseln kann:

Kugeln.JPG

Herzliche Grüße,

Olaf

Hallo Jürgen,

ZitatWas hoffe ich damit beurteilen zu können: 1. Zunächst die Objekttreue der Abbildung.

Wie wärs mit eine einfache Hellfeld-Aufnahme zum Vergleich? Sollte nicht bei jede Kontrast-Methode ein Hellfeld-Bild hinzugefügt werden?

@PeterV

ZitatHier werden mir oft Bilder von Diatomeen gezeigt, wenn es um die Einstellung eines DIC geht, mit denen ich  aber - ehrlich gesagt - nichts anfangen kann

Vielleicht weil Diatomeen nicht die meist geeignete Objekten sind für DIC. Ich glaube Hubert hat da mal etwas über geschrieben.

Beste Grüsse,

Rolf

Hallo Rolf,

Dir entgeht auch nichts, hatte ich doch glatt vergessen. Wird aber im nächsten PDF nachgeholt. Eigentlich wollte ich auch noch Dunkelfeld und COL ergänzen; für ersteres muss ich mir meine Kamera mal genauer ansehen, die ersten Aufnahmen waren grauenhaft; ringförmiges Schräglicht war selbst mit dem Heine-Kondensor unbefriedigend, hab einfach kein vernünftiges erzeugen können.

Liebe Floristen,
ich habe mir unbedeckte Präparate gemacht mit alternativen Ausstrichen aus Nagellack, Uhu hart, Sekundenkleber.
Die interessanten Stellen (Kanten, Dickenänderungen usw.) kann man dauerhaft markieren. Test- und Vergleichsaufnahmen mit Hellfeld und allen kontrastverstärkenden Verfahren und deren Variationen, mit und ohne Deckglas, mit verschiedenen Deckglasstärken, mit verschiedenen Schichtdicken, mit verschiedenen Immersionsflüssigkeiten usw. sind möglich.
Ein paar Beispielaufnahmen habe ich auch in meinem Fundus, aber leider nicht mehr (oder besser noch nicht) gefunden.
Ich werde aber an das Thema einmal systematisch gehen.

Vielleicht hat aber auch schon ein anderer einschlägige Erfahrungen gesammelt, oder kann  substanzielle Kritikpunkte bzgl. des Vorschlags nennen.

Beste Grüße von Jürgen aus Hagen

Hallo Jürgen,

Zitatich habe mir unbedeckte Präparate gemacht mit alternativen Ausstrichen aus Nagellack, Uhu hart, Sekundenkleber.

Du meinst wohl solche Testobjekte (im Beispiel mit wasserverdünnbarem PVA-Kleber)?
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=48355.msg355918#msg355918

Hubert

Hallo,
eines verstehe ich nicht, in Bezug auf Epithelzellen:

Zitat von: Jürgen Boschert
 Reproduzierbarkeit im strengen Sinne ist damit nicht zu erzielen. Da sich die Verhältnisse im Präparat über die Zeit ändern, ist es auch für längere Untersuchungen nicht ohne weiteres geeignet.

Wieso sollte man davon denn kein Dauerpräparat herstellen können oder sind (hitze-)fixierte und in einem Kunstharz oder UV-Kleber eingeschlossene Epithelzellen ungeeignet? Was soll sich hier noch verändern?
LG Gerd

Hallo Gerd,

das Präparieren und Eindecken in ein Harz ist sicher einfach. Aber: Es sollten halt ungefärbte Zellen sein; und deren Brechungsindex so nah an dem der Medien liegt, dass sie selbst im DIC und sogar Jamin-Lebedeff (sic!) praktisch unsichtbar sind.

Habe aber jetzt noch eine Möglichkeit am Testlauf, die funktionieren könnte; stell ich dann hier gesondert vor. Es ist keines der üblichen Eindeckmedien, sondern ein Immersionsöl.

Hallo Hubert,
ja, der von Dir verlinkte Beitrag war damals der Auslöser für die Anfertigung meiner Testobjekte. Die Ausstriche mit den drei von mir verwendeten Medien habe mit einem Deckglas auf dem Objektträger gemacht.
Als vorteilhaft finde ich, dass die unbedeckten Präparate für alle möglichen Experimente um Kontrastierungen und Abbildungseinflüsse eingesetzt werden können. Nach einem Einsatz werden sie einfach wieder gereinigt und getrocknet.
Beste Grüße von Jürgen

Lieber Jürgen (Boschert),

mit der Herstellung von Dauerpräparaten habe ich mich praktisch nie beschäftigt und meine Erfahrung erschöpft sich in vielleicht 50 Pflanzenschnitten, die ich einmal vor 15 oder mehr Jahren in Euparal eingedeckt habe.

Aber: Man fixiert doch auch zytologische Präparate z.B. in Ethanol oder mit speziellen Fixiersprays, welche danach i.d.R. gefärbt und nicht eingedeckt mikroskopiert und aufbewahrt werden. Warum ist das keine Alternative?

Hezrliche Grüße
Peter

Hallo,

es geht hier um den Test von Phasenkontrastverfahren.

ZitatAber: Man fixiert doch auch zytologische Präparate z.B. in Ethanol oder mit speziellen Fixiersprays, welche danach i.d.R. gefärbt und nicht eingedeckt mikroskopiert und aufbewahrt werden.

Gefärbte Präparate sind für den genannten Zweck vollkommen ungeeignet, weil natürlich dabei der Kontrast durch Absorption, und nicht durch Interferenzauslöschung entsteht. Es gibt auch diverse käufliche Fertigpräparate z.B. von Epithelzellen, Paramecium u.a. bekannte Objekten, aber deren Färbung kontrastiert andere Organstrukturen als reine Phasenobjekte.

Beim Trocknen schrumpft das Objekt sozusagen in der Z-Ebene, verliert also eine der interessanten Eigenschaften. Ich hatte in einem vorangegangenen Beitrag als weiteres Beispiel zwei übereinander liegende Glasfasern genannt, da ist dann auch eine definierte Tiefe und höhengestaffelte Überlagerung der Phasenstrukturen vorhanden. Durch Anpassung des Brechungsindexes des umgebenden Mediums, z.B. durch Mischung zweier verschiedener Immersionsöle, lässt sich sogar die Stärke der Phasenübergänge definiert anpassen und die Empfindlichkeit des Phasenkontrastverfahrens testen.

Hubert

Hallo Hubert,

ich meinte, dass die Zellen für den aktuell diskutieren Zweck natürlich nicht gefärbt, sondern einfach nur mit Ethanol etc. oder Fixiersprays fixiert werden.

Es ging mir nur darum, ob eine solche Fixierung nicht in Lage ist, ein zumindest für bestimmte Zeit weitestgehend unverändertes Präparat zu erzeugen.

Herzliche Grüße
Peter

Hallo Peter,

das ändert aber nichts daran dass durch den Alkohol das Wasser aus den Zellen verdrängt wird und das Objekt dann anders aussieht als in den beliebten Vergleichen, die es mit frischen Epithelzellen bereits gibt.
Jürgen hatte in einem Beitrag ein paar seiner Testkriterien aufgezählt.

Hubert

Hallo zusammen,

ich hatte ja Gerd schon geantwortet, dass ein vernünftiges, ungefärbtes Präparat der Mundschleimhautzellen mit den üblichen Harzen (zur Verfügung stehen mir Canadabalsam, Caedax, Histokitt, Malinol sowie Aquatex als wasserlösliches Medium) nicht zu erzielen sind; ich hab die Medien übrigens wirklich alle durchgetestet. Selbst im Phasenkontrast und Jamin-Lebedeff sind die Zellen mit diesen Medien allenfalls schemenhaft zu erkennen. Meine Erklärung ist, dass die Schleimhautzellen in Hinsicht auf ihr optisches Brechverhalten zu nah an dem der Medien ist, während sie sich ja im Frischpräparat mit allen Kontrastverfahren -im Unterschied zum Hellfeld- wunderbar darstellen lassen. Bei dieser Aktion hab ich festgestellt, dass nach Trocknen des Ausstriches eine alkoholische Fixierung bessere Ergebnisse zeitigt als die Hitzefixierung, am besten dürfte wohl Methanol sein (hab ich momentan nicht da, daher habe ich Brennspiritus verwendet.
Der Brechungsindex von Wasser liegt bei 1,33, wohingegen die Harze sich da im Bereich 1,4 bis 1,6 bewegen.
Vor ein paar Tagen habe ich mich dann daran erinnert, dass ich irgendwo noch ein Fläschchen eines irrwitzig teuren speziellen Immersionsöls von Zeiss für Wasserimmersionsobjektive herumstehen habe, habe es auch gleich gefunden. Es handelt sich um das Immersol W mit n=1,334.

Also frischer Abstrich, Lufttrocknung Brennspiritus drüber, wieder trockenen lassen. Dann ein Tropfen Immersol W, Deckglas drauf. Das Ergebnis zeigt das erste Bild (Plan-Neofluar Imm 25/0,8, mit Wasser).

Mundschleimhaut Immersol W.JPG

Zum Vergleich habe ich noch das Bild eines taufrischen Nativpräparates, aufgenommen mit demselben Objektiv und identischer Einstellung des DIC angehängt.

Mundschleimhaut frisch.JPG

Das Immersol-Präparat ist jetzt seit drei Tagen völlig stabil, über die "wahre" Langzeitstabilität kann ich natürlich noch nichts sagen. Um es zum Dauerpräparat zu machen, müsste noch ein Lackring o.ä. außen drum rum.

Hallo,

m.E. geht bei der Trocknung der Schleimhautzellen doch einiges an wichtiger Feinstruktur verloren, die frische Zellen als interessantes Objekt für Phasenkontrastverfahren erscheinen lassen.

Epithelzellen Trocknung_Frisch.jpg

Hubert

Hallo Hubert,

da stimme ich Dir vollkommen zu! Aber immerhin, man sieht überhaupt etwas. Mit Caedax und Konsorten konnte ich bisweilen nicht einmal die Schärfeebene orten, mangels Objekterkennbarkeit; da war der Ph am besten: Mit Luftanhalten bei völlig abgedunkeltem Raum und gaaaanz langsamem Drehen am Feintrieb konnte ich dann die Zellen als Hauch vor meinem verrauschten Auge ausmachen.
Das Trocknen ist halt erforderlich, damit die Zellen überhaupt am OT haften bleiben. Und wie schon geschrieben: Bei Hitzefixierung sind die Deformationen wie auch der Detailverlust noch wesentlich ausgeprägter, z.T. kann man nicht einmal mehr die Region der Kerne ausmachen.

Zitat von: Jürgen Boschert in Februar 09, 2025, 13:29:29 NACHMITTAGS[...]

Vor ein paar Tagen habe ich mich dann daran erinnert, dass ich irgendwo noch ein Fläschchen eines irrwitzig teuren speziellen Immersionsöls von Zeiss für Wasserimmersionsobjektive herumstehen habe, habe es auch gleich gefunden. Es handelt sich um das Immersol W mit n=1,334.

...

Hallo zusammen,

ZEISS hat Immersol W hier (https://www.micro-shop.zeiss.com/de/at/accessories/consumables) um € 293,93 im Angebot. Für eine Einsicht in Preise muss man angemeldet sein. Die Mehrwertsteuer ist in der Preisangabe enthalten.

20 ml ...  :o  :'(  :D

Laut Angaben im Abstract (https://patents.google.com/patent/DE10308610B4/de?) des einschlägigen Patents von ZEISS ist Immersol W eine Substanz aus einem oder mehreren Perfluorpolyether(n).

ZitatImmersionsflüssigkeit für die Mikroskopie bei Wasserimmersion, mit einer Brechzahl im Bereich von 1,25 bis 1,4, mit einer kinematischen Viskosität
von größer als 20 mm2
/s bei 20°C, mit einem Dampfdruck
bei 20°C von kleiner als 0,01 kPa, und die einen oder mehrere funktionelle Perfluorpolyether enthält.

Perfluorpolyether ist auch als Schmiermittel für Vakuumpumpen erhältlich. Es ist ebenso nicht gerade als billig zu bezeichnen, immerhin ist es aber auf die jeweiligen Mengen in Gebinden bezogen bei weitem nicht so kostspielig wie Immersol W.

Allerdings ist Perfluorpolyether nicht gleich Perfluorpolyether. Hier spielt die Zusammensetzung der Restgruppe eine Rolle.

In den Datenblättern von Anbietern habe ich nur teilweise Angaben über Brechzahlen entdeckt. Die Hersteller dürften dies (hoffentlich)  :) wissen. Nur falls bitte jemand unter Euch sich näher damit befassen möchte.

Mutmaßlich (!) könnte auch Reinheit und/oder Transparenz für mikroskopische Anwendungen eine Rolle spielen.

Hier bitte ein Beispiel (https://www.2spi.com/category/pfpe/?) mit Preisen:

In diesem PDF (https://static.mascom-bremen.de/info_FOMBLIN_PFPE_Oele_und_Fette.pdf) ist eine Variante mit einem Brechungsindex von 1,30 erwähnt (Seite 7, letzte Spalte der Tabelle, ,,Fomblin Y 25").



Liebe Grüße


Jakob

Hallo Jakob,

ich verstehe nicht warum Du hier allgemein über Perflourpolyether beliebiger Hersteller Ausführungen machst. Das Immersionsöl muss für hochaperturige Objektive sehr spezifische Anforderungen bezüglich des wellenlängenabhängigen Brechungsindex haben, und an den von Wasser angepasst sein. Im Zeiss-Datenblatt steht doch alles bis auf die 4. Kommastelle.
https://files.pulchlorenz.de/zeiss_immersionsoele-pl.pdf?_gl=1*1eeoweo*_ga*MTUwMjM5NzQ3NS4xNzM4ODUxNzIx*_ga_V2X0YLJK3T*MTczOTEyMzI3NC4zLjAuMTczOTEyMzI3NC42MC4wLjA.

Hubert

Hallo Jakob,

da hast Du ja einiges an Daten zu dem Stoff zusammengetragen. Ich habe mir das nicht unmittelbar selbst zugelegt; das Fläschchen war dabei, als ich mir das Plan Neofluar 63/1.2 korr. gegönnt habe. Den Brechungsindex habe ich vom Etikett abgeschrieben.

Seid froh, dass das Zeug überhaupt noch verkauft wird. Ist ja schliesslich eine [PANIKMODUS] EWIGKEITSCHEMIKALIE!!! [/PANIKMODUS] und sicher bald verboten.
Dafür reichen 20 ml halt auch ewig.

Gruss
Florian

Werter Jürgen, werte Freunde des Referenzpräparats,

als ich vor Jahrzehnten in die Verlegenheit gekommen bin, von ungefärbtem Schnittmaterial (allerdings für PhaKo) Dauerpräparate anzufertigen, lag die Crux auch darin das Präparat (bereits fixiert) frisch geschnitten, ohne Trocknung mit einem geeigneten Einschlussmittel einzudecken. Ein hilfreicher Mitarbeiter, kurz vor der Pension, köchelte mit mir also dies nach einem dortigen "Hausrezept":
Wasserlösliches Einschlussmittel variabler Brechzahl für Phako (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=50885.new#new)
Leider sind, im Gegensatz zu meinem alten Laborbuch, weder die Schnitte noch Fotos erhalten geblieben, das Ergebnis ließ sich trotz der nicht allzu immensen Brechzahldifferenz (Medium 1,515)  ;)  sehr sehen, v.a. im Vergleich zu den entwässerten, xylol-behandelten eingedeckten Schnitten.
Beste Grüße Stefan

Hallo Jürgen,


Du schreibst,  Du suchst ein Präparat, dessen Brechungsindex so nah an dem des Eindeckmediums ist, so dass es im DIC und im JL nahezu unsichtbar ist. Nichts für ungut, aber das verstehe ich nicht!

Aus meiner Sicht braucht ein gutes Phasenobjekt klare Strukturen verschiedener Größe, sowie eine möglichst geringe Schichtstärke, die aber noch ausreichend für optische Schnitte ist, weshalb ich für meine Test aud DIK-eignung  ungefärbte histologische Präparate verwendet habe.

Weshalb denn nicht ganz einfach Zwiebelepidermis? Ein bekannt gutes Phasenobjekt!
(Frisch)-Präparate mit einer einzigen Zellschicht lassen sich mit geringstem Aufwand reproduzierbar herstellen.

Einlagig ist das Zellinnere im Hf nahezu unsichtbar, aber DIK, Phaco, Interphako (sehr schön farblich abgesetzte Strukturen!), und auch Df lassen sich damit gut vergleichen.
Da die Präparate jederzeit ,reproduzierbar' verfügbar sind, habe ich nie ein Dauerpräparat angefertigt. Insofern kann ich deren Eignung in Eindeckmedien nicht beurteilen.
Die Objektive, die ich als 'DIK' geeignet anhand histologischer Dauerpräparate bewertet habe, funktionieren auch mit Wasser und z.B. mit Malinol.

Viele Grüße und Erfolg bei der weiteren Suche, nach 'dem' Referenzpräparat.

Michael/M59

Hallo Michael,

das ist jetzt aber ein heftiges Missverständnis. Ich hatte nur beschrieben, dass mir mit den üblichen Harzen kein vernünftiges Dauerpräparat von Mundschleimhautzellen anfertigen konnte, da offensichtlich das Brechverhalten selbst im DIC und JL kein Erkennen der Zellen zuließ.

Hallo,

ich habe mit einem Glashohlkugel-Präparat von Jürgen, das er mir dankenswerterweise zur Verfügung gestellt hat, meine schiefe Beleuchtung mit einem Zeiss Plan 40/0.65 ebenfalls getestet. Ich finde jedenfalls dass bei diesem optischen Schnitt die schiefe Beleuchtung problemlos mit DIK mithalten kann (fokussiert auf rechte Kugel). Darunter ein Bild mit Fokusebene oberhalb der Kugeln.

Hohlkugel 3.jpg

Hohlkugel 1.jpg

Hubert

Hallo,
ein Aspekt der sowohl beim Komplex der Präparation/Fixierung/Einbettmedium wie auch im Vergleich zu nicht-Pol-basierten Techniken des Phasenkontrasts (wie der schiefen Beleuchtung) gerne unterschlagen wird:
der Aufbau von intakten biologischen Membranen.
Biomembranen bestehen aus Phospho- und Sphingolipiden und Cholesterin mit eingelagerten Transport- und Rezeptorproteinen.
Ähnlich wie Fibrillen und Mikrotubuli sind diese, wenn intakt, selbst schwach doppelbrechend.
Insbesondere entfettende Schritte der Präparation (EtOH, Xylol o.ä.), starke Trocknung oder gar Hitze verändert diese Membranen deutlich: der Kontrast von Zellmebran und Membranen intrazellulärer Stukturen verändert sich zum Schlechteren.
Auch den geringen, aber merklichen unterschiedlichen Bildeindruck, zwischen DIK und einer guten schiefen Beleuchtung bei vitalen oder schonend präparierten biologischen Objekten führe ich auf die diskreten Anisotropien durch intakte Biomembranen zurück.
Beste Grüße Stefan

Hallo,

am Samstag gab es aus der Veranstaltungsreihe ,,Videokonferenz Mikroskopie Hagen", von Jürgen Stahlschmidt einen Beitrag von Dr. Michael Zölffel
Sphärische Aberration- Das Phänomen und seine Unterdrückung in der Mikroskopie lebender Organismen

Dabei ging es hauptsächlich darum, dass der Abstand Objekt zum Deckglas entscheidend ist, um die Qualität vom Bild zu verbessern. Daneben spielt auch noch die exakte Deckglasdicke von 170µm eine Rolle.
Ich glaube auch, dass einige Verfahren dazu geführt haben nicht nur den Abstand zu vermindern, sondern auch die Beweglichkeit der Organismen zu verlangsamen, und auch deshalb bessere Bilder entstanden sind.
Z.B. wurde eine Art Gel verwendet. Ein Objektträger aufgelegt. Objektträger wurde entfernt, Probe aufgebracht. Das Objekt war deshalb sehr nahe am Deckglas und konnte sich vmtl. auch nicht mehr bewegen.
Als Steigerung gibt es noch ein Art "Daumenschraube"/mechanischer Drehring mit der sich der Abstand/Anpressdruck vom Deckglas einstellen läßt.

Alternativ, was jetzt hier nicht so interessant ist, war eine Methode wo ein Öltropfen, der schwerer/dichter ist als Wasser als Grundlage dient. Darauf wird ein Wassertropfen mit der Probe aufgebracht. Dann bildet sich ein dünner Wasserfilm direkt unter dem Deckglas.

Deshalb bräuchte es einen Keil oder eine Stufentreppe von 0-100µm. Die Frage ist halt nur wie.
Und dann müßte man noch Objekte, Markierungen, biologisches Material aufbringen, um etwas zu haben, wo man eine Aussage machen kann, wie stark sich das Bild dann durch zunehmende Dicke verschlechtert.

Liebe Grüße
Rudolf

Hallo,

bin über den Beitrag vom Kurt gestolpert.
https://www.focusstackingforum.de/t4858f34-NIKON-M-Plan-ELWD-am-Vollformat.html

Die Auflösung wird hier um so schlechter, um so mehr Schuppen übereinandergeschichtet sind. Scheinbar beeinflußt das darunterliegende Licht die Auflösung.
Ist es jetzt das Überstrahlen oder die Tatsache, dass nahegelegende Schichten, einander negativ beeinflußen?


2025-02-19 11_41_00-Mozilla Firefox.jpg

Die Auflösung kommt auch mit Abdunkeln nicht wieder.
2025-02-19 11_42_47-Affinity Photo.jpg


Liebe Grüße
Rudolf

Hallo Mitforisten,
An dieser Stelle erstmal noch ein großes Dankeschön an Jürgen für das zusenden der tollen Standardpräparate.
Hier die Bilder im Pluta-DIC:

Hohlkugeln:
IMG_20250302_231036.jpg

Vollglaskugeln:
IMG_20250302_231642.jpg

Bei beiden Aufnahmen handelt es sich bei dem Eindeckmittel um Histokitt. Objektiv war ein Nikon CFN 60 mit Apertur 1,4.Objektiv und Kondensor waren mit Öl immergiert.

Hier noch ein Video bei dem das obere Quarzprisma aus der mittleren Stellung heraus horizontal bis ganz nach aussen, und dann von dort wieder zurück bis an das andere Ende des Verstellbereichs verschoben wird:Bei Interesse kann ich auch gerne weitere Aufnahmen mit bestimmten Einstellungen, wie z.b. die anderen Prismen des Trommelrevolvers, oder verschiedene Höheneinstellungen des oberen Prismas nachreichen.
Herzliche Grüße Holger

Hallo,

ich habe mir erlaubt, aus dem 4. PDF-Dokument von Jürgen wo es um die "Tiefenschärfe" von Phasenkontrastverfahren geht, Bilder mit DIK, schiefer Beleuchtung und ringförmiger Beleuchtung zum Vergleich nebeneinander zu stellen. Phasenkontrast nach Zernike passt hier systembedingt nicht dazu, da es eigentlich nur für dünne Phasenobjekte gut funktioniert.

Ich habe die Bildhelligkeiten (speziell die RFB) zum besseren Vergleich noch auf ein ähnliches Niveau gebracht (nicht durch Kontrastveränderung sondern Verschiebung der mittleren Pixelhelligkeit).
Man sieht dass DIK hier einen etwas höheren Kontrast erzeugt als schiefe Beleuchtung. Allerdings hängt das auch von der Fokuslage ab, die nicht absolut identisch ist (es ist tatsächlich sehr schwierig, die exakt gleiche Fokuslage zu erreichen geht nach meiner Erfahrung nur durch eine Fotoserie).
Außerdem gibt es Unterschiede zwischen verschiedenen DIK-Systemen (Thema Auflösung-Kontrast), siehe Vergleich von Martin Kreutz 
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37743.msg277519;topicseen#msg277519
Und auch bei der schiefen Beleuchtung hängt der Kontrast sehr empfindlich von der Blendenkonstellation ab.

Tendenziell scheint DIK wie Jürgen schon erwähnt hat zusätzlich eine erkennbar bessere Trennung der Höhenschichten zu ermöglichen (geringere Tiefenschärfe mit geringerer Beeinflussung benachbarter Phasenobjekte). Das kann ein Vorteil sein, aber je nach Anwendung auch ein Nachteil. Auf jeden Fall grenzt sich die schiefe Beleuchtung mit optimaler Blende hier deutlich von anderen Kontrastverfahren-Varianten mit modifizierten Blenden ab, insbesondere von den konzentrischen Blendenformen wie ringförmige Beleuchtung, Dunkelfeld oder abgeblendete Kondensorapertur.
In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels und dadurch der stark erhöhte Einfluss der Interferenz durch Objektschichten außerhalb der Brennebene bzw. der normalen Tiefenschärfe. Das sieht man beim Beispiel ringförmiger Beleuchtung, aber noch stärker beim Dunkelfeld (was ja nichts anderes als eine ausgeprägte ringförmige Beleuchtung ist).
 
Schiefe Beleuchtung mit nur einseitig halbierter Ausleuchtung der Objektiv-NA hat dagegen eine nahezu optimal geringe Kohärenz der Beleuchtung, nur etwas schlechter als DIK. Wenn man die Bilder heraus zoomt und kleinste Details vergleicht (bei allen Problemen der Fokuslage) kann man sogar den Eindruck bekommen, dass die Objektauflösung der schiefen Beleuchtung minimal höher ist als DIK. Dagegen fällt die oft für diesen Zweck so gelobte ringförmige Beleuchtung bei der Auflösung drastisch ab.

Vergleich Fokus DIK SchB RFB.jpg

Hubert

Hallo Jürgen,
auch Dein 4.Teil (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=51148.0) ist sehr interessant geworden.
Die "Spiegelei-Kombi" aus kleiner Glaskugel und darunterliegendem flächigem Glassplitter zeigt die Ähnlichkeiten und Unterschiede bei den beiden Fokuslagen sehr gut.
Zur RFB habe ich irgendwie noch im Kopf, dass Du den Heine Kondensor verwendet hast, wenn ich nicht irre?
Wo lag denn der Lichtring/Innenradius ungefähr?
Beste Grüße Stefan

Hallo Stefan,

danke für den Kommentar.

Zur RFB: Verwendet habe ich als Objektiv den Zeiss-West Planapo 25/9,65 Ph2. Ich habe zwar den Heine versucht, aber der harmoniert irgendwie nicht richtig mit dem Objektiv. Daher habe ich die RFB mit der Phasenblende 3 am Revolverkondensor erzeugt.



Hallo Hubert,

auch Dir herzlichen Dank!
Das mit der einheitlichen Fokuslage ist wirklich schwierig, auch zumal sich sogar beim Wechseln der Kontrastmethode sich die korrekte Fokussierung leicht ändert, besonders ausgeprägt beim Wechsel von Hellfeld zum Phasenkontrast.

Hallo,


Der Artikel ist lesenswert.
(Thema Auflösung-Kontrast), siehe Vergleich von Martin Kreutz
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=37743.msg277519;topicseen#msg277519

ZitatDabei gibt es jedoch ein Problem! Je geringer die Aufspaltung der Teilstrahlen ist(High Resolution DIC), umso geringer ist auch der Kontrast.

ZitatWir betrachten es mit einem PlanApo 100X/1,4 Objektiv. Man darf erwarten, dass dieses Objektiv alle Strukturen in diesem Präparat auflöst, aber wir erkennen sie kaum, weil es ein reines Phasenobjekt ist.

A. Woran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?

Zitatu.a " Wie ich schnell gemerkt habe, eignet sich DIK-HR besonders gut für das fotografieren von vergleichsweise dicken Objekten mit vielen hochbrechenden Anteilen. Ein typisches Beispiel für diese Art von Objekten sind Rädertiere"

B. Kohärenz ist Voraussetzung für Interferenz, weil dann bei zwei Wellen die Frequenz und die räumliche Lage übereinstimmen. Die Phase kann unterschiedlich sein. Dann erfolgt Interferenz von Auslöschung bis Verstärkung.
Die Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.

Zitat" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"

Was ist damit gemeint?
Ich bin mir auch noch nicht sicher, ob ich das mit der Kohärenz verstanden haben.

C. Man sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?

Liebe Grüße
Rudolf

Hallo Rudolf,

über Deine Fragen könnte man viele Seiten schreiben.

ZitatWoran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?

Die geringe Tiefenschärfe von DIK kommt von der besonderen Methode der Kontrasterzeugung. Dabei werden zwei gleichen "Bilder", nur minimal gegeneinander versetzt (eigentlich das gleiche Objekt, nur optisch verschoben), überlagert. Der Bild-Helligkeitsverlauf entsteht also ausschließlich durch die Veränderung der örtlichen Phasenverschiebung innerhalb des geometrischen Bildversatzes. Die Interferenz von phasenverschobenen Wellen wird im normalen Hellfeld durch die hohe Intensität des homogenen Bildhintergrundes gestört, dieser ist aber bei den beiden verschobenen Bildern im DIK jeweils gleich und beeinflusst die relative Phasenänderung nicht.

Objekte außerhalb der Brennebene (oder genauer außerhalb der normalen Tiefenschärfe des Objektivs), die innerhalb des breiten Beleuchtungskegels oberhalb und unterhalb der Fokusebene liegen und damit ebenfalls in die Bildentstehung einfließen, beeinflussen aber beide versetzten Bilder (nahezu) auf die gleiche Weise. Denn die oben beschriebene geringe optische Bildversetzung ist sehr klein gegenüber der Breite des für beide Bilder gemeinsamen Beleuchtungskegels. D.h. dass diese Phasenverschiebungen für Objekte außerhalb der Brennebene (und innerhalb des für die Bildentstehung relevanten Beleuchtungskegels liegen) ebenfalls bei der Differenzbildung der beiden Bilder im DIK-Verfahren herausgemittelt werden und somit nicht als kontrastreiches Objekt erscheinen können.

ZitatDie Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.

Zitat" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"

Was ist damit gemeint?

Das komplexe Thema ganz verkürzt:
 
Es geht hier nicht um die zeitliche Kohärenz (als spektral engbandiges Licht), sondern um die räumliche Kohärenz. Die kann auch durch eine ausreichend kleine Lichtquelle erzeugt werden, solange der Ausbreitungswinkel zweier interferierender Wellen klein genug bleibt. Bei Kondensorbeleuchtung erzeugt jeder "Punkt" der Leuchtfläche in der vorderen Brennebene des Kondensors eine parallele Wellenfront. Die Lage des Punktes zur optischen Achse verändert lediglich den Winkel der Wellenfront zur Achse.

Eine einzelne solche Welle erzeugt am Objekt eine dazu kohärente gestreute Welle, beide interferieren im Bild nach dem Objektiv wieder miteinander und erzeugen eine Helligkeitsverteilung. Der Bildkontrast ist sehr gering (normales Hellfeld) wenn die Objektphasenverschiebung nicht sehr groß ist, weil die Hintergrundwelle (Beugung 0. Ordnung) in seiner Intensität dominiert und die gebeugte Welle 90° phasenverschoben ist. Ein schwaches Phasenobjekt außerhalb des Fokus wird interessanterweise kontrastreicher abgebildet, weil die Defokussierung zu einer zusätzlichen Phasenverschiebung führt und die Intensität, also den Objektkontrast, steigert (das kann jeder aufmerksame Mikroskopiker bei dünnen Objekten beobachten). Daher wird bei hochgradig kohärenter Beleuchtung auch jedes Staubkörnchen deutlich außerhalb der Fokusebene kontrastreicht als Störung abgebildet.

Jeder weitere "Punkt" der betrachteten Leuchtfläche vor dem Kondensor erzeugt ein ähnliches Interferenzbild, das durch den unterschiedlichen Welleneinfallswinkel aber in der Interferenzstruktur abweicht. Diese "Leuchtpunkte" sind jedoch nicht kohärent, haben keine feste Phasenbeziehung zueinander. D.h. alle diese Interferenzbilder in der Bildebene interferieren nicht konstruktiv mit ihrer Wellenamplitude, sondern addieren sich lediglich mit ihrer Intensität. Es entsteht eine Mittelung der Interferenzbilder der verschiedenen Beleuchtungswinkel, die starke Kohärenzwirkung der Einzelwelle wird zunehmend abgeschwächt. Wenn man den maximalen Beleuchtungswinkel verwendet (NA_Kondensor = NA_Objektiv) ist die gesamte Bildentstehung inkohärent und der Bildkontrast von Phasenobjekten am geringsten. Speziell die zusätzliche Phasenverschiebung von Objekten außerhalb der Fokusebene wird herausgemittelt und diese dadurch weniger sichtbar.

Daraus folgt, dass eine Beleuchtung mit teilweise reduziertem Beleuchtungswinkel wie z.B. ein zentral abgeblendeter Kondensor oder eine ringförmige Beleuchtung bezüglich der Interferenzeffekte bei der Bildentstehung zumindest teilweise kohärent sind im Vergleich zu einem voll aufgeblendeten Kondensor. Und damit entsteht auch die kontrastreichere Abbildung von außerhalb der Brennebene liegenden Phasenobjekten.

Beim Phasenkontrastverfahren nach Zernike hat man durch die ringförmige Blende ebenfalls eine erhöhte Kohärenz bei der Abbildung und auch die bekannte geringe Selektivität der Phasendarstellung in der Objekttiefe. Der erhöhte Bildkontrast gegenüber normalem Hellfeld entsteht durch die Abschwächung der im Normalfall zu intensiven 0. Beugungsordung mit Hilfe der Phasenblende sowie dessen Phasenverschiebung um etwa ±90° (je nach System).

ZitatMan sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?

Die letzte Frage ist doch etwas ungewöhnlich, denn hier geht es dauernd um Bildbeispiele von Phasenobjektien, auch genügend Vergleichsbilder zwischen DIK und schiefer Beleuchtung. ::)
Ich spare mir jetzt Erläuterungen dazu, hier gibt es eine (sicher nicht einfach verständliche) mathematische Beschreibung der Funktion der schiefen Beleuchtung
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40948.msg301649;topicseen#msg301649

oder Du liest besser den ganzen Beitrag von Anfang an durch. Eine einfache bildhafte Beschreibung mit wenigen Sätzen, wie ich sie aus einigen Artikeln kenne, führt regelmäßig zu falschen physikalischen Begründungen.

Hubert

Hallo Hubert,
harter Stoff, ich bin noch am Grübeln. Auf jeden Fall vielen Dank für die Antwort.
Wird wohl noch Zeit brauchen bis ich da durchsteige.


Zitat: Woran liegt es eigentlich, dass DIC eine geringere Tiefenschärfe hat?
zwei gleiche "Bilder"werden nur minimal gegeneinander versetzt
--> 
das ist von Dir anschaulich dargestellt mit einem Bildbearbeitungsprogramm wo zwei Bilder auf zwei Ebenen verschoben werden.


Der Bild-Helligkeitsverlauf entsteht also ausschließlich durch die Veränderung der örtlichen Phasenverschiebung innerhalb des geometrischen Bildversatzes. Die Interferenz von phasenverschobenen Wellen wird im normalen Hellfeld durch die hohe Intensität des homogenen Bildhintergrundes gestört, dieser ist aber bei den beiden verschobenen Bildern im DIK jeweils gleich und beeinflusst die relative Phasenänderung nicht.

Objekte außerhalb der Brennebene (oder genauer außerhalb der normalen Tiefenschärfe des Objektivs), die innerhalb des breiten Beleuchtungskegels oberhalb und unterhalb der Fokusebene liegen und damit ebenfalls in die Bildentstehung einfließen, beeinflussen aber beide versetzten Bilder (nahezu) auf die gleiche Weise. Denn die oben beschriebene geringe optische Bildversetzung ist sehr klein gegenüber der Breite des für beide Bilder gemeinsamen Beleuchtungskegels. D.h. dass diese Phasenverschiebungen für Objekte außerhalb der Brennebene (und innerhalb des für die Bildentstehung relevanten Beleuchtungskegels liegen) ebenfalls bei der Differenzbildung der beiden Bilder im DIK-Verfahren herausgemittelt werden(Deshalb Differenzkontrast/Differential) und somit nicht als kontrastreiches Objekt erscheinen können.
--> 
Ich stelle mir das so wie bei einem Operationsverstärker vor, der als Instrumentenverstärker arbeitet.
Auch hier werden die gleichteiligen Anteile nicht verstärkt.

-->
Ich frage mich gerade, ob man die Trennung/Ablenkung auch ohne Prisma hinkriegen könnte. Und dann werden die beiden Bilder gegeneinander abgezogen. Die Differenz wird in einem Bildbearbeitungsprogramm gebildet.



Zitat: Die Kohärenzlänge scheint sehr kurz zu sein, wenn es sich nicht um Laserlicht oder Licht von fremden Sternen handelt.
Zitat" In diesen Fällen ist das Problem die erhöhte Kohärenz durch die Einengung des Beleuchtungswinkels"
Was ist damit gemeint?
Das komplexe Thema ganz verkürzt:
 
Es geht hier nicht um die zeitliche Kohärenz (als spektral engbandiges Licht), sondern um die räumliche Kohärenz. Die kann auch durch eine ausreichend kleine Lichtquelle erzeugt werden, solange der Ausbreitungswinkel zweier interferierender Wellen klein genug bleibt. Bei Kondensorbeleuchtung erzeugt jeder "Punkt" der Leuchtfläche in der vorderen Brennebene des Kondensors eine parallele Wellenfront. Die Lage des Punktes zur optischen Achse verändert lediglich den Winkel der Wellenfront zur Achse.

Eine einzelne solche Welle erzeugt am Objekt eine dazu kohärente gestreute Welle, beide interferieren im Bild nach dem Objektiv wieder miteinander und erzeugen eine Helligkeitsverteilung. Der Bildkontrast ist sehr gering (normales Hellfeld) wenn die Objektphasenverschiebung nicht sehr groß ist, weil die Hintergrundwelle (Beugung 0. Ordnung) in seiner Intensität dominiert und die gebeugte Welle 90° phasenverschoben ist.
--> 
wird wohl so sein. Da hakt es bei mir noch.

Ein schwaches Phasenobjekt außerhalb des Fokus wird interessanterweise kontrastreicher abgebildet, weil die Defokussierung zu einer zusätzlichen Phasenverschiebung führt und die Intensität, also den Objektkontrast, steigert (das kann jeder aufmerksame Mikroskopiker bei dünnen Objekten beobachten).
Daher wird bei hochgradig kohärenter Beleuchtung auch jedes Staubkörnchen deutlich außerhalb der Fokusebene kontrastreicht als Störung abgebildet.
--> 
ist mir bei Bakterien aufgefallen. Der Kontrast wird  stärker, wenn sie nicht im Fokus sind.

 

Jeder weitere "Punkt" der betrachteten Leuchtfläche vor dem Kondensor erzeugt ein ähnliches Interferenzbild, das durch den unterschiedlichen Welleneinfallswinkel aber in der Interferenzstruktur abweicht. Diese "Leuchtpunkte" sind jedoch nicht kohärent, haben keine feste Phasenbeziehung zueinander. D.h. alle diese Interferenzbilder in der Bildebene interferieren nicht konstruktiv mit ihrer Wellenamplitude, sondern addieren sich lediglich mit ihrer Intensität. Es entsteht eine Mittelung der Interferenzbilder der verschiedenen Beleuchtungswinkel, die starke Kohärenzwirkung der Einzelwelle wird zunehmend abgeschwächt. Wenn man den maximalen Beleuchtungswinkel verwendet (NAKondensor = NAObjektiv) ist die gesamte Bildentstehung inkohärent und der Bildkontrast von Phasenobjekten am geringsten. Speziell die zusätzliche Phasenverschiebung von Objekten außerhalb der Fokusebene wird herausgemittelt und diese dadurch weniger sichtbar.
--> 
Ich bin noch am Rätseln, aber dann wäre ein optimal eingestelltes Mikroskop bei durchsichtigen Phasenobjekten kontraproduktiv. Nur bei gefärbten Präparaten würde sich eine Auflösungserhöhung ergeben, weil die Intensität steigt.
Kann man dann sagen, dass kurze Laufzeiten im Zentrum zur räumlichen Kohärenz und damit zu einer verstärkenden Interferenz führen. Die Außenbereiche nicht. Diese mitteln sich aus und werden deshalb durch zuziehen der Aperturblende ausgeklammert?
All diese Verfahren verringern die Licht-Intensität.

Daraus folgt, dass eine Beleuchtung mit teilweise reduziertem Beleuchtungswinkel wie z.B. ein zentral abgeblendeter Kondensor oder eine ringförmige Beleuchtung bezüglich der Interferenzeffekte bei der Bildentstehung zumindest teilweise kohärent sind im Vergleich zu einem voll aufgeblendeten Kondensor. Und damit entsteht auch die kontrastreichere Abbildung von außerhalb der Brennebene liegenden Phasenobjekten.

Beim Phasenkontrastverfahren nach Zernike hat man durch die ringförmige Blende ebenfalls eine erhöhte Kohärenz bei der Abbildung und auch die bekannte geringe Selektivität der Phasendarstellung in der Objekttiefe. Der erhöhte Bildkontrast gegenüber normalem Hellfeld entsteht durch die Abschwächung der im Normalfall zu intensiven 0. Beugungsordung mit Hilfe der Phasenblende sowie dessen Phasenverschiebung um etwa ±90° (je nach System).



ZitatMan sagt ja, bei der schiefen Beleuchtung kommen mehr Maxima ins Objektiv, weil der Strahlengang aus dem Zentrum verschoben wurde. Das ergibt eine seitige Erhöhung der Auflösung. Warum funktioniert die schiefe Beleuchtung bei Phasenobjekten überhaupt. Wie soll es etwas schärfer werden, wenn es keinen Kontrast hat.
Kann die schiefe Beleuchtung dann doch Phasenobjekte auflösen ?
Die letzte Frage ist doch etwas ungewöhnlich, denn hier geht es dauernd um Bildbeispiele von Phasenobjektien, auch genügend Vergleichsbilder zwischen DIK und schiefer Beleuchtung. 
Ich spare mir jetzt Erläuterungen dazu, hier gibt es eine (sicher nicht einfach verständliche) mathematische Beschreibung der Funktion der schiefen Beleuchtung
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40948.msg301649;topicseen#msg301649

oder Du liest besser den ganzen Beitrag von Anfang an durch. Eine einfache bildhafte Beschreibung mit wenigen Sätzen, wie ich sie aus einigen Artikeln kenne, führt regelmäßig zu falschen physikalischen Begründungen.

--> 
Schiefe Beleuchtung, viele Formeln: da habe ich noch was vor.
"Die eigentliche Bedeutung der schiefen Beleuchtung liegt in seiner Wirkung als Phasenkontrastverfahren."
das nehme ich mal so mit"

Vielen Dank auf jeden Fall für die Antworten.

Liebe Grüße
Rudolf