Liebe Kollegen,
Mit einer Spur stark verdünnter Acridinorangelösung zur Wasserprobe (ich nehme üblicherweise nur die Mikrotröpfchen, die an einer Präpariernadel hängenbleiben) bekommt man bei Blauanregung sehr schöne Fluoreszenzen der Wasserorganismen, wirklich nicht schwierig auszuprobieren, geht auch schön mit Durchlicht-Dunkelfeldfluoreszenz mit sehr preiswerten Filtern.
Das Schöne hierbei ist, dass Acridinorange je nach Konzentration oder auch pH Wert Farben von Grün über Gelb bis orange erzeugt (schön bei den Glockentierchen zu sehen).
Alle Aufnahmen am Leitz Orthoplan, Ploemopak, Filterblock H3
Herzliche Grüsse
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/36216_14645893.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/36216_63610713.jpg)
Hallo -
die rote Fluo könnte auch auf die Anwesenheit von RNA (besonders in Regionen mit viel Proteinsynthese: mRNA, rRNA) hindeuten. Während reines AO grün fluoresziert, ist der RNA-Komplex rot.
Gruß
Rolf
Hallo Rolf,
ja das ist korrekt. Acridinorange wird unter anderem zur differentiellen Färbung von DNA und RNA verwendet. Bei Blauanregung fluoresziert doppelsträngige DNA mit eingelagertem Acridinorange grün wenn man nicht zu hoch dosiert, andernfalls wird die DNA denaturiert und kann dann ebenfall rot fluoreszieren.
Einzelstrang-Nukleinsäuren wie z.B. mRNA präzipitieren nach Interaktion mit dem Farbstoff, das Produkt fluoresziert dann rot.
Ich verwende als Stammlösung eine Konzentration von 10 mg auf 10 ml Wasser und bewahre diese dann im Kühlschrank auf, wo sie bei mir schon jahrelang hält. Ich habe nicht das Gefühl dass sie weniger geworden ist, wie gesagt man braucht nur Spuren.
Herzliche Grüsse
Holger
Hallo Holger,
das ist eine schöne Anregung. Und dazu noch eine Färbung für den sparsamen Schwaben ;)
Ist doch erstaunlich in welchen geringen Konzentrationen noch hervorragend sichtbare Färbungen erzielt werden!
Hallo Holger,
phantastische Bilder!
Ich habe das Problem, dass Ciliaten unter dem Auflichtstrahl entweder verrückt spielen und sofort verschwinden oder zerplatzen, so dass ich kaum Lebendaufnahmen machen kann - ich denke inzwischen dran, einen Neutralgraufilter vor die HBO zu setzen - dann werden aber die Belichtungszeiten wahrscheinlich zu lang. Wie machst Du das denn?
Schöne Grüße
Bernd
Hallo Bernd,
die Fluoreszenz des Acridinorange ist sehr intensiv, da sollte eine Halogenlampe gut ausreichen für die Anregung.
Liebe Kollegen,
@ Rolf: Ich poste hier noch ein 2. Bild, dort sieht man den DNA haltigen und hufeisenförmigen Grosskern des unteren Tieres sehr schön - und DNA typisch grün fluoreszieren.
@ Klaus: Ja das ist wirklich erstaunlich, selbst ein kleiner Ansatz hält ca 500 Jahre :D für die Vitalfärbung bevor man sie aufgebraucht hat, falls wir uns in Emden sehen, kann ich ja mehrere kleine Portionen - auch für andere (kostenlos) mitbringen
@ Bernd: Ich denke auch, dass Deine Strahlung zu intensiv für eine Lebendbeobachtung war. Ich stimme mit Klaus überein dass 100W Halogen, gut gefiltert hier ausreichen. Allerdings habe ich die Bilder mit dem HBO 50 Brenner gemacht - aber auch alles andere wie z.B. UV, Infrarot etc. stark ausgefiltert. Die Tiere in meinen Bildern waren allesamt durch (leichten) Deckglasdruck festgelegt ...
Herzliche Grüsse
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/36270_57902434.jpg)
Hallo Holger,
danke für Dein Angebot:
Zitatkann ich ja mehrere kleine Portionen - auch für andere (kostenlos) mitbringen
Aber mein Acridinorange reicht für 500 000 Jahre ;)
Ich habe mich in meiner aktiven Zeit mit der AL-Fluoreszenz in der Werkstoffuntersuchung intensiv beschäftigt, und bei mir zu Hause viele Versuche mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gemacht. Der Schwerpunkt war damals Schadensanalysen an Hochfestverklebungen zu machen.
Problem war: schwarzes Kunststoffsubstrat, schwarzer Primer und schwarzer Klebstoff. Wenn eine Verklebung versagt (reißt) möchte man wissen ob der Bruch adhäsiv oder kohäsiv war und wo die Trennung statt gefunden hat. Bei schwarz in schwarz eben nicht so einfach. Da hat dann die selektive Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen geholfen.
Liebe Kollegen,
diese Amöbe hat heute etwas Acridinorange abgekriegt ...
Der runde, grün fluoreszierende Zellkern ist an der Grenze zum unteren Drittel zu sehen.
Herzliche Grüsse
Holger
Leitz Ploemopak, Auflicht Fluoreszenz, Blauanregung Filterblock H3
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/38465_13853748.jpg)
... und eine Pilzhyphe war auch noch in der Probe.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures006/38466_31132759.jpg)
Liebe Kollegen,
hier noch eine Ciliaten-Lebendaufnahme nach Acridinorange-Fluochromierung.
Herzliche Grüsse
Holger
Leitz Orthoplan, Phasenkontrast mit simultaner Auflicht-Fluoreszenz (Blauanregung mit Leitz Filterblock H3)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/38505_35945528.jpg)
Hallo Holger,
durch Deinen Beitrag angeregt habe ich nun auch die ersten Schritte mit Acridinorange und Auflichtfluoreszenz gewagt. Eher schlecht als recht, aber aller Anfang ist schwer. Die Biester flitzen doch zu schnell :'( Also auch noch betäuben !
Noch viel zu tun ;)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/38513_66392805.jpg)
Blaulichtanregung über 3 Watt royalblue LED und Zeiss FL IV
Schönes Wochenende und Gruß
Peter
Hallo Peter,
das ist doch schon mal ein guter Start ! Man sieht ja auch schon schöne Farbdifferenzierungen im Tier.
Mit welcher Kamera nimmst Du die Fluoreszenzaufnahmen ?
Herzliche Grüsse
Holger
Hallo Holger,
ich kann überhaupt nicht mitreden und doch interessiert mich das Thema Fluoreszenz sehr. Du hast vorhin beim Beitrag von P. Höbel nach der Kamera gefragt. Werden besondere Anforderungen an die digitalen Kameras gestellt? Wie eignen sich die Nikon Coolpix 990 / 995 für Aufnahmen am Fluoreszenz -Mikroskop?
Besten Dank für weiterführende Tipps.
Gruss Arnold
Hallo Arnold,
Zur Klarstellung: Mitreden kann hier jeder, zum Beispiel mit guten Fragen zum Gesehenen, so wie von Dir hier gestellt ;)
Ich weiss leider nicht ob Coolpix und andere Konsumer Kameras hier funktionieren, könnte es mir aber gut vorstellen.
Die Acridinorange Fluoreszenz ist ziemlich kräftig schon mit einer Halogenlampe 50 W, darüberhinaus gibt es auch schon starke LEDs - siehe Peter's Kommentar.
Generell sind Kamers mit grösseren Pixeln (NICHT Anzahl der Pixel gemeint) besser für diesen Zweck, da die Photohalbleiterzellen da oft empfindlicher sind.
Auch sollte das Pixelrauschen bei schwachem Licht niedrig sein, sonst sind die Bilder doch stark verrrauscht. Die Fluoreszenz Emission ist doch insgesamt deutlich schwächer als das übliche Umgebungslicht, wenn die Kamera zB bei Kerzenlicht kein störendes Rauschen fabriziert sollte sie für diesen Anwendungszweck OK sein.
Ich selbst verwende eine spezielle Mikroskopkamera.
Herzliche Grüsse
Holger
Hallo Holger,
zur Kamera kurz. Für ca. 95% aller Aufnahmen habe ich von Imaging Source die kleine CCD-Kamera DBK41 mit USB Verbindung zum PC. Die Kamera läßt sich sehr gut in allen wichtigen Parameter per Programm einstellen und ist bis fast 1000nm empfindlich. Eine Version DFK41 hat ein eingebautes UV- und IR-Sperrfilter. Die Kamera ist bis zu Belichtungszeiten von 60 Minuten !!! ausgelegt, was aber bis max. 5 oder 10 Min. Sinn macht. Daher wird diese Kameraserie auch gerne in der Astronomie genutzt. Meine Aufnahmen entstanden mit 1/8s und etwas angehobener Verstärkungseinstellung. Ist das Rauschen dann zu stark, so werden meine Bilder über Neat Image zum entrauschen geschickt.
Ob meine Canon 450D diese Bilder schaffen würde ? Bei Gelegenheit wird es getestet..
Schönen Sonntag
Peter
Hallo Holger,
danke für deine Erklärungen.
ZitatZur Klarstellung: Mitreden kann hier jeder, zum Beispiel mit guten Fragen zum Gesehenen, so wie von Dir hier gestellt
Da ist mir mein Schweizerdeutsch in die Quere gekommen. Für mich ist klar, dass hier "mitgeredet werden darf"! Ganz einfach gesagt habe ich noch keine Erfahrung in der Fluoreszenz - Mikrokopie. Aber mich fasziniert dieses Kontrastverfahren in der Anwendung bei pflanzlichen Objekten sehr und ich würde dabei vor allem die Eigenfluoreszenz nutzen.
Freundliche Grüsse
Arnold
Lieber Peter und Arnold,
ich verwende derzeit die ganz hervorragende Motic 2300, eine 3 MP CMOS USB Kamera, die je nach Bildausschnitt und Beleuchtung bis über 100 frames per Sekunde (fps) kann (im normalen Feld etwa 24 fps bei 1.3 MP Auflösung und 8 fps bei voller 3 MP Auflösung). Die Kamera bietet sehr viele Einstellmöglichkeiten durch ihre Software und biete m.E. ein unschlagbares Preis/Leistungsverhältnis !
Der Service durch Motic in Wetzlar (Hr Kuca) ist vorbildlich ! Ich habe sogar schon Änderungswünsche an der Software umsetzen lassen.
So hat mich z.B. sehr gestört, dass bei Fluoreszenzaufnahmen im dunklen Zimmer das Kamera-Programm auf dem Bildschirm viel zu hell strahlte, statt den Bildschirm dunkler zu stellen hat Motic auf meine Anregung hin jetzt ein Softwareupdate geschickt, welches ein Bildschirminterface im Dunkelkammermodus hat - das ist ganz hervorragend umgesetzt.
Mein nächster Änderungswunsch betrifft die softwaremässige Einbindung eines USB Fuss-Schalters zum Starten / Stoppen der Bildaufnahme.
Biltzaufnahmen möchte ich auch noch mit dieser Kamera versuchen, ich habe ja noch den hervorragenden Stahlschmidt Doppelkollektor aus meine analogen Vergangenheit ;D
Die Kamera geht hervorragend in der Fluoreszenzmikroskopie. Sie ist im Hellfeld im direkten Vergleich den wesentlich teureren CCD Profikameras nahezu ebenbürtig (selbst Herr Kuca war sichtlich überrascht bei der Demo bei mir im Haus). Keine der CCD Kameras, welche Herr Kuca zum Vergleich mitbrachte war darüber hinaus in der Lage, schnell bewegte Objekte ohne Bewegungsspuren darzustellen. Rasche Bewegungen sind wohl immer noch eine CMOS Domäne !
Übrigens hat Motic noch eine 5 MP Kamera (2500) die lt Herrn Kuca aber eine schlechtere Bildqualität hat. Ausserdem sind die grösseren CMOS Pixel der 2300 besser für die Fluoreszenzmikroskopie.
Ich hänge mal ein Foto von meinem Arbeitsgerät, dem Leitz Orthoplan - in der Abbildung mit Auflicht-Fluoreszenz und DIC - an. Man sieht die zierliche aber hervorragende Moticam 2300 auf dem Trinotubus als feste Installation.
Ausserdem gibt es einen Link zur Moticam 2300. Auch bei Ehlert Partner in Bonn zu beziehen.
Herzliche Grüsse & schönes Wochenende.
Holger
http://www.mikroskop-shop.de/html/moticam_2300.html
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/38546_36300182.jpg)
Noch ein kleines Beispiel.
Dieses A-orange färbt ja wirklich wie der Teufel. Also noch ein kleiner Versuch - was könnte das sein ;D
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/38581_48881748.jpg)
Blaulichtanregung über LED @ 455nm mit Zeiss Filtersatz 09 , PlanApo 100/1,32 Öl.
@Holger
es gibt zu einem weit geringeren Preis auch ein CMOS-Kamera mit 1/2" Chip und USB Anbindung.
http://www.theimagingsource.com/de_DE/products/cameras/usb-cmos-color/dfk61buc02/
Ich hoffe, ich kann diese Kamera demnächst einmal testen. Die Software ist jedenfalls zu allen bisherigen Kameras identisch und damit habe ich beste Erfahrungen gemacht.
Einen schönen Sonntag
Peter
?? Hast Du Dir denn die Zähne geputzt, Peter ;D
Schönes Foto, aber was ist das für ein hellgrüner Fleck in der Mitte rechts - eine Überstrahlung ?
Ich habe mir kurz das Datenblatt der DFK 61BUC02 angesehen (Dein Link), für den Preis kannst Du keinen hochwertigen ADC (analog/digital konverter) erwarten, er ist bei dieser Kamera auch nur mit 10/8 bit angegeben. Der ADC trägt erheblich zur resultierenden Bildqualität bei. Höhere Dynamikraten sind jedenfalls von Vorteil, besonders wenn man DIC, DF und Phaco verwendet, ansonsten hat man sehr rasch Sättigungen in den Schatten oder Spitzlichtern.
Aber ein Test / Vergleich mit der Moticam 2300 wäre mit Sicherheit interessant.
Schönes, sonniges Wochenende
Holger
... noch eine Amöbe mit Acridinorange Vitalfluochromierung.
Ernst Hippe hatte in einem anderen Post zum Einsatz der Mezhode gefragt. Ich könnte mir vorstellen, dass die Bestimmung der Amöben evt. von dieser Methode profitiert ?
Man sieht hier z.B. sehr schön den grün (DNS !) fluoreszierenden Kern mit einem typischen Hof.
Vielleicht nehmen ja Martin & Ferry hierzu Stellung.
Herzliche Grüsse
Holger
Leitz Orthoplan, Auflicht Fluoreszenz mit Blauanregung (HBO 50, Leitz Filterblock H3)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/39142_23349385.jpg)
Hallo Holger,
eine technische Frage zur Kamera, da ich auch durch guuckeln keine Erleuchtung finden konnte. Der Chip ist sicher 1/2" groß. Wie steht es mit dem Shutter ? Rolling shutter wie sehr oft bei CMOS Sensoren anzutreffen? Wäre schön wenn ich dazu einen Link oder eine sichere Antwort bekommen könnte.
Guten Wochenstart und Gruß
Peter
Hallo Peter,
ich habe auch keine Angaben zum Shutter-Typ und habe bei Motic angefragt. Melde mich sobald ich Details habe. 1/2" CMOS ist korrekt.
Herzlicher Grüsse
Holger
Hallo Holger,
Zitataber was ist das für ein hellgrüner Fleck in der Mitte rechts - eine Überstrahlung ?
das schöne Plattenepitel von Peter mit den Bakterien drauf liegt wahrscheinlich eine Ebene höher, als ein intensiv grün fluoreszierender Partikel, der dadurch verschwommen unscharf abgebildet wird.
Übrigens: beeindruckendes Mikrosköpchen ;D hast Du da! Wenn das Dein Reise-Mikroskop ist, dann möchte ich gerne die Laborversion mal sehen! ;)
@ Klaus: ;)
@ Peter-h: Hier sind detailliertere Daten zur Moticam 2300:
Herzliche Gruesse
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/39404_32699461.jpg)
Hallo Holger,
herzlichen Dank für die Beschaffung der Chip-Daten. Diese Daten der Moticam 2300 habe ich verglichen mit der Spezifikation der ImagingSource-Kamera DFK61AUC02 und kann in keinem relevanten Punkt eine Abweichung feststellen.
Allein im Preis sehe ich große Unterschiede :o 1129.- zu 416.-
Hier blicken dann nur noch Experten und Marketingmanager durch ;D oder habe ich was übersehen ???
Vielleicht sind es die kleinen Adapter welche die Moticam so veredeln.
Viele Grüße
Peter
Hallo Peter,
wie schon gesagt, die chips haben nicht alle die gleiche Qualitaet, auch wenn sie die gleiche nominale Aufloesung haben, auch wird haeufig an der Qualitaet der AD Wandler gespart ... ein Vergleich waere wirklich interessant, nur wie macht man den am Besten ???
Viele Gruesse
Holger
Hallo Holger,
mit etwas Glück sehen wir uns im September in Emden (ich muß ja als Referent vorhanden sein). Denke dass ich dann diese Kamera dabei habe, entweder als Testmuster oder mein Eigentum :) und sicher hat das Institut auch zufällig ein Mikroskop. Dann läge es nur noch an Dir ;D
Schönen Tag und Grüße
Peter