Liebes Forum,
nein, ich will nicht mit eye of scinece in Konkurrenz treten, ...
(https://www.protisten.de/wp-content/uploads/2026/02/Micrasterias-fimbriata-quadratisch-coloriert-V2.jpg)
... wobei mir schon klar ist, dass ich das eh nicht kann 😉
Dieses REM-Bild hat nur deshalb etwas Farbe bekommen, weil mein Vereinskamerad Jürgen und ich der Redaktion der MGW-Vereinszeitung einen Artikel über Micrasterias fimbriata im REM angeboten haben und die Redakteurin sich fürs Cover ein farbiges LM-Bild gewünscht hat. Und ich hatte (noch) keines ...
Der Grund, wieso ich diesen Beitrag schreibe, ist der:
Ich will auf diesen Artikel von Jürgen Stampfl und mir hinweisen. Seit Mitte letzten Jahres treffen wir uns immer wieder, um Einzeller aus Gewässerproben im REM sichtbar zu machen. Obiges Bild ist entstanden, nachdem wir erstmalig versucht hatten, Algen via Kritischpunkttrocknung artefaktarm ins REM zu bringen. Wie das geht und was wir da zu sehen bekommen haben, kann man nun hier lesen:
Cellulose-Mikrofibrillen bei Micrasterias fimbriata (https://www.mgw.or.at/cellulose-mikrofibrillen-bei-micrasterias-fimbriata/)
Im vergangenen halben Jahr sind in Jürgens Labor auch viele weitere REM-Aufnahmen entstanden, von Diatomeen aus Nord- und Ostsee und vor allem von Schalenamöben aus Tiroler Moorgewässern. Da ich die meinsten von ihnen in der vergangenen Woche in protisten.de (https://www.protisten.de/) eingestellt habe, sind sie sowie die zugehörigen Beschreibungen über die Kolumne New items schnell zu finden.
Viele Grüße
Wolfgang
Hallo,
das Trocknen, habe ich bis jetzt nicht verstanden. Hier eine Erklärung:
Frage:
Kritischer Punkt bei der Trocknung von Proben für das REM. Wasser wird durch Alkohol, dann durch flüssiges C02 ersetzt, CO2 verdampft. Warum kommt es dann nicht wie bei Wasser zu Schrumpfungsartefakte(Kapillarwirkung des Wassers) Und was hat das mit dem kritischen Punkt zu tun?
Antwort:
Das ist eine hervorragende Frage, die den entscheidenden Vorteil der Kritische-Punkt-Trocknung (CPT) auf den Punkt bringt.
Der Kern der Antwort liegt in der Vermeidung der Phasengrenze flüssig-gasförmig und den dabei wirkenden Oberflächenspannungen (Kapillarkräften) .
Hier ist die detaillierte Erklärung Schritt für Schritt:
1. Das Problem: Die Kapillarkräfte des Wassers
Wenn eine nasse Probe einfach an der Luft getrocknet wird (Lufttrocknung), passiert Folgendes:
1. Verdunstung: Das flüssige Wasser in den feinen Strukturen der Probe beginnt zu verdunsten.
2. Phasengrenze: Es entsteht eine Grenzfläche zwischen der flüssigen Phase (Wasser) und der gasförmigen Phase (Luft/Wasserdampf).
3. Oberflächenspannung: An dieser Grenzfläche wirkt die Oberflächenspannung des Wassers. Wasser hat eine sehr hohe Oberflächenspannung (ca. 72 mN/m).
4. Meniskus und Kapillarkraft: In den feinen Poren und Hohlräumen bildet das Wasser einen gekrümmten Meniskus. Diese Krümmung erzeugt einen enormen Sog – die Kapillarkraft.
5. Kollaps: Während die Flüssigkeitsoberfläche in die Poren "zurückweicht", zieht diese Kapillarkraft die empfindlichen Zellwände, Mikrovilli oder anderen dreidimensionalen Strukturen zusammen. Das Ergebnis sind Schrumpfungs- und Kollapsartefakte. Die Probe wird ihr ursprüngliches, natürliches Volumen und ihre Feinstruktur nicht bewahren.
2. Die Lösung: Die Entwässerung (Wasser -> Alkohol)
Da Wasser eine so hohe Oberflächenspannung hat und sich nicht direkt mit CO2 mischt, muss es zuerst ersetzt werden.
- Warum Alkohol? Alkohol (z.B. Ethanol oder Aceton) mischt sich sowohl mit Wasser als auch mit dem später verwendeten flüssigen CO2. In einer aufsteigenden Alkoholreiße (z.B. 30%, 50%, 70%, 90%, 100%) wird das Wasser in den Zellen nach und nach durch Alkohol ersetzt. Wichtig: Auch beim Verdunsten von Alkohol würden Kapillarkräfte auftreten (seine Oberflächenspannung ist zwar geringer als die von Wasser, aber immer noch vorhanden), daher ist das nur ein Zwischenschritt.
3. Die Kernlösung: Der Ersatz durch flüssiges CO2 und der kritische Punkt
Jetzt kommt der entscheidende Teil, der direkt Ihre Frage beantwortet: Warum gibt es beim Verdampfen des CO2 keine Schrumpfungsartefakte?
Die Antwort liegt nicht darin, dass CO2 "einfach so" verdampft wird, sondern wie es verdampft wird – nämlich durch das Durchschreiten des kritischen Punktes.
1. Ersatz durch flüssiges CO2: Die alkoholgetränkte Probe wird in einen Druckbehälter (die "Kritische-Punkt-Trocknungsanlage") gegeben. Dort wird der Alkohol bei niedriger Temperatur (ca. 10°C) und hohem Druck durch flüssiges CO2 ausgespült und ersetzt. Die Probe ist nun von flüssigem CO2 durchtränkt. Bis hierher ist die Probe noch von einer Flüssigkeit umgeben und vor Kapillarkräften geschützt.
2. Die Erwärmung über den kritischen Punkt: Nun wird der Behälter verschlossen und die Temperatur langsam erhöht.
- Der Kritische Punkt von CO2: Der kritische Punkt von CO2 liegt bei einer Temperatur von ca. 31°C und einem Druck von ca. 74 bar.
- Wenn man diesen Punkt erreicht und überschreitet, geschieht etwas Besonderes: Die Unterscheidung zwischen der flüssigen Phase und der gasförmigen Phase verschwindet. Das CO2 befindet sich nun in einem Zustand, der als überkritisches Fluid bezeichnet wird.
- In diesem Zustand hat das CO2 Eigenschaften, die zwischen einer Flüssigkeit und einem Gas liegen – vor allem hat es keine Oberflächenspannung mehr.
3. Die schadstofffreie "Verdampfung": Jetzt, im überkritischen Zustand, wird der Druck langsam abgelassen (während die Temperatur über 31°C gehalten wird). Das überkritische Fluid entweicht als Gas, aber ohne dass jemals eine Phasengrenze (Flüssigkeit/Gas) gebildet wird.
Da es keine Phasengrenze gibt, gibt es auch keinen Meniskus und folglich keine Kapillarkräfte, die die feinen Strukturen zerstören könnten.
Zusammenfassung und Analogie
- Problem mit Wasser: Wasser hat eine hohe Oberflächenspannung. Beim Verdampfen entsteht eine Phasengrenze, die durch Kapillarkräfte die Probenstruktur wie ein nasser, zusammenfallender Schwamm kollabieren lässt.
- Lösung mit CPT: Man umgeht das Problem, indem man die Phasengrenze komplett vermeidet.
1. Wasser -> Alkohol: Alkohol ist mit beiden Phasen kompatibel (Zwischenträger).
2. Alkohol -> flüssiges CO2: CO2 hat einen leicht zugänglichen kritischen Punkt.
3. Über den kritischen Punkt: Man bringt das CO2 in einen Zustand (überkritisches Fluid), in dem es keinen Unterschied mehr zwischen Flüssigkeit und Gas gibt. Es hat also keine Oberflächenspannung.
4. Ablassen: Man lässt das Fluid als Gas entweichen, ohne dass jemals eine zerstörerische Phasengrenze entsteht.
Stellen Sie es sich wie ein Luftschloss vor: Wenn Sie einen nassen Sandsandhaufen an der Luft trocknen lassen (Verdunstung), zieht die Kapillarkraft das Wasser nach oben und der Sandhaufen kann einstürzen. Wenn Sie aber den gesamten Sandhaufen in einen Zustand versetzen könnten, in dem das Wasser schlagartig *überall gleichzeitig* verschwindet, ohne dass sich eine Oberfläche bildet, würde die Sandstruktur exakt so stehen bleiben, wie sie war. Genau das macht die Kritische-Punkt-Trocknung für biologische Proben im REM.
2026-02-26 08_43_23-Saved Messages.jpg
Quelle:
https://www.mgw.or.at/cellulose-mikrofibrillen-bei-micrasterias-fimbriata/
eigentlich müßte in das Diagramm noch der Bereich überkritisch eingezeichnet oder als Fläche markiert werden.
Hall Wolfgang,
wo werden die Proben eigentlich abgelegt, damit ihr sie wiederfindet?
Liebe Grüße
Rudolf
Guten Tag, Rudolf,
wir haben es so gemacht: In ein CPD-Tönnchen haben wir innen 25µ-Gaze auf die zu groben Metallsiebe aufgelegt, da war das gezeigte Objekt dann drauf.
Liebe Grüße
Wolfgang
Schöne Arbeit, Wolfgang!
Just wondering, do you have experience with HMDS as a drying agent, instead of critical point drying?
Best, René
Hi René,
that was our first attempt at CPD with algae, I will definitely remember HMDS!
Best, Wolfgang
Danke Wolfgang,
jetzt weis ich endlich was meine Masern auf der Micrasterias sind: Micrasterias thomasiana mit Masern? (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=46813.msg345028#msg345028)
Ich habe da noch eine Frage: Hast du deiner Micrasterias teilweise die Haut (Primärwand) abgezogen?
Weil bei den REM-Aufnahmen in diesem pdf (Seite 4): "Splitting of Micrasterias fimbriata (Desmidiales, Viridiplantae) into two monophyletic species and description of Micrasterias compereana sp. nov. (https://pdfs.semanticscholar.org/26f8/a334bf6381b09c048cf48c759f2673f1c134.pdf)" ist nämlich von deinen Mikrofibrillen nichts zu sehen.
LG
Leo
Hallo Leo,
mit der Erhaltung dieses dünnen Häutchens hatten wir entsprechend Glück.
LG
Wolfgang
Moin Wolfgang,
was sind "CPD-Tönnchen"? Ich finde das nicht.
vermutlich Behälter für "Critical Point Drying", Cpd abgekürzt.
Und wie sehen die aus?
Auch ein Bild von dem Trocknungsgerät wäre schön.
Liebe Grüße
Rudolf
Hallo Wolfgang,
wie könnte man jetzt einen Kyrobruch erzeugen, damit man die inneren Strukturen, Aufbau erkennen kann?
Vielleicht gibt es dazu auch Alternativen?
Spannender Artikel. Ich arbeite mich vor.
Liebe Grüße
Rudolf
https://www.protisten.de/
Zitat von: Wolfgang Bettighofer in Februar 25, 2026, 22:20:29 NACHMITTAGSHi René,
that was our first attempt at CPD with algae, I will definitely remember HMDS!
Best, Wolfgang
Was it a positive or negative experience with HMDS, Wolfgang?
Thanks, René
Hallo Rene,
wie ich an meiner verunglückten Übersetzung dessen, was ich ausdrücken wollte, erkenne, ist es hilfreicher, wenn ich in Deutsch antworte und du ggf. Tante Google bemühst ;)
Ich wollte ausdrücken, dass ich mir HMDS für den Fall merke, dass ich wieder Gelegenheit habe, mit jemandem zu sprechen, der langjährige Erfahrung mit CPD von Kleinlebewesen hat, um ihn zu fragen, ob er damit schon gearbeitet hat.
- So, I have no experience with HMDS and I'll ask someone with deep experience in CPD if he would have ever used HMDS.
Best
Wolfgang
Hallo Rudolf,
hier gibt es Bilder und Text zu dem, was wir gemacht haben:
https://www.mgw.or.at/cellulose-mikrofibrillen-bei-micrasterias-fimbriata/ (https://www.mgw.or.at/cellulose-mikrofibrillen-bei-micrasterias-fimbriata/)
Diese kleinen Probenbehälter für die Kritischpunkttrocknung sind nicht abgebildet, ich versuche eine Beschreibung.
Es sind tonnenförmige Metallbehälter mit Durchmesser sowie Höhe von ca. einem Zentimeter, die mittig aufschraubbar sind. In den beiden abschließenden Kreisflächen sind Metallsiebe mit einer Lochgröße von ca. 1/2 mm. Auf diese zu groben Siebe haben wir 25µm-Gaze aufgebracht.
Liebe Grüße
Wolfgang
Aha, jetzt ist mir alles klar. Es ist manchmal schwierig, die Feinheiten anderer Sprachen zu verstehen.
Ich arbeite selbst nicht sehr oft mit weichen Algen, verwende dann aber HMDS. Einen direkten Vergleich mit CPD habe ich eigentlich nie gemacht. Marien van Westen hat in meinem Labor CPD häufig mit Zieralgen verwendet. Mit Erfolg übrigens, obwohl er oft Probleme mit dem Schleim hatte, der wie eine Decke über den Algen liegt. Das haben wir nie optimiert, Marien hat lieber Proben untersucht, als viel Zeit darauf zu verwenden.
Herzliche Grüße, René
Übersetzt mit DeepL.com
Ah, Marien van Westen! Seine Sieralgen in Drenthe ist für mich ein sehr hilfreiches Buch, und von dem Problem mit den Gallertschichten auf den Desmids kann ich auch ein Lied singen!
Die Sieralgen zusammen mit Frans' Cosmarium-Werk, den Desmids of the Lowlands von Coesel/Meesters und den Büchern von Lenzenweger liegen gerade griffbereit, weil Desmidiaceenbestimmung angesagt ist:
(https://www.protisten.de/old-content/_Ablage/Sieralgen.jpg)
Hartelijke groeten,
Wolfgang
Lieber Wolfgang,
nach längerer Zeit habe ich hier ins Forum mal reingeschaut und bin gerade über deinen tollen Beitrag gestolpert.
Ich kann auch den REM Meistern ihres Faches auch nicht das Wasser reichen wollte aber, weil passend zum Thema HDMS und CPT ist, unterschiedliche Ergebnisse aufzeigen, die mit HDMS auftreten können.
Alle drei Zieralgen wurden gemeinsam in einer Charge entwässert und zeigen trotz dem unterschiedliche Ergebnisse.
Ich schätze mal, dass hier der Austausch von Restwasser / Alkohol / Azeton gegen HDMS nicht 100%ig war.
Meines Wissens nach verzeiht die CPT diesbezüglich solche Fehler, da das Verhältnis CO2 zum Restalk. bzw. Azeton viel größer ist und HDMS gegenüber CO2 am kritischen Punkt halt eine Flüssigkeit ist.
LG
Bernd
Hallo Rudolf -
wenn sich jemand als Fachmann outet, muss er damit rechnen zu Rate gezogen zu werden -
hier mein Problem:
Ich habe einige seeeehr alte REM-Fotos von Mehltau infizierter Blattepidermis. Zum Teil Gefrierbrüche, die den seitlichen Einblick in Epidermiszellen erlauben.
Leider sind meine Unterlagen bei einem Umzug ins Nirwana verschwunden und ich weiß ich nicht mehr wie wir die damals genau hergestellt haben, nachdem sich die kritische Punkt Trocknung als recht umständlich erwiesen hatte.
Ich weiß nur noch, dass im Labor reichlich flüssiger Stickstoff im Thermosgefäß vorhanden war, außerdem auch Trockeneis. Meiner Erinnerung nach hatten wir die Blattstücke auf den Alutellerchen für das REM fixiert. Dann haben wir Propan irgendwie tiefgekühlt um es in Schlicker zu verwandeln. Damit wurden dann die Tellerchen mit den Blattstücken tiefgefrostet (??).
In diesem Zustand wurden sie dann ins REM eingesetzt und darin durch Evakuieren "gefriergetrocknet". Der Vakuumpumpe scheint das nicht geschadet zu haben.
Könntest Du mir hier Tips geben, die vielleicht meiner Erinnerung auf die Sprünge helfen und eine geistige Verbindung zu KPT herstellen könnten?
Viele Grüße
Rolf
Hallo Rolf,
du beschreibst ja schon in Ansätzen, wie du das mit dem Kyrobruch gemacht hast.
Ich kenne jemanden im Verein, der ein REM im Keller stehen hat. Der wollte immer CPD/KPT machen. Konnte mir auch nicht so richtig erklären wie das funktioniert und ich bin auch sonst nicht so richtig drauf gekommen.
Die Erklärung zum Thema KPT scheint mir schlüssig.
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?msg=388318
ZitatRLU: "wie könnte man jetzt einen Kyrobruch erzeugen, damit man die inneren Strukturen, Aufbau erkennen kann?"
Ich kann Dir da nicht weiterhelfen. Finde das Thema mit den Kyrobrüchen sehr interessant, weil es den Blick in die Zelle erlaubt. Die Frage ist ja jetzt, ob du die KPT vorher angewandt hast. Oder vielleicht hat man das Restwasser zum Auf-Sprengen benötigt?
Da schließt sich auch die nächste Frage an, warum man nicht immer auch zusätzlich "sprengt", man will die Gebilde doch auch von innen sehen?
Liebe Grüße
Rudolf
Hi Rolf, my two cents:
Freezing in liquid N2 is inefficient due to the insulating layer of boiling gas around the specimen. Better is to freeze in N2 slush, which is colder than N2 at boiling point. Liquid propane can be used as it cools your specimen a lot quicker than nitrogen. The propane is kept in liquid state with liquid nitrogen (au bain marie ;-).
SEM specimen can be imaged in frozen hydrated condition on a (cold) cryostage in the SEM, or freezedried in a vacuum (sublimation of the internal water from ice to gass).
The specimen can be broken to expose internal structures in the SEM, before or after freezedrying, but it needs drying before imaging in the SEM, otherwise you will be looking at a solid chunk of water in the specimen.
The frozen specimen can also be cut in a cryotome ('shaved') to expose the internal cel architecture on organelle level. The shaved surface was then shadowed with a layer of carbon on a cold stage in a carbon evaporator. The resulting replica surface was imaged on the TEM (at least in the 90's). This is far more critical than traditional SEM viewing, as it needs very quick freezing (vitrification) in order to avoid freeze artefacts by ice-crystals. It worked for only a couple of cell layers thick.
At the time ('90's) there was a lot of interest in the membrane surfaces of organelles.
Best, René
Hallo Rolf,
Zitat von: reblaus in März 07, 2026, 20:04:17 NACHMITTAGSIch weiß nur noch, dass im Labor reichlich flüssiger Stickstoff im Thermosgefäß vorhanden war, außerdem auch Trockeneis. Meiner Erinnerung nach hatten wir die Blattstücke auf den Alutellerchen für das REM fixiert. Dann haben wir Propan irgendwie tiefgekühlt um es in Schlicker zu verwandeln. Damit wurden dann die Tellerchen mit den Blattstücken tiefgefrostet (??).
In diesem Zustand wurden sie dann ins REM eingesetzt und darin durch Evakuieren "gefriergetrocknet". Der Vakuumpumpe scheint das nicht geschadet zu haben.
Es gibt zu dem Thema Berufenere als mich. Aber ich erinnere mich noch dunkel an das, was mir damals mein Chef lang und ausführlich erklärt hat (ich habe aber nie selber elektronenmikroskopiert), das kann ich ja mal zum Besten geben:
Wirft man Blattschnipsel oder so in Flüssigstickstoff, so ist das wohl eine sehr zuverlässige Methode, mikrometergroße Eiskristalle , die unschöne Artefakte erzeugen, zu bilden. Daher wirft man die Probe in mit Flüssigstickstoff tiefgekühltes Propan, weil damit höhere Abkühlraten erzielbar sind (Propan zeigt kein Leidenfrostsches Phänomen). Also gibt das keine Eiskristalle, wenn man das richtig macht.
Und dann muß man fix sein. Will man kein Eiskristallwachstum nach dem Einfrieren, so muß man (so damals mein Chef) die Probe dauernd, immerzu und ununterbrochen unter etwa -80 °C halten.
Oder man bricht die in einer Apparatur (damals war das ein Gerät von der Größe einer ausgewachsenen Anrichte) auf (Gefrierbruch), läßt ggf. im Vakuum ein wenig von dem Eis absublimieren (Gefrierätzung), bedampft/besputtert die Probe und mikroskopiert dann - zumindest für klassisches TEM - den abgelösten Abdruck (Platin-Kohle-Schrägbedampfung mit Kohle-Stützschicht).
Bis zum Schritt Gefrierätzung muß bei TEM und (klassischem) REM, (also nicht "schlecht-Vakuum"-REM) eigentlich alles gleich sein.
Hilft Das irgendwie bei den Erinnerungen?
Viele Grüße von Marcus
Ich sehe gerade, ich war zu langsam...
Zitat von: bernd552 in März 07, 2026, 19:00:03 NACHMITTAGSLieber Wolfgang,
nach längerer Zeit habe ich hier ins Forum mal reingeschaut und bin gerade über deinen tollen Beitrag gestolpert.
Ich kann auch den REM Meistern ihres Faches auch nicht das Wasser reichen wollte aber, weil passend zum Thema HDMS und CPT ist, unterschiedliche Ergebnisse aufzeigen, die mit HDMS auftreten können.
Alle drei Zieralgen wurden gemeinsam in einer Charge entwässert und zeigen trotz dem unterschiedliche Ergebnisse.
Ich schätze mal, dass hier der Austausch von Restwasser / Alkohol / Azeton gegen HDMS nicht 100%ig war.
Meines Wissens nach verzeiht die CPT diesbezüglich solche Fehler, da das Verhältnis CO2 zum Restalk. bzw. Azeton viel größer ist und HDMS gegenüber CO2 am kritischen Punkt halt eine Flüssigkeit ist.
LG
Bernd
Lieber Bernd,
vielen Dank für die Info! Und, ja, sehr schöne REMs, perfekt aufgestellt! :)
Wir werden also zusehen, den Materialverlust bei den Einzellern in der KPD/CPD in den Griff zu bekommen, auch deswegen, weil eine KPD-Anlage vorhanden ist, die anderen "Reagentien" aber nicht ;)
Nun heißt es aber eh erstmal warten, bis wir wieder in Tirols Mooren sind und neue Zieralgen geschöpft haben! Aktuell bin ich virtuell in den Mooren und bastle Bilder aus den Rohaufnahmen des vergangenen Jahres:
(https://www.protisten.de/old-content/_Ablage/INET.jpg)
LG
Wolfgang