Hallo zusammen,
habe gerade Teil 3 zu den Glaskügelchen als Testpräparat eingestellt: Ein Vgl. von Histokitt und Canadabalsam als Eindeckmedien. Habe das vorgezogen, da ich die Unterschiede durchaus beeindruckend fand.
Hier der Link:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=50973.0
Teil 2 wird nachgereicht
Hallo,
ein Problem bei diesen Tests ist, dass bei Phasenobjekten die Kontrastdarstellung sehr stark von der Fokussierung abhängt. Hier ein Beispiel mit schiefer Beleuchtung, Glaskugeln in Histokitt. Die Fokuslage wurde kontinuierlich, aber jeweils nur sehr gering verändert, die Randschärfe und Kontrastdarstellung ändert sich deutlich (starke Ausschnittvergrößerung). Man kommt eigentlich nie ohne eine Fokusserie aus.
Glaskugeln Histokitt Fokusserie.jpg
Dieser Vergleich zwischen DIK und schiefer Beleuchtung aus Jürgens Aufnahmen zeigt zwar einen deutlich höheren Kontrast bei DIK, aber auch hier dürften sich die Verhältnisse noch etwas ändern wenn die Fokuslage identisch wäre.
Vergleich Glaskugeln DIK SchBel Histokitt 3x.jpg
PS: Ich habe mit Erstaunen festgestellt, dass meine relativ neue Adobe-Version jetzt auch mit KI ausgestattet ist. Hier das Ergebnis verschiedener Bildbeschreibungen (automatisch wenn man mit Cursor auf das Bild geht). Z.T. sehr kreativ, speziell das Erkennen von Teilen des Universums. :)
KI-Text.jpg
Hubert
Hallo Hubert,
das mit der Fokuslage ist natürlich absolut richtig. Beim Mikroskopieren spielen wir ja auch nicht umsonst ständig mit dem Feintrieb. In Teil 3 ging es mir darum, den allgemeinen Kontrastunterschied zwischen den beiden Medien aufzuzeigen, der ja theoretisch zu erwarten ist, mich aber in der Stärke doch recht überrascht hat. Die Aufnahmen zeigen durchaus den Unterschied in der Kontrastierung, den man auch visuell wahrnimmt.
Ja, ja, die KI; hat die auch Romulaner gefunden?
Hallo Jürgen,
die primäre Demonstration des Kontrastunterschiedes zwischen den verschiedenen Einbettmedien ist mir schon bewusst. Mich persönlich interessiert aber auch der qualitative Vergleich zwischen DIK und schiefer Beleuchtung. Dabei ist eine optimale Einstellung der schiefen Beleuchtung wichtig. Mein Eindruck ist dass Deine schiefe Beleuchtung eventuell noch etwas verbessert werden kann, zumindest darf kein Hintergrund-Helligkeitsgradient auftreten.
Hubert
Hallo Hubert,
dass Dich schiefe Beleuchtung besonders interessiert im Vgl. zum DIC, ist mir klar; die Technik ist da bei mir sicher noch dtl. verbesserungsfähig, habe mich nicht so intensiv beschäftigt, da mir ja DIC zur Verfügung steht (sic!). Meine Methode ist einfach, die Revolverscheibe des Kondensors aus der Mittelstellung herauszudrehen; da habe ich etwas übertrieben, deshalb der Gradient. M.E. die beste schiefe Beleuchtung, wohl auch unter Zuhilfenahme pol-optischer Teile, hat Bernd (Nomarski) im Österreichischen Forum etabliert, wobei ich bis heute noch nicht verstanden habe, wie er das bewerkstelligt, seine Angaben sind da auch etwas kryptisch.
Hallo Jürgen,
ZitatM.E. die beste schiefe Beleuchtung, wohl auch unter Zuhilfenahme pol-optischer Teile, hat Bernd (Nomarski) im Österreichischen Forum etabliert, wobei ich bis heute noch nicht verstanden habe, wie er das bewerkstelligt, seine Angaben sind da auch etwas kryptisch.
kannst Du da einen Link zu einem Beispiel zeigen? Durch Verwendung von Polfiltern u.ä. wird das Bild aufgrund der Objekt-Anisotropie beeinflusst und verändert. Das kann man machen wenn man diese auch sichtbar machen will. Der eigentliche Vorteil von optimaler schiefer Beleuchtung ist jedoch die möglichst objektgetreue, neutrale differentielle Phasendarstellung.
Hubert
Hallo Jürgen,
ich habe zwei Bitten:
1. da Du Hand und Auge am Mikroskop warst, kurz Deine Eindrücke der Unterschiede zu schildern und
2. die Deines Erachtens nach geeignetsten Detailaufnahmen von einzelnen Glaskügelchen nebeneinander zustellen (Kacheln auf einer Seite).
Bitte nicht missverstehen, aber Deine viele Arbeit damit würde sicherlich noch zusätzlich gewinnen.
Mal den JL aussen vor, habe ich jenseits des Phasenkontrast mir etwas schwer getan zwischen Effekten der Kontrastverfahren und Phaseneffekten von geringsten Defokussierungen, auch durch Lage der Kügelchen im Präparat, zu unterscheiden.
Beste Grüße Stefan
Hallo Hubert,
an die vor über 10 Jahren, hier teils heiß und nicht immer gesitteten Diskussionen um die oben erwähnten DIC(K)en Methoden ((hier ein Bsp:) (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=15588.0) kann ich mich noch erinnern ::). Immerhin waren sie damals Anstoss mich nach Jahren wieder damit näher zu befassen, was ich bis heute gerne mache.
Viele der damals hier oft nur kryptisch erläuterten Methoden, beruhen zu den Effekten der kondensorseitigen schiefen Beleuchtung, auf jenen die auch objektivseitig das "Trägersignal" modulieren (sowie zB beim Hoffmans Modulationskontrast oder Ellis single-sideband edge-enhancement). Immer mit Amplitudenminderung (zumind. eines Teils) der zentralen Ordnung. Ob durch un- oder halbdurchlässige Blenden oder wie bei Ellis mittels variabler Filter: Polfilter mit Retarder, welche hier beide über dem Objektiv liegen und eher als variabler Lichtfilter fungieren.
Dazu gäbe es noch viel mehr auszuführen, die Modulation der schiefen Beleuchtung wäre sicher eine ganze Serie von Fäden wert ;)
Insbesonders bei Verwendung höherer und höchster Aperturen kann so durch Modulation eine "Verfälschung" der Darstellung vermieden werden. (Saylor 1935 (https://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/jres/15/jresv15n3p277_A1b.pdf), beschreibt hierzu einfach eine zweite, gerade Blende objektivseitig und führt dies weiter aus)
Beste Grüße Stefan
Hallo Stefan,
Zu 1: Bei den DIC-Aufnahmen sind zwischen den beiden Bildern weder die Blenden noch die Prismenstellungen verändert worden (zu erkennen an der Position des Überganges in den dunkleren Bereich Richtung rechter oberer Ecke. Der Kontrast ist durchweg bei Canadabalsam dtl. schlechter als bei Histokitt; selbst durch Spielen mit der Prismenverstellung konnte ich das nicht verbessern. Auch der Pseudostereo-Effekt ist mit Canadabalsam erheblich herabgesetzt.
Ähnlich ging es mir mit der schiefen Beleuchtung. Auch hier keine Änderung des Blendendurchmessers oder der Blendenposition zwischen den Aufnahmen (wie beim DIC sieht man das auch hier am Übergang Hell-Dunkel). Die Kugeln sind teilweise überhaupt nicht zu erkennen, am deutlichsten natürlich im Hell-Dunkel-Übergang.
Im Phasenkontrast ist der Unterschied am ausgeprägtesten: Während mit Histokitt die kleinsten Elemente nahezu schwarz kontrastiert werden, zeigen sie sich in Canadabalsam lediglich in einem zart helleren Kontrast auf dunklerem Grund.
Die ringförmige Beleuchtung stellt m.E. hier eine Ausnahme dar: Im Canadabalsam sind die Kugeln besser sichtbar als in Histokitt, die Beugungsartefakte sind stärker.
Für Dunkelfeld konnte ich keinen relevanten Unterschied sehen.
Im Jamin Lebedeff war für mich der Unterschied ziemlich frappant: Kontrastierung sehr schwer zu gewinnen, Interferenzfarbe sehr flau im Canadabalsam.
Zu 2: Ich kann versuchen, solche Kacheln zu erstellen, indem ich im jeweiligen Präparat ähnlich große Kugeln heraussuche und ablichte.
Hallo Hubert,
Stefan hat den alten Faden mit Bildbeispielen schneller gefunden als ich.
Hallo Stefan,
ZitatDazu gäbe es noch viel mehr auszuführen, die Modulation der schiefen Beleuchtung wäre sicher eine ganze Serie von Fäden wert ;)
ich würde mich an diesen Fäden wohl nicht beteiligen, denn ich habe da eine einfache und begründete Meinung dazu: Diese ganzen Varianten sind nur eine nette Spielerei für den Sonntag Nachmittag, vielleicht in Einzelfällen ganz interessant weil das Objekt endlich einmal ganz anders aussieht ;) . Was soll denn der Vorteil sein, physikalisch? Ganz offensichtlich ist auch, dass keine praktische Anwendung solcher Verfahren stattfindet - einfach weil so ein Bild nicht wirklich aussagefähig ist. Ich kann z.B. in dem verlinkten Beitrag von Nomarski nicht erkennen was der neue Erkenntnisgewinn ist.
Was ist denn der Sinn von Phasenkontrastverfahren? Das sollte man erst einmal für sich klären.
ZitatInsbesonders bei Verwendung höherer und höchster Aperturen kann so durch Modulation eine "Verfälschung" der Darstellung vermieden werden. (Saylor 1935 ...
Ich habe den Artikel nur angelesen, aber da geht es um ein ganz anderes Thema, nämlich die Bestimmung von Brechungsindizes und die dabei erreichbare Genauigkeit.
Hubert
Hallo Jürgen,
Dank Dir für Deine Erläuterungen, es deckt sich großteils mit meinen Eindrücken (nach wiederholtem reinzoomen und scrollen).
Da dich ja in diesem Teil v.a. der Einfluss der Medien unterschiedlicher Brechzahl beschäftigen, nur kurz der Hinweis auf die mögliche Verwendung auch des Grenzdunkelfeldes mittels Heine Kondensor als Ersatz fürs 'dispersion staining' wie Olaf es hier (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=50424.msg368574#msg368574) neulich beschrieben hat.
Beste Grüße Stefan
Hallo Hubert,
nun ja, zuerst einmal zur Klarstellung, weder habe ich den oben verlikten alten Faden besonders herausgestellt oder wollte gar an alte Mißtöne anknüpfen.
Vielmehr will ich immer noch zur Diskussion stellen, in wie weit bei schiefer Beleuchtung oder Schlierenverfahren wie dem Hoffmanschen Modulationskontrast (HMK) oder etwas einfacher gehaltenen ähnlichen Aufbauten, zur Kontraststeigerung eine (teil-)absorbierende Schicht im oberen Strahlengang von Nutzen sein kann.
Da Du dies so einfach vom Tisch wischt, nur kurz abschließend hierzu:
- sei versichert, es benutzen werktags 8 to 5 mehr Arbeitende im biomedizinischen Bereich PlasDIC oder den HMK, bei z.B. der künstlichen Befruchtung, Zellsortage oder patchclamping-Verfahren als die schiefen Beleuchtung.
- dies als unphysikalisch zu diskreditieren wundert mich dann doch sehr, bereits bei Abbe in Jena wurde mit berußten oder metallbedampften Streifen zur Modulation des nicht gebeugten Lichts zur Kontraststeigerung gearbeitet, Zernike hat dies bereits bei seinen ersten Phasenkontrastversuchen mit streifenförmigen Blenden und Phasenplatten gemacht, Hoffman verwendete diese und auch in der modernen Literatur findet sich zB von Jerome Mertz (Introduction to Optical Microscopy, S 193ff) etwas über die Vorzüge einer vollständig absorbierenden zweiten Blende objektivseitig, er nennt es Graded-field microscopy with white light (https://www.researchgate.net/publication/26282823_Graded-field_microscopy_with_white_light)
Grüße Stefan
Hallo Stefan,
Zitatnun ja, zuerst einmal zur Klarstellung, weder habe ich den oben verlikten alten Faden besonders herausgestellt oder wollte gar an alte Mißtöne anknüpfen.
ich habe die Verlinkung auch nicht als Deine persönliche Hervorhebung des Inhalts verstanden, erkenne aber eigentlich auch dort keine Misstöne.
ZitatVielmehr will ich immer noch zur Diskussion stellen, in wie weit bei schiefer Beleuchtung oder Schlierenverfahren wie dem Hoffmanschen Modulationskontrast (HMK) oder etwas einfacher gehaltenen ähnlichen Aufbauten, zur Kontraststeigerung eine (teil-)absorbierende Schicht im oberen Strahlengang von Nutzen sein kann.
Da Du dies so einfach vom Tisch wischt....
Bei meiner Bemerkung dass keine praktische Anwendung solcher Verfahren stattfindet habe ich mich natürlich auf die diversen Varianten aus Veröffentlichungen bezogen die es dazu gibt, wie z.B. VHDK. Mir ist durchaus bekannt dass z.B. HMK kommerziell angeboten wird. Vermutlich wird da die zusätzliche Möglichkeit vermarktet, bis hin zum Dunkelfeld einstellbar zu sein. Oder weil eine fest installierte Variante von schiefer Beleuchtung als zu primitiv erscheint und sich dadurch nicht verkaufen lässt?
Unphysikalisch sind für mich solche Veröffentlichungen von Verfahren dann, wenn
nicht entweder theoretisch oder praktisch (am besten beides) die konkrete Wirkung auf das Phasenobjekt gezeigt wird und wie man aus dem sich ergebenden Mikroskopbild besser auf die Objektstruktur schließen kann. Dass Abbe oder Zernike mit Blenden Versuche gemacht haben (die nicht weiter verfolgt wurden), spricht nicht dagegen. Auch die verlinkte Veröffentlichung von Mertz beschreibt lediglich die beiden Möglichkeiten, aus der Achse seitlich verschobene Blenden entweder kondensorseitig oder objektivseitig oder gleichzeitig einzusetzen, mit allgemein formulierter Problematik der Beeinflussung von Auflösung und Kontrast.
Ich habe ja nicht bestritten dass sich einige Wissenschaftler mit dem Thema beschäftigen, aber ich würde auch gerne konkrete Ergebnisse und Vergleiche mit Phasenkontrastverfahren ähnlicher Bildwirkung in den Arbeitspapieren sehen. Ich kenne jedenfalls keine Veröffentlichung (gerne auch von Nichtwissenschaftlern), die z.B. die Vorzüge von HMK o.ä. gegenüber der optimalen schiefen Beleuchtung bezüglich Kontrastdarstellung und Auflösung zeigen. Was mich an den Veröffentlichungen auch stört ist, dass praktisch keine Auseinandersetzung mit dem Problem von Artefakten durch dicke Phasenobjekte bei erhöhter Kohärenz der Beleuchtung erfolgt.
Mit diversen Blendenformen habe ich mich durchaus schon rechnerisch (numerisch) auseinander gesetzt. Es verhält sich ähnlich wie die Heisenbergsche Unschärferelation, wenn ich an einer Stelle etwas durch Blenden stark einenge oder örtlich durch Absorption dämpfe, dann erhalte ich an anderer Stelle als Ergebnis eine Verbreiterung oder einen selektiven Intensitätsanstieg.....
Hubert
Hallo zusammen,
Modulationskontrast-Verfahren im Eigenbau:
für das Selbermachen einer Einrichtung für den Hoffmanschen Modulationskontrast gibt es eine Anleitung im Mikrokosmos 1983 (https://www.zobodat.at/pdf/Mikrokosmos_72_0001.pdf) (das ist der gesamte Jahrgang, mit einer Textsuche nach ,,Modulation ..." findet man den Beitrag rasch), die von Peter Hoffmann verfasst wurde.
Ich meine, dass man mit der Anleitung zurecht kommen kann. Vielleicht ist statt Planfilm Rollfilm sinnvoller. Ein Vorschlag:
https://www.fotoimpex.de/shop/filme/washi-w-rollfilm-25-iso.html?gad_source=1&gclid=CjwKCAiAiOa9BhBqEiwABCdG89nhqPCxrodBNZG50wNPZbgwq-q0XUW8dhSxRM2UwGs3DdFi97rQJBoCc54QAvD_BwE
Das Hantieren muss unter sehr schwachem Rotlicht (LED, Improvisieren ...) erfolgen. Man könnte einen Streifen abschneiden, der, falls störend gewölbt, ggf. durch behutsames Biegen etwas geglättet werden kann. Rollfilme sind 60 mm breit UND ein Rollfilm kostet im Gegensatz zu Packungen mit Planfilm nur paar Euro.
Entwickler und Fixierer sind nicht teuer (bietet der oben verlinkte Händler auch an). Flache Schalen sind fürs Entwickeln ideal, aber es könnte sich auch mit größeren Petrischalen gut machen lassen (es gibt übrigens auch quadratische solche). Nur paarmal ganz, ganz leichtes Schwenken während des Entwickler- bzw. Fixierbades kann helfen.
Selbst für Personen, die nie etwas mit Entwicklung von Filmmaterial zu tun hatten, sollte das Vorgehen einfach sein. Insbesondere für Mikroskopiker, die ohnehin den Umgang mit Reagenzien gewöhnt sind.
Soweit ein paar Überlegungen zum Fertigen des Modulators. Die Anleitung für das Herstellen der Spaltblende erscheint mir als durchaus nachvollziehbar.
Vielleicht interessiert es ja einige unter Euch.
Liebe Grüße
Jakob
Hallo Hubert,
Dank Dir, auf der Basis finde ich kann man sich wieder unterhalten, woran mir durchaus gelegen ist, da ich Deine Beiträge sonst sehr schätze.
Beste Grüße Stefan
Hallo Stefan,
Du hast vielleicht Aussagen falsch interpretiert, auch wenn ich die Formulierung "Spielerei" u.ä. bewusst provokant gewählt habe. Das bezog sich auf andere Personen.
Ich kenne einige wissenschaftliche Arbeiten zum Thema Hoffman-Kontrast, und die Inhalte sind z.T. ernüchternd unergiebig (höflich formuliert). Interessant ist z.B., dass da regemäßig das Modulationskontrast-Verfahren als gute preiswerte Alternative zu DIK angepriesen wird, dass dieses aber nur eine kompliziertere Variante schiefer Beleuchtung ist wird nicht erwähnt - als wäre letztere den Autoren nicht bekannt.
Hoffman selbst hat in seinem Patent kein Wort über die schiefe Beleuchtung verloren, es wird lediglich auf Zernike-Phasenkontrast und Interferenzkontrast Bezug genommen: "There exists a number of specialized microscopes which enable a user to view such phase objects. Such devices are referred to in the prior art as phase-contrast microscopes and interference microscopes. .... The present invention overcomes the limitations of the phase contrast microscope and the interference microscope. Objects are rendered visible in a simpler manner, utilizing less expensive components." Das ist m.E. sehr ungewöhnlich, denn es ist absolut üblich ähnliche bekannte Verfahren in der Patentanmeldung zu erwähnen.
Zumindest in der Patentgrafik sieht man schematisch, dass das Verfahren zu einem unsymmetrischen differentiellen Phasenkontrast tendiert (im Gegensatz zum DIK), was m.E. ein erheblicher Nachteil ist weil es eben nicht zu einer korrekt interpretierbaren Objektstruktur führt.
Modulationskontrast Hoffman Patentgrafik.jpg
Wie erwähnt hatte ich vor längerer Zeit auch den Modulationskontrast nach Hoffman zumindest grob, bezüglich seiner prinzipiellen Funktion, durch Berechnungen simuliert. Hier einige Grafiken, die den schematischen Intensitätsverlauf des Mikroskop-Bildes für ein einfaches, linsenförmiges Phasenobjekte mit verschiedenen Transmissionsgraden des zentralen Spalts (Nr. 19 im Patent) der Modulatorblende demonstrieren. Ein typischer Wert wird oft mit 15% Transmission angegeben, wie man sieht entsteht dadurch eine starke, falsche Asymmetrie des differentiellen Phasenverlaufes.
T = 0% (erste Grafik) entspricht einer Art Dunkelfeld weil hier das Beugungsbild 0. Ordnung ausgeblendet ist, mit T etwa zwischen 50% und 100% entsteht dagegen "normale schiefe Beleuchtung", jedoch hier durch reine objektivseitige Halbblende - mit ziemlich symmetrisch-differentiellen Phasenverlauf wie es eigentlich sein soll. Bei den Berechnungen ist die Beleuchtungs-Spaltblende abweichend von der üblichen realen Anwendung nahezu unverschoben zur Achse. Ich wollte den reinen Effekt der Modulatorblende sehen. Mit außeraxial versetzter Blende überlagern sich die Effekte durch beleuchtungsseitige schiefe Beleuchtung und Modulatorblende natürlich. Ein wesentlicher Effekt des absorbierenden zentralen Modulatorspalts besteht darin, den Bildhintergrund abzudunkeln.
Modulationskontrast Hoffman Vergleich Modulatortransmission 0% 15% 30% 60% 100%.jpg
Es wäre jedenfalls eine gute Anwendungsmöglichkeit für ein Standardpräparat mit definierten symmetrischen und stetig verlaufenden Phasenverschiebungen, also z.B. mit Glaskugeln, die sich ergebende Intensitätsverteilung des Phasenverlaufs in einem Modulationskontrastmikroskop nach Hoffman zu untersuchen. Vielleicht findet sich jemand der es in Anwendung hat, mit Interesse daran.
Hubert
Hubert schreibt: "Ich kenne einige wissenschaftliche Arbeiten zum Thema Hoffman-Kontrast, und die Inhalte sind z.T. ernüchternd unergiebig (höflich formuliert)". Das habe ich auch so empfunden, als ich mich vor einiger Zeit mit dem Hoffman-Kontrast beschäftigt habe.
Vielleicht ist aber für den einen oder anderen Interessierten die Ausarbeitung auf meiner Internetseite zum Hoffman-Kontrast etwas erhellend. Ich gebe zu, dass es die Arbeit eines im Grunde "optischen Laien" ist, der aber einen Hang zum mikroskoptechnischen Basteln hat. Hubert hat mir auch in verschiedenen unklaren Punkten Hilfestellungen gegeben.
Wenn ich ein entsprechendes Präparat hätte, oder anfertigen könnte, würde ich auch einmal fotografieren.
Und hier der Link zu meiner virenfreien Seite, auf der man das PDF herunterladen kann.
https://www.mikroskoptechnik-hagen.de/mikroskoptechnik.htm
Beste Grüße von Jürgen aus Hagen
Hallo Jürgen,
ZitatWenn ich ein entsprechendes Präparat hätte, oder anfertigen könnte, würde ich auch einmal fotografieren.
ich könnte Dir Glaskugeln zur Verfügung stellen, nachdem ich von Jürgen (B.) einen Teil seiner Bestellung erhalten habe. Mit Standard-Immersionsöl mit n=1.515 lässt sich dann leicht ein reproduzierbares Präparat anfertigen, das einen ziemlich geringen Brechzahlunterschied zu den Glaskugeln aufweist. Der geringe Phasenunterschied ist aber gut um eine empfindliche vergleichende Messung der Kontrasteigenschaften des Phasenkontrastverfahrens zu machen.
Hubert
Hallo Jürgen, hallo Hubert,
habe so viel von dem Zeug, da schicke ich gerne etwas an Junio, gerne auch Präparate in Histokitt und Canadabalsam.
Hallo Hubert und Jürgen,
danke für Euer Angebot. Ich schreibe meine Adresse an Euch und versuche, mit den mir zur Verfügung stehenden Kontrast verstärkenden Verfahren einen Beitrag zu leisten.
Viele Grüße von Jürgen aus Hagen
Hallo,
und hier ein Beispiel für die Intensitätsverteilung für gute schiefe Beleuchtung einer kleinen Glaskugel. Der vermessene Schnitt geht zentral durch die Kreismitte über das Kugelfoto, gute Fokussierung ist hier Voraussetzung.
Die rote Kurve ist als Anhaltspunkt für den idealen differentiellen Phasenverlauf einer Kugel eingezeichnet - wie es z.B. gutes DIK haben sollte. Also die mathematische Ableitung (Steigung) der örtlichen Objekt-Phasenverschiebung. Wenn man den Intensitätsverlauf mathematisch integriert, erhält man die Intensität eines idealen Zernike-Phasenkontrastbildes. Die Symmetrie des vermessenen Intensitätsverlaufs ist gut.
Der Brechungsindexunterschied zwischen Glaskugel und Einbettmedium spielt beim relativen Intensitätsverlauf keine Rolle, vorausgesetzt dass die maximale Phasenverschiebung das Phasenkontrastverfahren nicht überfordert und man nicht in den nichtlinearen Bereich der Kontrastierung kommt. An den Kugelrändern entsteht unvermeidlich eine Verbreitung des Intensitätsverlaufs durch die Breite des Beugungsbildes, die Kugel hat nur etwa 5 µm Durchmesser. Daher auch das deutliche Pixelrauschen.
Plot Glaskugeln Histokitt Fokusserie 2x.jpg
Hubert
Hallo Hubert,
mit welchem Programm hast Du das erstellt? Ich suche so etwas, um den DIC-Gradienten für Vergleiche wenigstens annähernd quantifizieren zu können. Z.B. entlang der beiden Diagonalen und der beiden Orthogonalen in einem Bild.
Hallo Jürgen,
ich habe das Programm ImageJ verwendet. Das Problem ist, dass man sich da etwas einarbeiten muss weil es eine andere Struktur hat als typische Bildbearbeitungsprogramme. Wenn man es aber nur isoliert z.B. für die angesprochene Anwendung nutzt, bekommt man es eigentlich schnell in den Griff.
Das sieht mit den Bearbeitungsschritten Datei laden, Bild zoomen, Rechteck einzeichnen und Profil plotten dann etwa so aus (das kleine Menüfeld oben ist das ganze Programm ImageJ)
Intensitätskurve ImageJ.jpg
Eine einfache Alternative um Intensitätsplots entlang einer Line darzustellen ist z.B. im Programm MicroCamLabII (Software für Okularkameras von Bresser) oder äquivalent ToupView vorhanden. Diese Programme kann man auch ohne Verwendung einer Kamera nutzen. Allerdings ist hier der Nachteil dass nur die Intensitätskurven exakt über eine Pixelbreite dargestellt werden, während bei ImageJ die Pixelbreite (und damit eine Mittelung zur Rauschminderung) durch Einzeichnen eines entsprechenden breiten Auswahlrechtecks wählbar ist.
Die Bearbeitungsschritte sehen hier so aus:
Intensitätskurve MikroCamLabII.jpg
Und mit dem relativ kompakten Astro-Bildbearbeitungsprogramm Fitswork sieht der Ablauf dann so aus:
Intensitätskurve Fitswork.jpg
Hubert
Hallo Hubert,
Die Probleme, die Du für den Fall des symetrischen, axialen Aufbaus (Hoffman Patent US 4200353 (https://patents.google.com/patent/US4200353A/en?oq=US+4200353A)) für den irregulären Phasenverlauf aufzeigst wurde ja von Hoffman durch die anaxiale, schiefe Variante versucht zu umschiffen
(Hoffman Patent US 4200354 (https://patents.google.com/patent/US4200354A/en?oq=US+4200354), ganz am Ende erwähnt er die schiefe Beleuchtung übrigens).
Wie Du ja auch immer betonst, leidet die Darstellung des Phasenverlaufs v.a. bei zunehmender Dicke der Präparate.
Mit einem anaxialen Aufbau zeigt eine nachfolgende Patentschrift (Matsui, Nikon) eine interessante Veränderung im schmalen Bereich von T <10% für den Modulator, genauer ein Optimum bei 5-8%, hier bei zwei verschiedenen Dicken des Objektes:
10mu.jpg
1,5mu.jpg
Q: Matsui US20100284067A1 (https://patents.google.com/patent/US20100284067A1/en?oq=US20100284067A1)
Beste Grüße Stefan
Nachtrag: Hier (https://d33b8x22mym97j.cloudfront.net/phase4/literature/Brochures/icsi_2ce-mrrk-2.pdf) das Mikroskop dazu mit "Nikon Advanced Modulation Contrast" ;)
(Die Bildauswahl in der Broschüre ist natürlich völliger Käse)
Hallo Stefan,
die Grafiken die ich verwendet habe stammen aus dem zweiten Patent mit außeraxialem Spalt, aber das ist eigentlich unwichtig. Generell gilt - auch für "normale" schiefe, kondensorseitige Beleuchtung - dass die Asymmetrie des Intensitätsverlaufs Großteils von der Blendenform abhängt. Dass Hofmann (nur) ganz am Ende schiefe Beleuchtung erwähnt ist m.E. trotzdem nicht üblich, denn der einleitende Text soll immer den bekannten Stand der Technik für die betrachtete Patentanmeldung beschreiben (ich kenne das, weil ich selbst am zwei Patenten beteiligt war und tagelang mit dem internen Patentanwalt um jedes Wort diskutiert hatte).
Die Nikon-Patentschrift kenne ich auch, das ist wieder so ein typisches Beispiel für die subtilen Tricks bei Patentanmeldungen. Denn eigentlich ist alles was dort beschrieben wurde prinzipiell bekannt. Patentfähig sind dann nur detaillierte Konkretisierungen, die in den Patentansprüchen (Claims) am Ende formuliert wurden. Und das auch in abgestufter Form vom allgemeinen zum spezielleren, um bei Einzelablehnung wenigstens einen Teil der Ansprüche zu bekommen. Daher die spezielle Festlegung auf z.B. einen bestimmten Transmissionsbereich des Modulators oder die Breite. Man will sich von der Konkurrenz durch spezifische Anordnungen abgrenzen. Bemerkenswert ist dass Nikon es auf eine ganz spezielle Anwendung, und da wiederum auf eine vorgeblich besonders gute Darstellung von Teilen des Objekts abstellt: "In the light of the above, it is an object of the present invention to provide a modulation contrast microscope that affords good view of sperm in ICSI, in particular, good view during sperm manipulation in ICSI, by improving contrast of the end portion of the tail."
Inwieweit das in Kombination mit der sowieso schiefen Beleuchtung eine allgemeingültige Aussage für optimalen differentiellen Phasenkontrast darstellt, habe ich meine begründeten Zweifel.
Hubert
Hubert,
vielen Dank, das war genau die Art von Antwort, die ich erhofft hatte. ImageJ ist wirklich sehr mächtig und da blickt man dann oft nicht intuitiv durch, aber hab's dank Deiner Anleitung gleich hinbekommen.
Wie erzeugst Du eigentlich die schiefe Beleuchtung an Deinen Geräten?
Lieber Jürgen,
Liebes Forum,
als Auflockerung zwischen der hohen Wissenschaft eine Bilderserie aus der niederen Praxis, völlig unbearbeitet am "historischem" Leitz 170mm Material geknipst (...und leider etwas ungenügend abgeglichen). Jürgen hat mir etwas seiner Pülverchen und zwei schöne Präparate mit Histokitt zur Verfügung gestellt (Vielen Dank nochmal dafür) und ich zeige hier den zu demonstrierenden Effekt am Leitz Heine Kondensor. Alle Bilder in der exakt gleichen Fokuslage, das ist der Vorteil des Heine-Kondensors - alle Beleuchtungsarten an einem Radl steuerbar.
Mit den Hohlkugeln kann ich nicht so viel anfangen, sie sehen für mich immer aus wie Luftblasen und verhalten sich wie eine eigene Linse im System - schön anzusehen, wenn sich viele Kugeln gruppieren, aber für die Kontrastprobe für mich nicht sehr hilfreich.
Zuerst eine Serie mit dem 25 / 0.50 Pv n Achromaten.
Die Vollkugeln sind im Histokitt im Hellfeld kaum sichtbar, meine Serie wurde in Zeiss Immersionsöl 518 N "gebettet", darin sind die Kugeln im "normalen" Hellfeld des Heine-Kondensors unsichtbar, Bild 1.
Bild 2 zeigt den gegenüber dem Zerneke-Ph zarten Phasenkontrast des Heine, der ja variabel durch den Lichtring steuerbar ist - hier ziemlich in der Mitte des Phasenrings.
Bild 3 zeigt den "farbigen Phasenkontrast" unter Zuschaltung des äußeren Lichtrings und der Farbblende des großen Heine-Kondensors. Bringt hier nicht viel, das Farbspiel wird durch rötlich komplementäre Halos auf dem grünlichen Hintergrund angedeutet, kommt aber nur an einigen kontrastreichen Strukturen zur Geltung, kaum an den zarten Glaskugeln.
Bild 4 zeigt die ringförmige Hellfeldbeleuchtung - kann nicht mit PhaKo mithalten, ist aber doch deutlich kontrastreicher als das normale Hellfeld.
Grüße
Andreas
...und das ganze nochmal mit dem Apo 40 / 0.70 n:
Bild 1: Hellfeld, Kugeln fast unsichtbar
Bild 2: Phasenkontrast, einen Ruck weiter Richtung Ringinnenrundung verschoben
Bild 3: "Farbiger" Phasenkontrast, bringt nicht viel
Bild 4: Die ringförmige Beleuchtung unter Zuschaltung des Farbrings des "großen Heine": Wäre eine schöne Rheinbergbeleuchtung, kommt aber wieder an den Glaskugeln nicht raus. Kaum kontraststeigernder gegenüber der ringförmigen Beleuchtung ohne "Zweitring".
Bild 5: Dunkelfeld. Die Ränder der Kugeln leuchten sehr zart, alle brechenden Strukturen dagegen sehr hell. Ein sehr schöner plastischer Eindruck, wie zwischen durchsichtigen Planeten im All - kommt auf dem Foto durch die überstrahlenden Lichter nicht raus. Erkenntnis: Dunkelfeld bringt bei schwachen Kontrasten zwischen Objekt und Medium nichts.
Grüße
Andreas
Hallo Jürgen,
noch drei Hinweise zu ImageJ:
Es gibt auch eine Online-Version, die man vom Browser aus starten kann, habe ich aber noch nicht getestet:
https://imagej.net/software/imagej-js
Falls Du eine Rechteckauswahl mit schrägem Rechteck (für schräg verlaufendes DIK) suchst, man kann einige der Auswahlflächen (mit rotem Pfeil rechts unten) durch längeres Anklicken verändern. Hier gibt es auch die Auswahl schräger Rechtecke.
ImageJ Rechteckauswahl.jpg
Und zum Zoomen ausgewählter Bilder reicht auch ein wiederholter rechter oder linker Mausklick wenn vorher das Lupensymbol allgemein angeklickt wurde.
Hubert
Hallo Jürgen,
ZitatWie erzeugst Du eigentlich die schiefe Beleuchtung an Deinen Geräten?
eine gute Frage.
Eine Variante am Zeiss Standard (ich verwende das GFL) mit Klappkondensor, da habe ich Blenden mit 3D-Druck gefertigt, die auf der Unterseite einen Rand haben der genau an dem Rand der Glasabdeckung über der Irisblende einrastet. Das ist eine fast optimale Stelle, da dort etwa die vordere Brennebene des Kondensors liegt (also unterhalb der Klapplinse). Die lassen sich relativ leicht durch den kurzen Griff einlegen, aber der müsste eigentlich noch z-förmig nach unten-außen verlängert werden.
Blenden Zeiss Klapp-Kondensor.jpg
Zur Beschreibung einer anderen, universelleren und von mir aktuell bevorzugten Variante müsste ich aber einen eigenen umfangreicheren Beitrag erstellen, in der Kürze wäre das eher verwirrend. Die verwende ich an einem Zeiss Junior wegen dessen anderer Kondensoraufnahme (kein Schwalbenschwanz sondern Steckhülse), und zwar in Form einer speziellen selbst konstruierten Beleuchtungseinheit. Aber im Prinzip oben auch mit auswechselbaren 3D-Druck Teilen als Blenden.
Mindestvoraussetzung für gute schiefe Beleuchtung ist eine homogene Hintergrundausleuchtung. Wenn die nicht gegeben ist, z.B. in Form eines Helligkeitsgradienten, taugt auch die Beleuchtung nichts. ;)
Hubert
Hallo Andreas,
vielen Dank, dass Du hier Deine Bilder einstellst. Du gehörst also zu den wenigen glücklichen Mikroskopikern, die einen Großen Heine ihr Eigen nennen können, Gratulation!
Ja, der Heine Ph macht einen sehr schönen, eher zarten Kontrast. Den "kleinen" Heine habe ich auch und meine Erfahrung mit Zeiss-West Ph-Objektiven ist, dass das natürlich prinzipiell funktioniert, aber im Vergleich zum "passenden" Ph-Kondensor verliert die Abbildung m.E. erheblich an Brillanz, wahrscheinlich liegt das an dem sehr schmalen Lichtring. Mit den Heine-Objektiven ist der Ph natürlich einwandfrei.
Hubert,
vielen Dank, dass Du Deine Technik für schiefe Beleuchtung teilst. Du verwendest also letztlich die "einfacheren" Abbe-Kondensoren dafür. Mein Eindruck ist, dass mit denen die Schiefe Beleuchtung nicht nur einfacher zu realisieren ist als mit den achromatisch-aplanatischen Systemen, sondern auch die Qualität der Abbildung besser scheint; ist das auch Deine Beobachtung?
Hallo Jürgen,
das "Problem" achromatisch-aplanatischer Kondensoren ist eigentlich nur, dass die meist mit einer NA von 1.4 verwendet werden, was bedeutet dass die Blende für schiefe Beleuchtung exakter an der richtigen Stelle sitzen muss. Die Brennweite ist kürzer als bei einem Kondensor mit NA 0.9, und dadurch wirkt sich eine Defokussierung deutlicher aus. D.h. bei einem entsprechenden z.B. Phasenkontrastkondensor muss dann auch die Blende auf Höhe der Phasenblenden sitzen, und nicht vereinfacht nur eine freie Stelle irgendwo besetzen.
Ich weiß dass üblicherweise die schiefe Beleuchtung einfacher improvisiert wird weil es immer ein ähnliches Reliefbild ergibt, das in der Praxis auch ausreicht (die bekannte Frage heißt dann hier immer: Merkt ein normaler Mikroskopiker den Unterschied? :D ). Aber das Bild hat eben nicht unbedingt die optimale differentielle Intensitätsverteilung der Objektphase - falls man diese denn überhaupt gezielt will.
Dann kommt noch das Thema Tiefenschärfe bei dickeren Objekten dazu, eine gewollte geringe Tiefenschärfe für Phasenobjekte setzt die maximale Nutzung der NA der Kondensors voraus, was wiederum bedingt dass die Blende an der optimalen Stelle sitzt. Das ist ja auch bei normaler Hellfeldverwendung eines nicht-aplanatischen Kondensors bekannt, dass dessen max. NA nicht genutzt werden kann wenn seine Fokuslage nicht auf die sphärische Aberration der Randstrahlen eingestellt wird (speziell bei Verwendung einer bildfeldbegrenzenden Leuchtfeldblende).
Daher verwende ich vorzugsweise für schiefe Beleuchtung einen kondensorlosen Beleuchtungseinsatz, der ist (fast) automatisch achromatisch-aplanatisch. Ich hatte das im letzten Beitrag mit der anderen Variante gemeint, aber wie schon erwähnt ist das im Detail in der Kürze nicht zu beschreiben.
Hubert
Hallo,
ich hatte eigentlich zu einzelnen der hier angesprochenen Themen, insbesondere den Einfluss der Blendenform bei schiefer Beleuchtung (und damit indirekt auch beim Modulationskontrast nach Hoffman) auf die Objektwiedergabe, in einem früheren Beitrag bereits beschrieben. Der gesamte Aufsatz ist zugegebenermaßen nicht immer leicht verständlich wenn man ihn nicht "durcharbeitet".
Bild 17 darin zeigt ergänzend zu Jürgens Frage meine oft verwendete Konfiguration für schiefe Beleuchtung als Ganzes.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=dlattach;attach=20174;image
aus https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41469.0
Die dann folgenden Bilder 18, 19, 20 und 21 https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=41469.msg305435#msg305435
zeigen den z.T. ziemlich negativen Einfluss auf die reale Objektdarstellung bei abweichenden Blendenformen, auch wenn der Bildkontrast in Teilbereichen des Bildes dadurch deutlich erhöht werden kann. Das ist der Punkt, der in der Diskussion vielleicht verwechselt wird: Man kann den Bildkontrast durchaus örtlich weiter erhöhen, aber eben auf Kosten der Objekttreue. Und dann stellt sich die Frage ob ein geringerer Kontrast nicht doch vollkommen ausreicht wenn man den Bildkontrast zumindest fotografisch nachträglich erhöhen kann. Speziell Bild 21 zeigt rechts wie surreal die Darstellung je nach Objektdicke werden kann wenn die Blende eng gewählt wird.
Mein "Standardtestobjekt" war in den Fällen des kreisrunden (kugelähnlichen) Objekts ein Stärke-Präparat.
Hubert
Hallo Andreas,
Deine Serien fand ich auch sehr interessant, wie auch die von Jürgen gezeigten.
Zitat von: andr_brno in Februar 25, 2025, 17:50:09 NACHMITTAGSmeine Serie wurde in Zeiss Immersionsöl 518 N "gebettet"
, wenn ich es richtig verstanden habe sind
alle deine gezeigten Aufnahmen hiermit und nicht mit den Histokitt-Präparaten gemacht worden, oder?
Beste Grüße Stefan
Zitat von: purkinje in Februar 28, 2025, 18:28:45 NACHMITTAGSwenn ich es richtig verstanden habe sind alle deine gezeigten Aufnahmen hiermit und nicht mit den Histokitt-Präparaten gemacht worden, oder?
Hallo Stefan,
ja, das ist richtig!
Ich habe auch noch den Leitz Zerneke Phako und den 170er DIK Smith probiert, auch interessant.
Grüße Andreas