Liebes Forum,
nein, ich will nicht mit eye of scinece in Konkurrenz treten, ...
(https://www.protisten.de/wp-content/uploads/2026/02/Micrasterias-fimbriata-quadratisch-coloriert-V2.jpg)
... wobei mir schon klar ist, dass ich das eh nicht kann 😉
Dieses REM-Bild hat nur deshalb etwas Farbe bekommen, weil mein Vereinskamerad Jürgen und ich der Redaktion der MGW-Vereinszeitung einen Artikel über Micrasterias fimbriata im REM angeboten haben und die Redakteurin sich fürs Cover ein farbiges LM-Bild gewünscht hat. Und ich hatte (noch) keines ...
Der Grund, wieso ich diesen Beitrag schreibe, ist der:
Ich will auf diesen Artikel von Jürgen Stampfl und mir hinweisen. Seit Mitte letzten Jahres treffen wir uns immer wieder, um Einzeller aus Gewässerproben im REM sichtbar zu machen. Obiges Bild ist entstanden, nachdem wir erstmalig versucht hatten, Algen via Kritischpunkttrocknung artefaktarm ins REM zu bringen. Wie das geht und was wir da zu sehen bekommen haben, kann man nun hier lesen:
Cellulose-Mikrofibrillen bei Micrasterias fimbriata (https://www.mgw.or.at/cellulose-mikrofibrillen-bei-micrasterias-fimbriata/)
Im vergangenen halben Jahr sind in Jürgens Labor auch viele weitere REM-Aufnahmen entstanden, von Diatomeen aus Nord- und Ostsee und vor allem von Schalenamöben aus Tiroler Moorgewässern. Da ich die meinsten von ihnen in der vergangenen Woche in protisten.de (https://www.protisten.de/) eingestellt habe, sind sie sowie die zugehörigen Beschreibungen über die Kolumne New items schnell zu finden.
Viele Grüße
Wolfgang
Hallo,
das Trocknen, habe ich bis jetzt nicht verstanden. Hier eine Erklärung:
Frage:
Kritischer Punkt bei der Trocknung von Proben für das REM. Wasser wird durch Alkohol, dann durch flüssiges C02 ersetzt, CO2 verdampft. Warum kommt es dann nicht wie bei Wasser zu Schrumpfungsartefakte(Kapillarwirkung des Wassers) Und was hat das mit dem kritischen Punkt zu tun?
Antwort:
Das ist eine hervorragende Frage, die den entscheidenden Vorteil der Kritische-Punkt-Trocknung (CPT) auf den Punkt bringt.
Der Kern der Antwort liegt in der Vermeidung der Phasengrenze flüssig-gasförmig und den dabei wirkenden Oberflächenspannungen (Kapillarkräften) .
Hier ist die detaillierte Erklärung Schritt für Schritt:
1. Das Problem: Die Kapillarkräfte des Wassers
Wenn eine nasse Probe einfach an der Luft getrocknet wird (Lufttrocknung), passiert Folgendes:
1. Verdunstung: Das flüssige Wasser in den feinen Strukturen der Probe beginnt zu verdunsten.
2. Phasengrenze: Es entsteht eine Grenzfläche zwischen der flüssigen Phase (Wasser) und der gasförmigen Phase (Luft/Wasserdampf).
3. Oberflächenspannung: An dieser Grenzfläche wirkt die Oberflächenspannung des Wassers. Wasser hat eine sehr hohe Oberflächenspannung (ca. 72 mN/m).
4. Meniskus und Kapillarkraft: In den feinen Poren und Hohlräumen bildet das Wasser einen gekrümmten Meniskus. Diese Krümmung erzeugt einen enormen Sog – die Kapillarkraft.
5. Kollaps: Während die Flüssigkeitsoberfläche in die Poren "zurückweicht", zieht diese Kapillarkraft die empfindlichen Zellwände, Mikrovilli oder anderen dreidimensionalen Strukturen zusammen. Das Ergebnis sind Schrumpfungs- und Kollapsartefakte. Die Probe wird ihr ursprüngliches, natürliches Volumen und ihre Feinstruktur nicht bewahren.
2. Die Lösung: Die Entwässerung (Wasser -> Alkohol)
Da Wasser eine so hohe Oberflächenspannung hat und sich nicht direkt mit CO2 mischt, muss es zuerst ersetzt werden.
- Warum Alkohol? Alkohol (z.B. Ethanol oder Aceton) mischt sich sowohl mit Wasser als auch mit dem später verwendeten flüssigen CO2. In einer aufsteigenden Alkoholreiße (z.B. 30%, 50%, 70%, 90%, 100%) wird das Wasser in den Zellen nach und nach durch Alkohol ersetzt. Wichtig: Auch beim Verdunsten von Alkohol würden Kapillarkräfte auftreten (seine Oberflächenspannung ist zwar geringer als die von Wasser, aber immer noch vorhanden), daher ist das nur ein Zwischenschritt.
3. Die Kernlösung: Der Ersatz durch flüssiges CO2 und der kritische Punkt
Jetzt kommt der entscheidende Teil, der direkt Ihre Frage beantwortet: Warum gibt es beim Verdampfen des CO2 keine Schrumpfungsartefakte?
Die Antwort liegt nicht darin, dass CO2 "einfach so" verdampft wird, sondern wie es verdampft wird – nämlich durch das Durchschreiten des kritischen Punktes.
1. Ersatz durch flüssiges CO2: Die alkoholgetränkte Probe wird in einen Druckbehälter (die "Kritische-Punkt-Trocknungsanlage") gegeben. Dort wird der Alkohol bei niedriger Temperatur (ca. 10°C) und hohem Druck durch flüssiges CO2 ausgespült und ersetzt. Die Probe ist nun von flüssigem CO2 durchtränkt. Bis hierher ist die Probe noch von einer Flüssigkeit umgeben und vor Kapillarkräften geschützt.
2. Die Erwärmung über den kritischen Punkt: Nun wird der Behälter verschlossen und die Temperatur langsam erhöht.
- Der Kritische Punkt von CO2: Der kritische Punkt von CO2 liegt bei einer Temperatur von ca. 31°C und einem Druck von ca. 74 bar.
- Wenn man diesen Punkt erreicht und überschreitet, geschieht etwas Besonderes: Die Unterscheidung zwischen der flüssigen Phase und der gasförmigen Phase verschwindet. Das CO2 befindet sich nun in einem Zustand, der als überkritisches Fluid bezeichnet wird.
- In diesem Zustand hat das CO2 Eigenschaften, die zwischen einer Flüssigkeit und einem Gas liegen – vor allem hat es keine Oberflächenspannung mehr.
3. Die schadstofffreie "Verdampfung": Jetzt, im überkritischen Zustand, wird der Druck langsam abgelassen (während die Temperatur über 31°C gehalten wird). Das überkritische Fluid entweicht als Gas, aber ohne dass jemals eine Phasengrenze (Flüssigkeit/Gas) gebildet wird.
Da es keine Phasengrenze gibt, gibt es auch keinen Meniskus und folglich keine Kapillarkräfte, die die feinen Strukturen zerstören könnten.
Zusammenfassung und Analogie
- Problem mit Wasser: Wasser hat eine hohe Oberflächenspannung. Beim Verdampfen entsteht eine Phasengrenze, die durch Kapillarkräfte die Probenstruktur wie ein nasser, zusammenfallender Schwamm kollabieren lässt.
- Lösung mit CPT: Man umgeht das Problem, indem man die Phasengrenze komplett vermeidet.
1. Wasser -> Alkohol: Alkohol ist mit beiden Phasen kompatibel (Zwischenträger).
2. Alkohol -> flüssiges CO2: CO2 hat einen leicht zugänglichen kritischen Punkt.
3. Über den kritischen Punkt: Man bringt das CO2 in einen Zustand (überkritisches Fluid), in dem es keinen Unterschied mehr zwischen Flüssigkeit und Gas gibt. Es hat also keine Oberflächenspannung.
4. Ablassen: Man lässt das Fluid als Gas entweichen, ohne dass jemals eine zerstörerische Phasengrenze entsteht.
Stellen Sie es sich wie ein Luftschloss vor: Wenn Sie einen nassen Sandsandhaufen an der Luft trocknen lassen (Verdunstung), zieht die Kapillarkraft das Wasser nach oben und der Sandhaufen kann einstürzen. Wenn Sie aber den gesamten Sandhaufen in einen Zustand versetzen könnten, in dem das Wasser schlagartig *überall gleichzeitig* verschwindet, ohne dass sich eine Oberfläche bildet, würde die Sandstruktur exakt so stehen bleiben, wie sie war. Genau das macht die Kritische-Punkt-Trocknung für biologische Proben im REM.
Hall Wolfgang,
wo werden die Proben eigentlich abgelegt, damit ihr sie wiederfindet?
Liebe Grüße
Rudolf
Guten Tag, Rudolf,
wir haben es so gemacht: In ein CPD-Tönnchen haben wir innen 25µ-Gaze auf die zu groben Metallsiebe aufgelegt, da war das gezeigte Objekt dann drauf.
Liebe Grüße
Wolfgang
Schöne Arbeit, Wolfgang!
Just wondering, do you have experience with HMDS as a drying agent, instead of critical point drying?
Best, René
Hi René,
that was our first attempt at CPD with algae, I will definitely remember HMDS!
Best, Wolfgang
Danke Wolfgang,
jetzt weis ich endlich was meine Masern auf der Micrasterias sind: Micrasterias thomasiana mit Masern? (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=46813.msg345028#msg345028)
Ich habe da noch eine Frage: Hast du deiner Micrasterias teilweise die Haut (Primärwand) abgezogen?
Weil bei den REM-Aufnahmen in diesem pdf (Seite 4): "Splitting of Micrasterias fimbriata (Desmidiales, Viridiplantae) into two monophyletic species and description of Micrasterias compereana sp. nov. (https://pdfs.semanticscholar.org/26f8/a334bf6381b09c048cf48c759f2673f1c134.pdf)" ist nämlich von deinen Mikrofibrillen nichts zu sehen.
LG
Leo