Liebe ForumskollegInnen
Heute habe ich wieder einmal mein Glück versucht, das Opfer war Winterjasmien, konkret ein Ästchen :-)
Bevor ich Euch meine Arbeitsanleitung hinein kopiere die Problembeschreibung. Vor dem Eindecken gibt es bei mir noch eine Kontrollschleife am Mikroskop mit 100x ==> dort überprüfe ich wie die Färbung funktioniert hat und ob das Präparat "eindeckwürdig" ist. Heute hatte ich da nicht viel zu tun :-((
Ich habe einmal 4 und einmal 3 Schnitte durch die Färbung geführt und alle hatten mehr oder weniger große Risse & dabei waren am Ende des Schneidens alle 7 Markellos. Dieser Kontroll-, besser Aussortierschritt erfolgt am WILD M3 bei 40x (die Schnitte die in der engeren Wahl stehen), die restlichen wandern schon bei 16x in die Tonne ...
Anbei eine genaue Arbeitsanleitung was ich für Schritte durchlaufen habe:
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4 Färben:
1. Alkoholreihe 70% und 30%igen (Ethanol) in der Blockschale, max. 4 Präparate) ⇒ je 1ne Minute
2. Aqua entmin. 3 Stufen in der Bockschale ⇒je 1ne Minute
3. Klorix-Lösung 1:10 in der Blockschale ⇒ 3 bis 9 Minuten, es wurden 6 Minuten als Basiszeit gewählt. Je nach Schnittdicke wurde bei den einzelnen Schnitten verlängert bis die Anmutung gleich wirkt. Nach dem Aufbringen verfärbt sich der Schnitt leicht bräunlich und verblasst ...
4. Aqua entmin. 2 Stufen in der Bockschale ⇒hier werden die unterschiedlichen Bleichzeiten wieder zusammengefahren!!!
5. Rotfärbung mit Acridinrotlösung in der Blockschale ⇒ 6 bis 10 Minuten, es wurden ca. 8 gewählt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Schnitte nicht übereinander liegen und immer wieder bewegt werden um neuen Farbstoff an das Objekt zu führen.
6. Auswaschen mit Aqua dest. In 3 Stufen ⇒ je 15 bis 20 Sekunden (bis keine roten Farbwölkchen aus dem Präparat entweichen)
7. Blaufärbung mit Astrablaulösung in der Blockschale ⇒ 0,5 bis 2 Minuten, es wurden ca. 30 Sekunden gewählt.
8. Auswaschen mit Aqua dest. In 3 Stufen ⇒ je 15 bis 20 Sekunden (bis keine roten Farbwölkchen aus dem Präparat entweichen)
9. Entwässern mit 3x gewechseltem Isopropylalkohol ( 99,9 % )
10. In Terpineol überführen, dient zur Qualitätsverbesserung der Entwässerung (verhindert das Aufsteigen von weißen Wölkchen im Xylol)
11. Als letzte Stufe vor dem Eindecken Xylol (oder Rotihistol) in 2 Stufen einzusetzen ⇒ ca. 2 Minuten
5 Eindecken:
• 10. Vor dem Eindecken werden die gefärbten Schnitte auf Qualität überprüft, dazu werden sie auf einem Objektträger übergeführt und mit 100 facher Vergrößerung überprüft. Risse und Fasern (Unreinheiten) sind das Auswahlkriterium ...
• Einschluss
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Für Tipps bin ich wie immer dankbar :-))
Gerhard
Hallo Gerhard,
alles ganz toll, aber wo sind die Risse? Zeigst Du mal ein Bild?
Hallo Gerhard,
Du mutest Deinen Schnitte ganz schön viel zu - kein Wunder dass sie reissen.
Ich nehme an, Du möchtest mit Klorix anstelle von AFE fixieren? Das geht zwar prinzipiell aber Klorix greift das Gewebe sehr stark an. Versuche erstmal die klassische Methode. Hast Du kein AFE kannst Du problemlos essigsauren Alkohol nehmen. Essigessenz kaufen (25% Essigsäure) und mischen: 7 Teile Ethanol, 1 Teil Essigessenz und 2 Teile Aqua dest. Dies geht genauso gut wie AFE - allerdings musst Du länger fixieren (30 Minuten sind ein guter Richtwert). Nun musst du die Fixierlösung und die ausgelösten Stoffe entfernen. Dazu müssen die Schnitte länger in den jeweiligen Bädern verweilen als Du es beschrieben hast:
30 Minuten Fixieren mit essigsaurem Alkohol
5 Minuten Ethanol 70%
3 Minuten Ethanol 50%
3 Minuten Ethanol 30%
5 Minuten Aqua dest. (3 x wechseln)
8 Minuten Rot (ich nehme an, Du benutzt eine Acridinrot/Acriflavin Lösung als erste Stufe)
1 Minute spülen in Aqua dest.
2 Minuten Astrablau - dies aber mit Aqua dest. verdünnt benutzen - also immer auf die Farblösung im Blockschälchen etwa gleichviel Aqua dest. geben
1 Minute spülen
In Isopropanol entwässern und eindecken.
Viel Erfolg!
Eckhard
Hallo Eckhard
Ich habe mit AFE fixiert, die Geschichte mit dem Klorix soll die Zellen säubern (kommt von den Profis hier) ==> hat übrigens bei der Nordmanntanne super funktioniert?!?
:-)
Gerhard
Ps: ein Bild kommt Morgen, das Eindeckmittel trocknet gerade und ist noch zu weich ...
Hallo Gerhard,
ich bin der Meinung, daß Du das Chlorix stärker verdünnen solltest, ich nehme immer auf ein Blockschälchen 3 Tropfen. Das Bleichen dauert zwar länger, ist aber schonender.
Viele Grüße
Rainer
Hallo Gerhard,
ZitatKlorix soll die Zellen säubern
Ich mache das nur in Ausnahmefällen wie z.B. bei der Linde, um Sekrete die die Färbung beeinträchtigen zu entfernen.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Liebe KollegInnen
Heute habe ich eine zweite Runde gemacht und neu geschnitten und mit den Tipps von Eckhard Chlorix weggelassen und bei anderen 3 Tropfen auf 15ml Aqua demin eingesetzt. Vor der Färbung habe ich alle mit 100x am MIC untersucht ==> in keinem Fall Risse, alle Schnitte so wie vor den Behandlungsschritten (dort untersuche ich die Schnitte ja schon immer unter dem STEMI bei 40x).
Und das Ergebnis nach dem Färben unmittelbar vor dem Einbetten:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/56782_15040622.jpg)
und ein anderer Schnitt
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/56782_12685729.jpg)
Die Bilder sind bei 100x aufgenommen und nix optimiert (RAW-Daten in jpg umgewandelt). Die Fotoqualität ist also M..., aber Ihr seht meinen Fehler ...
:-)
Gerhard
Halle Gerhard,
Risse habe ich auch manchmal, das lässt sich nicht immer vermeiden. Es gibt ein paar Tricks, die man bei empfindlichem Material einsetzen kann. Aber bevor wir darauf kommen, hast Du die Zeiten entsprechend meines "Rezeptes" angepasst?
Herzliche Grüsse
Eckhard
Hallo Eckhard
"2 Minuten Astrablau - dies aber mit Aqua dest. verdünnt benutzen - also immer auf die Farblösung im Blockschälchen etwa gleichviel Aqua dest. geben" ==> ich habe unverdünnt gearbeitet und 1 Minute gefärbt ...
Und an Stelle von direkt nach ISO eindecken muss ich die beiden Schritte 10 und 11 machen, ich decke zur Zeit mit EUKITT ein:
==> 10. In Terpineol überführen, dient zur Qualitätsverbesserung der Entwässerung (verhindert das Aufsteigen von weißen Wölkchen im Xylol)
==> 11. Als letzte Stufe vor dem Eindecken Xylol (oder Rotihistol) in 2 Stufen einzusetzen ⇒ ca. 2 Minuten
Meine Wässerungszeiten sind etwas länger wie Deine (50%) ..., aber da kann das Problem ja nicht begraben liegen :-)
==> ein Gutes hat die Sache ja, ich übe schneiden ... :-))
:-)
Gerhard