Liebe Forumsmitglieder,
Holger Weis hat mir freundlicherweise eine Diatomeen-Suspension geschickt, die ursprünglich von Anne Gleich gespendet wurde (vielen Dank!), und am 25. September haben wir sie gemeinsam per Videoanruf angesehen – ich saß am Mikroskop, Holger verfolgte das Livebild und verglich es mit dem, was er aus seiner eigenen Dunkelfeldarbeit kennt. Dies war unser erster Versuch mit dem FrTIR-Gerät an Diatomeen; versteht es also bitte als ersten Eindruck und nicht als abgeschlossene Studie. Die Bilder sahen gut aus, hatten aber einen starken Grünstich, der deutlicher war als das, was wir im Okular sehen. Im Folgenden beschreiben wir, wie wir der Ursache in den darauffolgenden Tagen auf die Spur gekommen sind. Wir veröffentlichen die Ergebnisse gemeinsam.
Aufbau
Normales biologisches Durchlichtmikroskop mit dem FrTIR-Gerät unter dem Präparat (Modus 2, für transparente Präparate); Lichtleiter 1,8 mm dick. Kein Dunkelfeldkondensor.
Lichtquelle: weißer LED-Streifen von Tesfish, 12 V, SMD2835, 4000 K (CRI vom Verkäufer nicht angegeben; bei diesem Typ üblicherweise 70–80).
Objektive: 10x/0,24, 20x Nikon M Plan SLWD/0,35, 40x/0,65 (dazu ein 5x für Abb. 1). Kamera: Moticam 10MP.
Schritt 1 – 25. September: der Grünstich
Diatomeen in Flüssigkeit (destilliertes Wasser) unter einem Deckglas auf einem gewöhnlichen Objektträger, mit Immersionsöl an das FrTIR-Gerät angekoppelt. Kamera-Weißabgleich auf die Voreinstellung 5000 K gesetzt, die Kontrastfunktion ,,Enhance" der Kamera eingeschaltet. Die Kamerabilder waren stark grün, während wir im Okular nur einen schwachen Grünschimmer sahen. Die Frage war also: Woher kommt das Grün? Unsere Verdächtigen waren die LEDs, der Acryl-Lichtleiter, der gläserne Objektträger und die Kamera.
Schritt 2 – 27. September: ,,Enhance" aus
Mit ausgeschalteter Enhance-Funktion verschwand das zusätzliche Grün in den dunkleren Bildbereichen – Enhance schneidet das dunkle Ende des Bildes ab und übertreibt jeden Farbstich, der dort vorhanden ist. Ein gleichmäßiger Grünstich blieb jedoch bestehen (Abb. 1).
Fig1 - 27 Sept, slide, 5000K preset, 5x 10x 20x.jpg
Abb. 1 – 27. September: Objektträger, Weißabgleich-Voreinstellung 5000 K, Enhance aus. Dasselbe Feld mit den Objektiven 5x, 10x und 20x, so wie aufgenommen
Kontrolle Wir haben einige einfache Glasperlen unter denselben Bedingungen aufgenommen, WB5000K,
Enhance EIN und die Perlen auf einem Objektträger präpariert.
Fig2 - 25 Sept, glass beads, slide, 5000K preset, Enhance on, 20x - 800px.jpg
Abb. 2 – 25. September: Objektträger, Weißabgleich-Voreinstellung 5000 K, Enhance ein.
Schritt 3 – 28. September: ohne Objektträger
Holger vermutete, dass das Eisen, das in gewöhnlichem Objektträgerglas enthalten ist, das Licht grün färben könnte, da das Licht in diesem Aufbau einen langen Weg durch das Glas zurücklegt. Um das zu prüfen, habe ich einen Tropfen der Diatomeen-Suspension direkt auf den Acryl-Lichtleiter gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt – ganz ohne Objektträger. Mit derselben 5000-K-Voreinstellung war der Grünstich genau derselbe wie mit Objektträger (Abb. 3, links). Der Objektträger ist also nicht die Ursache.
Fig3 - 28 Sept, no slide, white balance 5000K vs custom, 20x.jpg
Abb. 3 – 28. September, ohne Objektträger: dasselbe Feld bei 20x mit der 5000-K-Voreinstellung (links) und dem manuellen Weißabgleich (rechts); sonst wurde nichts verändert.
Schritt 4 – 28. September: manueller Weißabgleich
Schließlich habe ich die Kamera von der 5000-K-Voreinstellung auf einen manuellen Weißabgleich umgestellt, eingestellt auf das tatsächliche Licht (an einer stark reflektierenden weißen Stelle). Dadurch verschwand der größte Teil des Grüns (Abb. 3, rechts), und die Bilder entsprechen jetzt dem, was wir im Okular sehen – das selbst einen schwachen Grünschimmer zeigt. An den Diatomeen gemessen sank das Grün/Rot-Verhältnis des Bildes etwa 1,4 mit der Voreinstellung auf etwa 1,1 mit dem manuellen Weißabgleich (1,0 wäre neutral).
Fazit: Das starke Grün wurde hauptsächlich durch die 5000-K-Weißabgleich-Voreinstellung der Kamera erzeugt und durch die Enhance-Funktion noch verstärkt. Da dieser Grünschimmer aber auch im Okular zu sehen war, fragen wir uns weiterhin, woher er stammt. Er könnte – sehr wahrscheinlich – ein Teil der Ursache für das ,,grüne Zeug" sein, das wir bisher mit dem FrTIR-Gerät gesehen haben.
Handhabung
Der Hauptunterschied zu einem Dunkelfeldkondensor liegt in der Handhabung: Ein Dunkelfeldkondensor muss zentriert und fokussiert und beim Wechsel des Objektträgers oder Objektivs neu justiert werden, was recht fummelig sein kann. Beim FrTIR-Gerät gab es nichts auszurichten – einfach den Revolver drehen und bei Bedarf nachfokussieren.
Bilder
Jede Serie zeigt dieselbe Diatomee mit den Objektiven 10x, 20x und 40x; das FrTIR-Gerät wurde zwischen den Objektivwechseln nicht berührt, nur der Fokus wurde verstellt.
Serie 3 – radiäre Schale mit Rippen und Randkammern
Fig4a - Set 3 - 10x.jpg
Abb. 4a – Serie 3, 10x.
Fig4b - Set 3 - 20x.jpg
Abb. 4b – Serie 3, 20x.
Fig4c - Set 3 - 40x stack.jpg
Abb. 4c – Serie 3, 40x, Fokusstapel aus 3 Einzelbildern.
Abb. 4a–c: 28. September, ohne Objektträger, manueller Weißabgleich, Enhance aus. Einzelbilder werden so gezeigt, wie sie aufgenommen wurden, nur verkleinert. Der 40x-Fokusstapel (Abb. 4c) wurde nur ausgerichtet und zusammengeführt – keine Änderungen an Farbe, Helligkeit oder Kontrast.
Viele Grüße
Holger Weis & Ramon Pujals