Mikro-Forum

Hallo,

ich frage mich ob man ein normales 0 8 15 Mikroskop nicht irgendwie zum Fluoreszenzmikroskop umbauen könnte?

Sagen wir wr haben ein Objekt mit GFP (Emittiert bei 509 nm und absorbiert mit zwei maxima bei 395 und 475 nm).

Würde es nicht reichen einfach in den Tubus einen Filter zu legen, welcher ein Fenster bei um die 509 nm hat und mit einer Spektrallampe mit Kaltlichleiter mit entsprechender Wellenlänge anzuregen?

Mit so einem Mikroskop müsste doch auch nur die Zellen zu sehen sein die grünes Licht emittiern?

Oder gehört da noch mehr dazu?

Gruß Hyperion

ZitatOder gehört da noch mehr dazu?

Nö eigentlich nicht. Vielleicht zur Sicherheit noch ein LP 490 davorschalten, damit nix von der Anregung durch kommt.

Hallo,

das ist die klassische Durchlicht-Fluoreszenz. Dazu brauchte man früher natürlich ein schmalbandiges Anregungsfilter hinter der Lichtquelle und die Sperrfilter im Strahlengang hinter dem Objektiv, manchmal einfach auf dem Okular aufgesteckt. Die Anregung kann man heute einfach mit einer Royal-Blue LED reagieren.

Detlef

Hier mal ein Schnellschuß  :D

absolut nicht optimal, es geht besser. Aber auch in der ganz einfachen Version kann man Fluoreszenzaufnahmen machen.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58410_63646225.jpg)
Christrose , Etzold grün
Weisse 3 Watt LED mit Blaufilter BG12 , Sperrfilter einfaches Gelbfilter GG495 , Kamera DFK72 , Nachbearbeitung in PaintShopPro. Kosten für Filter ?

Grüße
Peter H.

Oh, ich habe nicht gewusst, dass es SO einfach ist...

Hallo,

es geht sogar noch einfacher:

Unterhalb des Kondensors ein Polarisator, oberhalb der Objektive ein Analysator. Polarisator und Analysator in Kreuzstellung bringen, so dass eine möglichst perfekte Blockade des Lichtes erreicht wird. Nun den Kondensor in Dunkelfeldposition bringen.

Das Ergebnis ist eine Durchlichtfluoreszenzeinrichtung. Mit einer hinreichend starken Beleuchtung (Beispiel unten 50W Halogen) hat man Anregungslicht über das gesamte Spektrum und einen Sperrfilter, der das gesamte Anregungslicht auslöscht.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58434_59358425.jpg)
10x EC Plan Neofluar, Rotalge mit Autofluoreszenz des Chlorophylls 

Herzliche Grüsse
Eckhard

Hallo Eckhard,

diese Anordnung zur Fluoreszenz verstehe ich nicht. So wie Du es beschreibst ist das Durchlicht-Pol kombiniert mit Durchlicht Dunkelfeld.
Wieso soll das zur Fluoreszenzbeobachtung geeignet sein?

Fluoreszenz setzt voraus: ein Materie, die zur Fluoreszenz geeignet ist (bei niedriger Wellenlänge Strahlung zu absorbieren und bei nach höherer Wellenlänge verschoben wieder zu emittieren)
Dafür benötigt man eine möglichst nach oben begrenzte Anregung und ein Sperrfilter, dass die Emision durchlässt, aber die Anregungswellenlänge sperrt.

Man kann die DL-Fluoreszenz wie von Peter beschrieben machen und den Kontrast noch verbessern durch zusätzliches DF
Beispiel dafür: Ein Präparat von Robin Wacker. Im Durchlicht DF mit 100W Halogen und einem Kristallviolett-Filter als Anregungsfilter und einem LP 500 als Sperrfilter. Ohne DF gibt es Überstrahlungen.


(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58437_17776322.jpg)

Hallo Klaus -

warum zweifelst du?

Der Trick ist doch wirklich gut: Anregungslicht kommt wegen der gekreuzten Polfilter nicht durch - wohl aber das rote Fluoreszenzlicht des Chlorophylls, das ja nicht polarisiert ist.
Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Viele Grüße

Rolf

Oh das klingt aber interessant!!!

Analysator und Polarisator hätte ist da, was heisst Kondensor in Dunkelfeldstellung bringen?

Hallo Rolf,

das ist eine sehr unkonventionelle Betrachtungsweise:

ZitatEinschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

bedeutet alle Polbetrachtungen bei gekreuzten Polarisatoren sind eigentlich Fluoreszenzen? :D Polmikroskope sind somit auch Fluoreszenzmikroskope?

Ich würde mal sagen, dass die Einschränkung vorherrschend ist!

Hallo Polfluoreszierende,
das beschriebene Verfahren zur "Polfluoreszenz" hat neben der schon erwähnten, nicht zu unterschätzenden "Verunsicherung" durch doppelbrechende Objekte außerdem den Nachteil, daß auch das nichtpolarisierte(!) Fluoreszenzlicht beim Durchgang durch den Analysator merklich geschwächt wird; es kommt davon bestenfalls in der Größenordnung von ca. 30 % hindurch. Im Gegensatz dazu versucht man in der Fluoreszenzmikroskopie ja allgemein, Helligkeits-Verluste - insbesondere bei Fluoreszenzen geringer Intensität - zu vermeiden, indem man Objektive möglichst großer Numerischer Apertur, nicht zu hoher Vergrößerungen und hoher Transmission einsetzt. Es ist sicher ein ganz interessanter "Gag"; als wirklich brauchbares Mikroskopie-Verfahren ist es - wie Herr Herrmann schon sagt - wohl kaum zu betrachten.
Fluoreszenzfreundliche Mikrogrüsse
H. Husemann

Hallo Klaus -

dann hier die Version für Polmikroskopiker mit streng wissenschaftlicher Herangehensweise:

Achtung! Vor der Veröffentlichung von Messdaten ist durch ein Kontrollexperiment nachzuweisen, dass die postulierte Doppelbrechung nicht in Wirklichkeit durch Fluoreszenz vorgetäuscht oder verfälscht ist  ;D

Gruß

Rolf

Hallo,

ZitatEinschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Ja, das stimmt - wobei die Einschränkung sich im praktischen Gebrauch als hilfreich erweist, wie im unten gezeigten Beispiel, wo Grünalgen und Cyanobakterien sauber differenziert werden.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58454_18554378.jpg)
10x EC Plan Neofluar, Grünalge mt aufsitzenden Cyanobakterien

Natürlich kann dieses Verfahren nicht in Konkurrenz zu kommerziellen Fluoreszenzlösungen stehen: neben dem von Herrn Husemann erwähnten Verlust von Fluoreszenzlicht durch den Analysator wird die Probe von unten angeregt und von oben betrachtet. Dabei treten weitere Verluste von Anregungslicht bzw. Fluoreszenzlicht auf. Kommerzielle Lösungen gehen daher über eine Auflichtanregung. Deshalb ist das vorgestellte Verfahren für die professionelle Arbeit mit Fluorochromen ungeeignet. Aber für erste Experimente reicht es vollkommen aus - gerade die Autofluoreszenz des Chlorophylls lässt sich sehr gut beobachten. Ob man das als Gag betrachtet, muss jeder für sich selbst entscheiden.

Die Eingangsfrage dieses Threads war, ob sich ein Normalmikroskop mit einfachen Mitteln umbauen lässt, um Fluoreszenz zu beobachten. Darauf habe ich eine Antwort gegeben und eine Lösung vorgestellt.

Herzliche Grüsse
Eckhard

ZitatAchtung! Vor der Veröffentlichung von Messdaten ist durch ein Kontrollexperiment nachzuweisen, dass die postulierte Doppelbrechung nicht in Wirklichkeit durch Fluoreszenz vorgetäuscht oder verfälscht ist 

Fehlt noch der Nachsatz: wer es dennoch tut zahlt 2 Mark und fließt in die Gemeindekasse ::)

Zitatgerade die Autofluoreszenz des Chlorophylls lässt sich sehr gut beobachten. Ob man das als Gag betrachtet, muss jeder für sich selbst entscheiden.

Schönes Bild! Was ich mich allerdings frage: Das Chlorophyll emittiert eigentlich im Roten:

ZitatWird die Fluoreszenz spektral aufgelöst, so kann man aus dem gemessenen Fluoreszenz-Emissionsspektrum auf die Farbstoffzusammensetzung einer Probe schließen. Die Fluoreszenz des Chlorophylls liegt zwischen 650 und 800 nm mit Maxima bei 690 nm (dunkelrot) und 740 nm (nahes infrarot

Haben wir es dann hier mit Fluoreszenz zu tun? Und das war doch die Frage?

Ich habe schon viele Aufnahmen im polarisierten Durchlicht von Pflanzenzellen mit Chloroplasten gemacht, dabei aber noch nie "Rot gesehen"

Auf dem Bild, das als Beleg gezeigt wird sind die Chloroplasten der Grünalge doch grün!

In meinem Bild haben wir die Rotfluoreszenz von Chlorophyll am Beispiel von Algen:Nicht gerade scharf, aber rot!

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58457_22532018.jpg)

Liebe Mitmikroskopiker,

Hier drei Zellen der Mundschleimhaut, mit ein wenig Acridinorange, in einfacher Durchlichtanregung Halogen, 30 Watt:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58458_51397520.jpg)

Mikrogrüße

Jürgen

Lieber Jürgen,

das ist aber dann die "koventionelle" DL-Fluoreszenz mit Anregungsfilter und Sperrfilter.  ;)

Im Prinzip so einfach wie Polarisation zu realisieren und nicht teurer - aber durchaus zur wirklichen Fluoreszenz geeignet! :D

Hallo,

ist noch nicht eimal das Weiße vom Ei, passt aber gerade gut zum Beitrag.

Altes Mikroskop von Winkel/Göttingen mit handelsüblicher UV-LED als Auflichtbeleuchtung und einem Orange-Sperrfilter auf dem Okular.
(ein Weißabgleich muss aber vor der Aufnahme gemacht werden)



Liebe Grüße
Frank

Das ist doch mal eine interessante und erfrischende Diskussion über einen banalen Zweig der Mikroskopie. Unbefangen und und dazu mit Bildern garniert.
Danke und Gruß - EFH

Hallo Herr Nowack,
so "banal" ist die Fluoreszenzmikroskopie aber gar nicht; heute spielen Verschiedene ihrer Varianten eine wichtige Rolle in der Mikroskopie.
Fluoreszenzfreundliche Mikrogrüsse
H. Husemann

Nein, Herr Husemann, natürlich nicht. So war das auch nicht gemeint, sondern eher im Zusammenhang mit der längeren Anwendung der Fluoreszenz in der Mikroskopie.
Gruß - EFH

Vielen Dank für die Antworten!

Ich hätte nicht gedacht, das es doch so gut funktioniert! Dann kann ich ja bei Bedarf mal ein paar Spielereien mit meinen Bakterien machen!

Zitatso "banal" ist die Fluoreszenzmikroskopie aber gar nicht; heute spielen Verschiedene ihrer Varianten eine wichtige Rolle in der Mikroskopie.

Ganz recht, was wäre die moderne Wissenschaft ohne Fluoreszenzmikroskopie!

Ohne die müsste man für z. B. Proteinlokalisation in Zellen wieder irgendwleche Goldlabelings verwenden und das ganze im TEM anschauen oder Wäre auf Immunhistochemie beschränkt.

In einer lebenden Zelle die Wanderung eines Proteins über den sekretorischen Weg vom ER übern Golgi in Vesikel und aus der Zelle live beobachten? Das geht nur mit Fluoreszenz.

Die zahl der Techniken die auf Fluoreszenz basieren ist überwältigend gewachsen in den letzten Jahren.

Und warum geht es bei mir nicht ?

Zunächst einige Algen unter üblicher Auflich-Fluoreszenz mit Blauanregung Zeiss BP450-490 , FT510 , LP520.
So wie man es erwartet !
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58494_19793834.jpg)

Nun die "neue" Methode.
Mit Polfilter an der Leuchtfeldblende, Dunkelfeldkondensor, Analysator-Pol gekreuzt.
Wer sieht nun eine rote Fluoreszenzerscheinung ?
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58494_6240834.jpg)

Nachdenkliche Grüße
Peter H.

Lieber Peter,

warum fragst Du Dich? Es ging doch nirgends - oder hast Du einen Beleg gesehen? :D

Mit polarisierten Grüßen

Klaus

ZitatMit Polfilter an der Leuchtfeldblende, Dunkelfeldkondensor, Analysator-Pol gekreuzt.
Wer sieht nun eine rote Fluoreszenzerscheinung ?

Die wird wohl nicht in der Schwingungsebene des Analysators liegen... ;D

Lieber Klaus,

Eckhard hat doch sogar ein Bild gezeigt. Oder bin ich auf den Leim gegangen  ???

@ Bernd
also so selektive Polfilter habe ich nicht. Wäre aber mal eine neue Variante  ;D

Grüße
Peter

Hallo Peter H. -

hast du denn auch eine 50W-Halogenlampe beim Durchlicht verwendet oder die übliche Funzel? Außerdem sind auf Eckhards Bild doch ganz andere Zellwände vorhanden - vielleicht lassen die das Pollicht besser durch?

Aber mal im Ernst: Wenn jemand zeigen könnte, dass die Chlorophyllfluoreszenz polarisiert ist, wäre das deeeer Knüller.

Etwas mehr Phantasie, meine Herren!

Viele Grüße

Rolf

Lieber Peter,

ZitatEckhard hat doch sogar ein Bild gezeigt

Ja schon, aber das war eines für rot-grün-Blinde. Für mich sind die Chloroplasten der Grünalge auf jeden Fall so wie sie sein sollen:

grün  ;D sie sollten aber rot ;D fluoreszieren 

Lieber Klaus,

um es kurz zu machen, ich bleibe bei meiner Version, blau im Auflicht anregen, grün mit Dunkelfeld durchstrahlen und im Bild dann sehen was rot fluoresziert  oder grün reflektiert. Ist nicht die streng wissenschaftliche Version  :D , aber zu Demozwecken schön bunt.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58520_54547642.jpg)
Leitz Fluotar 25/0,55 , Blauanregung , Kamera DFK72 Imaging Source , 10 Bilder mit HF gestapelt.

Grüße
Peter

Hallo Klaus -

irgendwas ist mir an der Argumentation noch unklar:
Eckhard hat doch im 6. Beitrag einen (nicht besonders brilliant aber immerhin) rot fluoreszierenden Algenfaden gezeigt?
Wenn das nicht der Fall ist, muss einer von uns zum Augenarzt! ::)

Viele Grüße

Rolf

Hallo Rolf,

ZitatWenn das nicht der Fall ist, muss einer von uns zum Augenarzt!

ob der uns hierbei hilft? Ich bin fehlsichtig, aber durchaus farbtüchtig!

In meiner Argumentation beziehe ich mich auf das 2. Bild, auf dem man unschwer rote Algenfäden sieht, die auf einer deutlich grünen Alge sitzen.
Da vermute ich stark, dass die grüne Farbe von Chloroplasten kommt, die wiederum Chlorophyll enthalten.
Nun wird diese Bild herangezogen als Beleg dafür, dass die Methode mit Polarisation im DL in Kombination mit DF zur Fluoreszenzanregung des Chlorophylls geeignet ist.

Nehmen wir mal an das geht tatsächlich - ich bezweifle das - dann ist dieses Bild als Beleg nicht geeignet, weil da die "Methode" eindeutig versagt!

Oder leuchtet das Chlorophyll auf diesem Bild für Dich tiefrot, wie man das erwarten sollte?

Bei den roten Fäden auf dem selben Bild habe ich keine Ahnung, wie sie im normalen HF oder DF aussehen. Man könnte auch das für Polarisation Naheliegende annehmen: es ist eine doppelbrechende Matrix, die durch geeignete Schichtdicke eben gerade die Interferenzfarbe rot ergibt.
Das könnte man überprüfen durch Zuschalten eines Kompensators.

Und nun warte ich auf schöne Zieralgen die durch Polarisation rot fluoreszieren! Bitte Feuer frei! Das gibt einen schönen Artikel im Mikrokosmos für das Aprilheft! ;)

Als Vorgriff auf diesen Aprilartikel biete ich hier schon mal ein Bild mit polychromatischer Fluoreszenz durch Polarisation: ;D  ;D  ;D


(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58531_21860825.jpg)

Verehrte Freunde

seltsamerweise fiel die allgemeine Reaktion vor zweieinhalb Jahren wesentlich positiver aus:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=396.0

Ich persönlich hatte das ja als genial abgespeichert. Die Diskussion liess keinen anderen Schluss zu. Sollte ich da was revidieren müssen??


Viele autofluoreszierende Grüsse (Farbe Ihrer Wahl  ;D)

Bernhard

Ja und,

was habe ich damals geschrieben?

Dir Bernhard vielen Dank, vor allem für Dein gutes Gedächtnis und Deine gute Buchführung!

Also meine aktuelle Anmerkung: Cyanobakterien und Chloroplasten von Grünalgen heben offenbar unterschiedliche Schwellen für das Einsetzen von Autofluoreszenz. Das hat Eckhard gut gezeigt.

Herzliche Grüße

Detlef

Hallo zusammen,

na dann können wir den Bogen vielleicht mal schließen.

Auf Eckhards Bild fluoresziert kein Chlorophyll in einem Algenfaden, sondern ein Phycobilin in einem Cyanobakterium

Aus Wikipedia:

ZitatDie Phycobiline decken für die Photosynthese Wellenlängenbereiche ab, in denen das Chlorophyll nicht absorbiert. Die eingefangene Energie wird von Phycoerythrin gegebenenfalls auf Phycocyanin und von Phycocyanin auf das Chlorophyll übertragen. Dabei ist die Quanteneffizienz der Phycobiline sogar höher als die des Chlorophylls.

Mit Hilfe dieser akzessorischen Pigmente können Blaualgen ausgesprochene Schwachlichtbereiche besiedeln, wie beispielsweise die Unterseite von Flussgeröll oder die Tiefenschichten von Gewässern. Sie können dabei ferner die sogenannte Grünlücke der Chlorophyllabsorption nutzen.

Ich hatte bezweifelt - und tue das immer noch - dass mit der Polarisation die rote Chlorophyllfluoreszenz angeregt und sichtbar gemacht werden kann. Ich habe das noch nie beobachtet und heute 2 Stunden nochmals vergeblich versucht.

Dann ist dieses von Eckhard beobachtete Phänomen wahrscheinlich ausschließlich auf diese Spezies beschränkt; und damit kann man nicht von einer Methode sprechen mit der man auf simplem Wege Fluoreszenz beobachten kann. Es funktioniert eben nur da.

Dennoch ist die Beobachtung bemerkenswert und ich frage mich, ob sie überhaupt schon in der wissenschaftlichen Literatur zu finden ist, geschweige den untersucht ist? Könnte man locker als Diplomarbeit für einen Physikochemiker ausgeben!

Offensichtlich ist die Differenzierung über die Lichtintensität zu erzielen. Unterhalb einer bestimmten Schwelle wird Chlorophyll noch nicht angeregt zur Emission, während die Phycobiline im Schwachlichtbereich schon absorbieren und dann auch emittieren - vielleicht auch in der oben erwähnten Energiekaskade ans Chlorophyll weiter geben und das emittiert dann.

Mit schwach leuchtenen Grüßen - ich bleibe bei der konventionellen Methode, wie sicher mehr als 99% der Fluoreszenzmikroskopiker! :D

Liebe Fluoreszenzler,

mir leuchten einige Punkte nicht ein, aber was solls.
Wenn aber von kräftiger Leuchte 50 - 100 Watt + Polfilter + Digitalkamera über neuartige Effekte berichtet wird, so klingen bei mir die Alarmglocken. Denn :

1. Bei einer Halogenleuchte mit ca. 3200 Kelvin liegt das Strahlungsmaximum bei 900nm (leicht nachzurechnen)
2. Polfilter - auch gekreuzt - werden ab ca. 850nm wieder herrlich transparent
3. Nur Optimisten glauben, dass Digitalkameras mit IR-Sperrfilter keine IR-Strahlung mehr aufnehmen (weil es so im Prospekt steht)

Es können also in solchen Kombinationen verdeckte Effekte auftreten und etwas vorgaukeln. Daher meine Zweifel, ob es wirklich eine Fluoreszenz war, oder ...... ?

Nachdenkliche nächtliche Grüße
Peter H.

Liebe Fluoreszenzexperten,

leider fehlt mir noch die ein oder andere Erleuchtung:

• mir scheint, dass allen ausser mir selbstverständlich ist, dass die Fluoreszenz der Chloroplasten nicht polarisiert ist. Ich hätte ehrlich gesagt gedacht, dass sie genau so polarisiert ist wie das Anregungslicht. Wo liegt denn der Denkfehler?
• hat jemand einen Tipp für mich, wieso es eine Intensitätsschwelle für Fluoreszenz gibt? Ich hätte gedacht, dass es ab dem ersten Photon losgeht, so es die richtige Energie hat.

Vielen lieben Dank

Timm

Lieber Timm,

deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein? Es wird von ungeordnet ausgerichteten Molekülen emittiert. Es handelt sich ja nicht um eine Reflexion.

Zu Deiner zweiten Frage: Das Licht wird von den Chlorophyll-Molekül-Komplexen absorbiert und die Energie wird zur Spaltung von Wasser verwendet und nicht zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht. Lediglich dann, wenn zu viel Licht absorbiert wird, wird dieses als Licht mit einer anderen Wellenlänge abgegeben um eine Schädigung der Moleküle zu vermeiden. Es wird also nur die überschüssige Energie abgegeben, daher die Schwelle.

Herzliche Grüße

Detlef

Hallo Detlef,

herzlichen Dank!

Zitat von: Detlef Kramer in Februar 11, 2011, 11:49:40 VORMITTAG
deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein?

Ich hätte mir das so gedacht: Es gibt in meiner Vorstellung einen Dipol für die Absorption und einen für die Emission. Vielleicht sind beide parallel, müssen sicher nicht, spielt aber auch keine Rolle.

Nun habe ich in der Probe eine große Menge willkürlich ausgerichteter Absorptionsdipole, aber diejenigen, die ungefähr parallel zu der Polarisationsebene ausgerichtet sind werden optimal Energie absorbieren, alle anderen entsprechend weniger. Mein Bauchgefühl würde sagen, dass die Absorption ungefähr proportional zum Cosinus des Winkels sein könnte. Wenn das so wäre, und die beiden Dipole (Emission und Absorption) wären parallel, wären immerhin über 50% des emittierten Lichtes im Bereich von ±15° von der Polarisationsebene des einfallenden Lichtes, was sich doch sicher deutlich auf die Intensität nach dem Analysator auswirken würde.

Vorausgesetzt, dass Molekül dreht sich nicht zu sehr innerhalb der paar Nanosekunden zwischen Absorption und Emission.

Zitat
Zu Deiner zweiten Frage: Das Licht wird von den Chlorophyll-Molekül-Komplexen absorbiert und die Energie wird zur Spaltung von Wasser verwendet und nicht zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht. Lediglich dann, wenn zu viel Licht absorbiert wird, wird dieses als Licht mit einer anderen Wellenlänge abgegeben um eine Schädigung der Moleküle zu vermeiden. Es wird also nur die überschüssige Energie abgegeben, daher die Schwelle.

Ach so, danke!

Herzliche Grüße

Timm

Hallo Timm -

die Photosynthese ist doch eine kompliziertere Angelegenheit. Es handelt sich bei der Chlorophyllfluoreszenz selten um Nanosekunden, sie dauert überwiegend wesentlich länger und es gibt auch die verzögerte Fluoreszenz, von der ein kleiner Bruchteil über Minuten andauern kann.

Viele Grüße

Rolf

Zitat von: reblaus in Februar 11, 2011, 13:01:12 NACHMITTAGS
Hallo Timm -

die Photosynthese ist doch eine kompliziertere Angelegenheit. Es handelt sich bei der Chlorophyllfluoreszenz selten um Nanosekunden, sie dauert überwiegend wesentlich länger und es gibt auch die verzögerte Fluoreszenz, von der ein kleiner Bruchteil über Minuten andauern kann.

Hallo Rolf,

eieiei! Das ist natürlich lang. Wie beweglich ist so ein Chlorophyll denn? Bestimmt ist es doch sehr schwer?

Aber andererseits, was wäre denn, wenn die Blaualgen so polarisiert fluoreszieren, dass es einigermaßen zum Analysator passt und Chlorophyll in den Algen eben nicht polarisiert und damit natürlich nur einen Bruchteil der Intensität hätten?

Aber vermutlich ist die Kramersche Schwellenhypothese als Erklärung wohl überlegen.

Herzlichen Dank

Timm

Zitat von: Detlef Kramer in Februar 11, 2011, 11:49:40 VORMITTAG
Lieber Timm,

deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein? Es wird von ungeordnet ausgerichteten Molekülen emittiert. Es handelt sich ja nicht um eine Reflexion.

...na ja, aber es wird doch hier durch den Analysator betrachtet, also ist es polarisiert.  Dass die Fluoreszenz so stark ist, dass sie im DF durch einen Polfilter immer noch zu sehen ist, habe ich schon vor zwei Jahren nicht glauben können. Aber als Nicht-Physiker vertieft man das lieber nicht.  ;)

Und was ist mit Peters Einwänden? Die scheinen mir sehr plausibel.


Viele Mikrogrüsse

Bernhard


Tante Edit: ok.ok.  man sollte nicht vor dem Mittagessen mit leerem Magen posten. Jetzt hab ich Timms Frage verstanden. Insofern ist mein obiges Geschreibsel Nonsense, meu culpa!

Hallo -

in der Tat finde ich Peters Argumente auch als die naheliegendsten und die wären als erstes zu untersuchen -

aber unabhängig davon wollte ich für Timm noch auf die theoretische Erwägung hinweisen, dass die Energie eines von einem Chlorophyllmolekül "eingefangenen" Photons über eine Reihe unterschiedlich modifizierter Chlorophyllmoleküle weitergereicht wird, bevor sie im Reaktionszentrum landet. Wenn sie dort nicht abgenommen wird, entsteht Fluoreszenz, die aber von ganz anderen Chlorophyllmolekülen ausgeht, als von dem als ersten angeregten und die dürften nichts mehr davon wissen in welche Richtung das Erregerlicht polarisiert war.

Viele Grüße

Rolf

Hallo Rolf,
eine interessante und anschauliche Schilderung. Dazu aber ein paar Fragen:

Zitatdass die Energie eines von einem Chlorophyllmolekül "eingefangenen" Photons über eine Reihe unterschiedlich modifizierter Chlorophyllmoleküle weitergereicht wird, bevor sie im Reaktionszentrum landet.

Was ist ein ´Reaktionszentrum´?

Zitat...entsteht Fluoreszenz, die aber von ganz anderen Chlorophyllmolekülen ausgeht

Demnach geben mehrere Moleküle die Anregungsenergie eines Photons ab, richtig?
Leicht verwirrter Gruß
EFH

Hallo Timm -

der thread ist jetzt doch etwas weit von der Fluoreszenz abgeglitten und es macht hier keinen Sinn in der Photosynthese bröckchenweise weiter in die Tiefe zu gehen - als Anfangslektüre empfehle ich dazu den ordentlichen Wikipedia-Artikel

http://de.wikipedia.org/wiki/Photosynthese

Viele Grüße

Rolf

Hallo,

der Effekt ist physikalisch möglich und die damalige Erklärung wurde nicht angezweifelt:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=396.msg1499#msg1499

Ich verstehe daher die jetzige Skepsis nicht.

Dass die Rotfluoreszenz in dem Algenfaden bei Eckhard nicht sichtbar ist und im aufsitzenden Cyanobakterium dagegen deutlich sichtbar ist könnte ein Intensitätsproblem sein.

Die Rotfluoreszenz im Chlorophyll der Alge wird hauptsächlich durch blau angeregt, wo die Halogenlampe schwach ist und von depolarisierten Streulicht, das den Analysator passieren kann, überstrahlt.
Die sichtbare Fluoreszenz der Cyanobakterien wird dagegen eher vom kräftigen grünen Licht der Halogenlampe angeregt und ist daher kräftiger als das Streulicht.

Das könnte man sehr schnell klären, wenn man die POL-Dunkelfeldanordnung mal mit eine kräftigen blauen LED betreibt. Dann wäre auch die IR Kameraartefaktevermutung von Peter geklärt.

viele Grüsse
Wilfried

Hallo allen Pol- und Fluoreszenzfreunden,

nachdem ich diese Beiträge mit stiller Freude mitlas, muss ich doch gewissermaßen als fast letztes Wort etwas Physik mit einbringen bezüglich Polarisation und Fluoreszenz.

1. Fluoreszenz ist die Abstrahlung von Photonen durch ein dazu veranlagtes Molekül, das zuvor durch  energiereichere  Photonen angeregt wurde. Die notwendige Energieschwelle (Wellenlänge) ist spezifisch für das betreffende Molekül, ebenso die Wellenlänge der Fluoreszenz. Dem Molekül ist es dabei egal, ob die anregenden Photonen polarisiert eintreffen oder unpolarisiert. Eventuell mag es bei ganz speziellen Einkristallen Sonderfälle geben, sind mir aber in meiner Berufspraxis nicht bekannt geworden.

2. Die Photonen der Fluoreszenz sind grundsätzlich unpolarisiert. Dies begründet sich aus der Quantenmechanik. Näheres kann bei Wikipedia oder jedem guten Physikbuch entnommen werden.

3. Die Sperrfilter bei der Fluoreszenz-Mikroskopie dienen a) der Gesundheit des Auges bei UV-Anregung, und b) der Kontrastverbesserung bzw. Vermeidung der Überblendung, wenn der Sensor (Auge, Fotoschicht oder CMOS/CCD) auf die anregende Wellenlänge anspricht.
Polfilter werden zwar manchmal als Quasi-Neutralfilter eingesetzt, sind es aber materialbedingt bestimmt nicht,bzw. nur im sichtbaren Bereich.
Die in den Beiträgen aufgeführten funktionierenden Beispiele sollten keineswegs als grundsätzliche Funktionsweise angesehen werden.  Bei schwacher Fluoreszenzausbeute sieht man nichts, bei starker UV-Anregung sehe ich eine Gefahr für das experimentierfreudige Auge.
Ein Sperrfilter ist so teuer nicht. 

Mit besten Grüssen an alle fluoreszierende
Jürgen


   

Hallo Jürgen,

da Du ja offensichtlich ein Fachmann bist wollte ich Dein "abschließendes Wort" doch noch mal aufgreifen um zu vertiefen.

Dass die Fluoreszenzstrahlung nicht polarisiert ist wurde schon vorher mehrfach vermutet und ist auch plausibel - warum sollte sie auch?

Damit ist der eingangs vermutete Mechanismus zumindest theoretisch möglich:

mit linear polarisiertem Licht wird  - schwach - angeregt; das polarisierte Licht wird im Analysator fast vollständig gelöscht und die - schwache - nicht polarisierte Fluoreszenzemission wird im Analysator wieder linerar polarisiert - und dadurch nochmal geschwächt erscheint sie endlich im Auge des Betrachters, bzw dem Kamerasensor.

Das Fluoreszenzlicht ist aus meiner 30-jährigen Fluoreszenzerfahrung mitunter etwas gering intensiv.

Kannst Du denn mal die Schwächungsfaktoren abschätzen um zu überschlagen, was denn bei dieser Anordnung denn noch an Fluoreszenzlicht ankommt?

Dass die "Methode" keine Alternative ist zu den üblichen Anordnungen mit selektiver Anregung (durch Filter oder schmalbandige Lichtquellen) das ist sicher allgemein akzeptiert, aber ist sie denn überhaupt möglich?

Die ganz banale Erklärung: doppelbrechende Substanz gibt bei gekreuzten Polarisatoren einen Effekt, wäre doch auch eine Erklärung? Wenn die Substanz zirkular polarisiert würde man beim Drehen doch keine Vorzugsrichtung erkennen?

Hallo Jürgen,

Niemand hat behauptet, dass Fluoreszenz zu einer Polarisation von eingangs unpolarisiertem Licht führen könne.

Als letztes Wort will ich deine Statements deswegen nicht stehen lassen. Ich hätte es nett
gefunden wenn du die ein oder andere Quelle zitiert hättest. Was die reine Physik angeht
gab es meines Erachtens hier auch wenig Diskussion. Die Streitpunkte die ich gesehen habe,
drehten sich eher um biochemische Fragen.

Grundsätzlich bin ich der Meinung, dass Detlef und Wilfried wohl die relevanten Erklärungen geliefert haben.

Aber:

Zitat von: jibi in Februar 13, 2011, 15:55:00 NACHMITTAGS
Die notwendige Energieschwelle (Wellenlänge)

Hast Du eine Quelle für die Schwelle? Meines Erachtens handelt es sich um ein Resonanzphänomen, es gibt also eine optimale Wellenlänge und einen schmalen Bereich drumherum! Oberhalb des Optimums ist genau so schlecht, wie unterhalb.

Zitat
ist spezifisch für das betreffende Molekül, ebenso die Wellenlänge der Fluoreszenz. Dem Molekül ist es dabei egal, ob die anregenden Photonen polarisiert eintreffen oder unpolarisiert.

Einem einzelnen Molekül ist das ganz und gar nicht egal! Hast Du eine Quelle dafür? Man berücksichtigt das normalerweise nicht, weil man normalerweise nicht mit polarisiertem Licht arbeitet, aber nur wenn das Licht exakt in der Ebene des absorbierenden Dipols polarisiert ist, wird es ohne Verluste absorbiert. Ich hatte das schon erläutert. Kannst Du physikalisch darlegen, warum das anders sein sollte? Man kann das doch auch leicht beobachten: bringt man einen organischen Farbstoff der mechanisch länger als breit ist meinetwegen in PVC/THF oder wsrg. Polyvinylalkohol o.ä. ein und lässt eindampfen, streckt dann, hat man einen simplen Polfilter. In Lösung ist das oft egal, weil die Dipole gleichmäßig über alle Orientierungen verteilt sind.

Dennoch kommt es auch in Lösungen bei polarisierter Anregung zu einer polarisierten Emission, wenngleich mit einer Streuung durch die Orientierung der Moleküle und eventuelle Veränderungen derselben. In meinem Posting habe ich das erläutert. Wenn die Erläuterung falsch ist, dann sag doch einfach an welcher Stelle! Ich lasse mich gerne präzise und informativ belehren!

Zitat
Eventuell mag es bei ganz speziellen Einkristallen Sonderfälle geben, sind mir aber in meiner Berufspraxis nicht bekannt geworden.

Fluoreszenzpolarisation ist ein durchaus verbreitetes Routineverfahren zum Beispiel zu Bestimmung von Bindungskonstanten. Das geht unter Umständen sogar ohne Fluoreszenzmarker.

Herzliche Grüße

Timm

Hallo,

mehrere Anmerkungen zu der Diskussion der vergangenen Tage:

Die Halogenlampe ist mit einem Infrarotfilter versehen. Über den Wirkungsgrad kann ich nichts sagen - ich verlasse mich darauf, dass die Firma Zeiss keine Generation von halbblinden Mikroskopikern hinterlässt!

Eine Wechselwirkung mit dem Infrarotfilter der Kamera ist auszuschliessen - die Fluoreszenz ist auch im Okular zu beobachten.

Das Drehen des Tisches hat keinen Einfluss auf die Intensität oder die Farbe.

Zitat von: Klaus HerrmannAuf Eckhards Bild fluoresziert kein Chlorophyll in einem Algenfaden, sondern ein Phycobilin in einem Cyanobakterium

Phycobilin fluoresziert orange und nicht rot!


Ich kann den Effekt bei Cyanobakterien, Kieselalgen und Rotalgen nachstellen. Nicht ab und zu, sondern immer.

Ein positiver Einfluss der Zellwand kann ausgeschlossen werden - austretendes Plasma mit Chlorophyll a zeigt dieselbe Autofluoreszenz.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/58818_15025934.jpg)

Die interessante Frage ist natürlich, warum zeigen Grünalgen diesen Effekt nicht? Ursprünglich hatte ich dies auf die schützende Funktion der Zellulose Zellwand geschoben. Aber austretendes Plasma mit Chlorophyll in zerquetschten Grünalgen zeigte diesen Effekt auch nicht. Ich denke daher, dass die zur Autofluoreszenz nötige Lichtmenge von der Art des Chlorophylls abhängig ist. Für das in den Grünalgen vorkommende Chlorophyll b scheint die Lichtmenge in meinem Aufbau nicht ausreichend zu sein.

Ich bin kein Biologe oder Chemiker, aber ich kann mir nicht vorstellen, dass Autofluoreszenz bei Chlorophyll unter Beibehaltung der Schwingungsebene passiert.


Das Nachstellen sollte für Herrn Jülich in seinem Vorführraum keine 10 Minuten dauern. DIK Schieber vorher entfernen!

Herzliche Grüsse
Eckhard

Zitat von: Eckhard in Februar 13, 2011, 22:03:52 NACHMITTAGS

Ich bin kein Biologe oder Chemiker, aber ich kann mir nicht vorstellen, dass Autofluoreszenz bei Chlorophyll unter Beibehaltung der Schwingungsebene passiert.

Hallo Eckhard,

bei Chlorophyll kann ich es mir bis auf weiteres auch nicht mehr vorstellen, siehe Beiträge von Rolf!

Viele liebe Grüße

Timm

Hallo Eckhard,

der wichtigste Satz für mich :
Eine Wechselwirkung mit dem Infrarotfilter der Kamera ist auszuschliessen - die Fluoreszenz ist auch im Okular zu beobachten.
Nun allerdings grüble ich noch mehr, wieso ich mit der Anordnung keinen Schimmer einer Fluoreszenz erkennen kann.

Viele Grüße
Peter

Hallo nochmals,
das habe ich nun davon, wenn ich vereinfachenden Senf zu einer sehr komplexen Thematik abgeben will.
Meine Statements bezogen sich ausschließlich auf die Fluoreszenz-Mikroskopie mit biologischen Proben. Auch die Titulierung "Fachmann" (@Klaus) muss ich dankend zurückgeben, ich habe in meiner aktiven Zeit nur einige kleine Teilabschnitte der Fluoreszenz beackert.
Ich gelobe, in Zukunft vereinfachende Aussagen tunlichst ausführlich mit Literaturquellen und Zitaten zu schmücken oder besser: sie mir verkneifen.


@Timm:
Du hast natürlich recht, wenn Du das einzelne Molekül betrachtest. Das anregende Photon muß ja erst vom Molekül absorbiert werden, damit es eine Fluoreszenz auslösen kann. Deshalb gibt es auch einen strengen Zusammenhang von Dipol und der Schwingungsebene des eintreffenden Photons. In der biologischen Probe sind die zu aktivierenden Moleküle in der Regel bekanntlich deutlich unsortiert aufgestellt, weshalb man zur besseren Ausbeute ein möglichst breites Angebot (also unpolarisiert) einstrahlen sollte. Bei speziellen Proben (z.B.Mineralogie) kann es durchaus Sinn machen, der besseren Ausbeute wegen mit polarisierter Anregung zu arbeiten. Bezüglich der Wellenlänge der Anregung ist Deine Aussage ebenfalls richtig: siehe unten.
Zur Frage der Polarisationsebene der Fluoreszenz: meines Wissens erfolgen die Übergange von Aktivierung und Deaktivierung des beteiligten Elektrons nicht gekoppelt, woraus eine nichtpolarisierte Fluoreszenz resultiert. Falls ich mich irre, kann ein gelernter Physiker nähere Aufklärung bringen.

@Klaus, Timm:
Die Erklärung zur Energieschwelle (Wellenlänge) steckt schon in der o.g. Absorption des Anregungs-Photons. Da in der Regel die Wellenlänge der Anregung kürzer ist als die Wellenlänge der Fluoreszenz (Ausnahme: Resonanz-Fluoreszenz), muß man zur Anregung eine starke Absorptionsbande des betreffenden Moleküls unterhalb der Fluoreszenz-Wellenlänge heranziehen. Und bekanntlich zeigen große organische Moleküle meist, nicht immer, breite UV-Absorptionsbanden. Deshalb die Anregung meistens im nahen UV. Ideal wäre natürlich eine durchstimmbare Quelle von 200-500nm, doch da beisst sich wohl doch Aufwand und Strahlhelligkeit. Aber bei der üblichen Fluoreszenz-Mikroskopie spielt das meist keine Rolle, da die verwendeten Fluorochrome und selbstfluoreszierenden  Naturstoffe in der Regel eine sehr breite UV-Absorption aufweisen.


Mit besten Grüssen
Jürgen

Zitat von: reblaus in Februar 09, 2011, 13:10:43 NACHMITTAGSDer Trick ist doch wirklich gut: Anregungslicht kommt wegen der gekreuzten Polfilter nicht durch - wohl aber das rote Fluoreszenzlicht des Chlorophylls, das ja nicht polarisiert ist. Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Hallo Rolf,
die zusätzliche Dunkelfeld-Beleuchtung schaltet ja auch das Licht von im Präparat möglicherweise vorhandenen doppelbrechenden Strukturen weitgehend aus - jedenfalls deren flächenhafte Abbildung. Die Beschränkung auf die im Präparat gebeugten Strahlen scheint mir für die Kontrastierung (hier v.a. die Unterdrückung des Anregungslichtes) mindestens genauso wichtig wie die polaristionsoptische Ausblendung der Anregungsstrahlung.

Die Intensität eines primären, bzw. eines durch Doppelbrechung veränderten Lichtstrahls wäre i.a. so viel intensiver als ein sekundäres, durch eben diesen Strahl erzeugtes Fluoreszenz-Licht, dass die Fluoreszenz nicht erkennbar wäre. Deshalb, und zur Unterdrückung von möglichst allem unerwünschten (hier: ungebeugten) Licht muss neben der "Pol-Kontrastierung" noch eine zweite Kontrastierungsmethode her: Dunkelfeld-Beleuchtung eben.

Eckhards Methode ist möglicherweise bereits beschrieben und evtl. für viele professionelle Aufgabenstellungen zu unspezifisch. Aber deswegen finde ich sie umso eleganter und - wie schon vor 2 Jahren - genial! Sie widerlegt die immer wieder gepflegte Mär, man könne Fluorezenzbeobachtungen nur mit einem aufwändigen, empfindlichen und v.a. teuren Gerät realisieren und das dann auch bitte nur für gaaaanz spezielle Wellenlängen und Farbstoffe.

Preiswert und breitbandig fluoreszierende Grüße, Thomas

Hallo Thomas,

ZitatSelbst Auflicht-Fluoreszenz geht leichter, als man gemeinhin denkt (http://depatisnet.dpma.de...ger&action=einsteiger; als Titel "Gesteinsuntersuchungen" eingeben ).

Vielleicht habe ich die Patentschrift falsch verstanden, der Kniff ist doch, dass eine LED als Lichtquelle vorgeschlagen wird um HBO oder Ähnliches zu ersetzen. Aber es wird schon auch noch mit Anregungs und Sperrfiltern gearbeitet. (Dass das patentfähig ist?)

Also nicht vergleichbar mit den preiswerten "Polmikroskopen" die mit Polfiltern aus Plastik arbeiten und Kompensatoren aus einem Schnipsel Zellophanpapier, womit man schon mal schön bunt machen kann, aber optisch nicht ganz sauber ist.

Hallo Klaus,
welche Patentschrift?
Eckhard hatte früh in der Diskussion recht klar formuliert, dass er zusätzlich zum Pol-Kontrast auch Dunkelfeld-Kontrast einsetzt. Fluoreszenzphänomene (die übrigens auch da sind, ohne das man sie erkennen kann!), die bei Betrachtung eines wunderschönen Präparats von Robin Wacker mit einer soundso-Färbung zwischen gekreuzten Polarisatoren (aber ohne Dunkelfeld!) nicht sieht, bringen uns also nicht weiter...
Gruß, Thomas

Hallo,

ich habe das Fluoreszenz Prinzip mit Dunkelfeldkondensor und Polfiltern an einem Präparat mit Wacker 3A  Färbung mal ausgeführt. Mit Weisslicht Halogen 100 W sehe ich keine Fluoreszenz, da die Pol Filter im normalen Mikroskop ohne POL Optik nicht ganz dicht machen. Das mag bei Eckhardt besser sein, da er zumindest DIC Optik im Einsatz hat. Aber wenn ich mit der Blauen LED ohne Anregungsfilter anrege sieht man die Fluoreszenz schon.
Aber noch besser geht es mit einem Gelben Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang. Da hat man sowohl im Auflichtdunkelfeld als auch im Durchlichtdunkelfeld hervorragende kräftig leuchtende Fluoreszenz vor absolut dunklem Untergrund die der normalen Anregung über Anregungsfilter und dielektrischem Spiegel in nichts nachsteht.

Aber ob ein guter Auflicht- bzw. Durchlichtdunkelfeldkondensor  plus Sperrfilter viel billiger ist als ein Fluoreszenzkondensor?
Es ist vielleicht eine Alternative wenn man Dunkelfeld schon hat und nur noch den Sperrfilter braucht.

viele Grüsse
Wilfried

Hallo Thomas,

dass es um die Kombination von DF und Pol geht bei der beschriebenen Methode ist mir durchaus geläufig und wenn Du das liest, was ich geschrieben habe, dann sollte das deutlich werden, dass ich das begriffen habe.
Ich habe auch Beispiele gezeigt, wo mit einer Royalblue-LED (Du magst diese exakte Bezeichnung, wenn ich mich recht erinnere) - unterstützt durch DF - im Durchlicht Fluoreszenz gemacht wird. Bei mir aber konventionell mit einem LP 520 Sperrfilter.

Zitatwelche Patentschrift?

Ist das keine Patentschrift auf die Du hingewiesen hast in Deinem Link? Mir schien das so! Das was ich gelesen habe geht in feiner Patentmanier über 10 Seiten. Kannst Du denn das Wesentliche in ein paar prägnanten Sätzen zusammenfassen - offensichtlich ist mir was Entscheidendes entgangen.

Ich muss sagen, dass sich mir die verblüffend einfache Methode noch nicht erschlossen hat; ich kriegs nicht hin! Peter Höbel offensichtlich auch nicht - aber vielleicht sind wir die Einzigen?

Du bist doch auch gut ausgerüstet, kannst Du denn nicht mal was zeigen?

Zitat von: wilfried48 in Februar 14, 2011, 18:28:44 NACHMITTAGS(...)ob ein guter Auflicht- bzw. Durchlichtdunkelfeldkondensor  plus Sperrfilter viel billiger ist als ein Fluoreszenzkondensor?

Lieber Wilfried,
nach meiner Erfahrung ist das nicht nur billiger, sondern v.a. auch viel universeller. Anders als mit dem sehr spezifischen Ansatz "ein Farbstoff, ein Anregungsfilter, ein Sperrfilter" (nicht völlig ernst gemeint) bietet Eckhards Pol-Dunkelfeld-Methode den Vorzug, Fluoreszenz in ganz verschiedenen Banden erkennen zu können. Zugegeben, nicht immer sehr intensiv, aber in Hyperions Frage ging es ja um erstmal um die Möglichkeit, möglichst schlicht zur Fluoreszenzbeobachtung zu kommen.

Und das geht (und zwar auch ohne Sperrfilter)! Ich habe es vor 2 Jahren auf Eckhards ersten Bericht hin ausprobiert und war begeistert, einen weiteren Weg zu finden, dieses faszinierende Phänomen mit "Bordmitteln" beobachten zu können. Auch wieder zugegeben: unter meinen Bordmitteln befinden sich Pol-Objektive, die das Gesichtsfeld zwischen gekreuzten Polarisatoren überhaupt nicht aufhellen. Aber es ging auch mit eher gewöhnlichen Achromaten (63/o,80 und 40/o,85 Öl) sehr gut.

Schönen Gruß, Thomas

Lieber Thomas,

ich werde es nachher mal an meinem Polarisationsmikroskop versuchen. Aber wenn es nur unter dieser Voraussetzung
gut geht wäre das für mich keine Alternative zum klassischen Fluoreszenzmikroskop da es mindestens doppelt so teuer war und auch heute noch ist.
Mit billigen Polfiltern ohne Poloptik an einem Routinemikroskop mit lichtschwacher Halogenbeleuchtung wird man sicher nicht glücklich.

viele Grüsse
Wilfried

Also,

mir geht langsam der rote Faden verloren. Deshalb nur noch eine Anmerkung von mir: das Ganze kann natürlich nur mit lebendem Pflanzenmaterial funktionieren. Präparate, mit Wacker gefärbt - nee dat wird nix!

Ansonsten finde ich Eckhards Ansatz in sich logisch - hoffe ich habe nichts übersehen.

Herzliche Grüße

Detlef

Hallo Detlef,

ZitatPräparate, mit Wacker gefärbt - nee dat wird nix!

Acridinrot und Acriflavin sind Fluoreszenzfarbstoffe!

Die Lichtausbeute ist bei dem Verfahren mit gekreuzten Polarisatoren meiner Erfahrung nach zu gering, um Acridinrot oder Acriflavin zur Fluroreszenz anzuregen.

Ich teile die Meinung, dass es eine Intensitätsfrage ist, wann auch Chlorophyll b (Grünalgen) zur Autofluoreszenz angeregt wird. Evolutionär ist Chlorophyll b eine Weiterentwicklung von dem älteren Chlorophyll a. Es ist deswegen nicht unwahrscheinlich, dass Chlorophyll b eine grössere Lichtmenge verträgt, bevor die nicht nutzbare Energie mittels Autofluoreszenz wieder abgegeben wird.

Herzliche Grüsse
Eckhard

Hallo an alle,
ein sehr interessanter Exkurs, speziell über die Polfiltermethode. Habe mal eben Wikipedia befragt (Stichwort: Polarisationsfluoreszenz). Dort steht im ersten Abschnitt, dass - bis auf "wenige Ausnahmen", die leider nicht näher spezifiziert werden -, bei Einstrahlung von polarisiertem Erregerlicht auch das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert ist, wobei das Emissionslicht in zwei Ebenen schwingt. Eine Ebene ist parallel zu der des Erregerlichts, die andere steht senkrecht hierzu. Dies bedeutet, dass bei der von Eckhard beschriebenen Methode infolge der Kreuzstellung von Polarisator und Analysator nur die senkrecht zum Erregerlicht stehenden Anteile des Emissionslicchts zur Abbildung beitragen. Je nach Objekt scheinen die Intensitäten der beiden emittierten Strahlenanteile unterschiedlich zu sein, d.h. manche Objekte führen schwerpunktmäßig zu Emissionslicht, welches parallel zum Analysator schwingt, andere Objekte verhalten sich umgekehrt. Auch dies könnte vielleicht erklären, weshalb bei manchen Objekten die Fluoreszenz bei dieser speziellen Methode relativ intensiv erkennbar ist, bei anderen Objekten hingegen nicht.
Hoffe sehr, keinen spontanen Denkfehlern aufzusitzen.
Schöne fluoreszierende Grüße
Jörg Piper

Hallo Detlef,

also die Farbstoffe in der Wackerfärbung sind sehr fluoreszenzintensiv. Wenn ich jemandem schell Fluoreszenz zeigen will dann nehme ich immer ein Wackerpräparat und eine blaue LED, das geht sogar in jedem hellen Raum.
Wenn es mit dem Wackerpräparat nicht geht, weiss ich nicht mit was es sonst gehen soll. Mit der Quecksilberdampflampe HBO 100 am Fluoreszenzkondensor ist die Fluoreszenz sogar derart hell, dass man sich fast schon eine Dimmung der Lampe wünscht.

Mit einem solchen Präparat habe ich es gerade am Polmikroskop mit 100 W Halogen, Dunkelfeldkondensor und gekreutzten Polarisatoren versucht. Ohne Objekt ist jetzt also der Hintergrund absolut dunkel !
Mit Objekt ist nur das depolarisierte Streulicht im Dunkelfeld zu sehen, das die Fluoreszenz überstrahlt.
Mit Blaufilterung der Halogenlampe durch ein Anregungsfilter ist die Fluoreszenz dann zu sehen.
Werden die Polfilter dann durch ein 530 nm Sperrfilter ersetzt wird die Fluoreszenz erst richtig brilliant!

viele Grüsse
Wilfried

Lieber Wilfried,

tut mir leid, so habe ich es nicht gemeint und mich wohl auch falsch ausgedrückt. Was ich zum Ausdruck bringen wollte: Chlorophyll-Eigenfluoreszenz kann man natürlich nur an lebenden Zellen bekommen. Und darum ging es doch Eckhard!

Herzliche Grüße

Detlef

Liebe autonom Fluoreszierende,

mit großem Interesse verfolge ich jetzt diesen Beitragsfaden, gibt er doch für mich leuchtende Einblicke in das allgegenwärtige Blattgrün.
Um das Feuer noch etwas zu schüren, hätte ich einen kleinen Druck von P. Metz zu "Einfache Einrichtungen zur Fluoreszenzmikroskopie und Photographie" (1930) anzubieten.

http://www.npshare.de/files/2f15c91a/P%20Metzner%20Einrichtungen%20zur%20Fluoreszenzmikroskopie%20und%20Mikrophotographie.pdf

Danke und herzliche Grüße
Frank

Hallo an Alle -

damit der thread nicht etwa frühzeitig zum Erliegen kommt:

Die Besonderheiten der Chlorophyllfluoreszenz im Photosyntheseapparat (Verzögerung, Kautsky-Effekt etc.) treten tatsächlich nur in funktionsfähigen ("lebendigen") Chloroplasten auf und das dürfte wohl zu den Ausnahmen bei den von J. Piper zitierten Ausführungen zur Polarisationsfluoreszenz (leider im deutschen Wiki nicht gefunden ?!) zählen.

@detlef:
Das Chlorophyll in toten Zellen (z.B. kurz erhitzten Blättern) fluroresziert jedoch immer noch sehr schön, auch in Lösung (Chloroform, Alkohol etc.). Da verhält es sich dann auch wie ein Fluoreszenzfarbstoff (vielleicht sogar nach dem zitierten Prinzip: Pol rein, Pol raus)

Viele Grüße

Rolf

Lieber Rolf,

danke für die Klarstellung. Isolierung von Chlorophyll in Chloroform und die Beobachtung, dass die Lösung im Gegenlicht rot ist, war einer meiner ersten und beeindruckendsten Versuche in meinem physiologischen Praktikum, ca. 1965; der Assistent war ein gewisser Dr. W. W. Franke, Sport-Anhängern als Anti-Doping-Kämpfer bekannt.

Wir haben die Gewebe dazu aber nicht in FPA fixiert, entwässert, gefärbt und in Kunstharz eingebettet. ;D

Herzliche Grüße

Detlef

Hallo Frank,

ein absolut polarisierender Beitrag! :D

Schön finde ich die Zusammenfassung in der gesagt wird, dass einige einfache Anordnungen zur Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie beschrieben werden. Was haben wir es doch heute einfach: bissel Royal Blue-LED; Sperrfilter und schon leuchtet das Chlorophyll ;)

Hallo´le,

tja, und wenn da nicht diese IR-Sperrfilter wären, könnte man auch noch fluoreszierende Bande im IR-Bereich "sehen", (also über eine Kamera, klar). Und dann kann wieder interpretiert und gerätselt werden.. (Einige haben die IR-Sperrfilter ja schon aus ihren Okularkameras verbannt ;D  ;D  ;D ).

Viel Spass - da unten!

Guy

Zitat von: reblaus in Februar 15, 2011, 00:05:58 VORMITTAG
Die Besonderheiten der Chlorophyllfluoreszenz im Photosyntheseapparat (Verzögerung, Kautsky-Effekt etc.) treten tatsächlich nur in funktionsfähigen ("lebendigen") Chloroplasten auf und das dürfte wohl zu den Ausnahmen bei den von J. Piper zitierten Ausführungen zur Polarisationsfluoreszenz (leider im deutschen Wiki nicht gefunden ?!) zählen.

Hallo Rolf,

streiche Polarisationsfluoreszenz, setze Fluoreszenzpolarisation, dann klappt es mit der Wikipedia ;-)

Viele liebe Grüße

Timm

Hallo Rolf,

http://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzpolarisation

Timm war schneller, aber ich machs Dir noch leichter.

Ist ja sehr einfache Beschreibung des Phänomens! 8)

Hallo,
danke für den Hinweis auf meinen Wortverdreher (Fluoreszenzpolarisation versus Polarisationsfluoreszenz). Interssant bleibt für mich die Frage, warum überhaupt emittiertes Fluoreszenzlicht in angeblich den meisten Fällen polarisiert sein soll, wenn das Erregerlicht polarisiert ist und warum sich lebende autofluoreszierende Proben hier von Fluoreszenzfarbstoffen unterscheiden (scheinbar ist die Autofluoreszenz ben den hier gezeigten Algen ja trotz Einstrahlung von polarisiertem Erregerlicht unpolarisiert). Es würde mich freuen, wenn ein in diesem Bereich der Physik bewanderter eine verständliche Erklärung beisteuern könnte.
Fragende Mikro-Grüße
Jörg Piper

Zitat von: Piper in Februar 16, 2011, 09:32:46 VORMITTAG
Hallo,
danke für den Hinweis auf meinen Wortverdreher (Fluoreszenzpolarisation versus Polarisationsfluoreszenz). Interssant bleibt für mich die Frage, warum überhaupt emittiertes Fluoreszenzlicht in angeblich den meisten Fällen polarisiert sein soll, wenn das Erregerlicht polarisiert ist und warum sich lebende autofluoreszierende Proben hier von Fluoreszenzfarbstoffen unterscheiden (scheinbar ist die Autofluoreszenz ben den hier gezeigten Algen ja trotz Einstrahlung von polarisiertem Erregerlicht unpolarisiert). Es würde mich freuen, wenn ein in diesem Bereich der Physik bewanderter eine verständliche Erklärung beisteuern könnte.

Hallo Jörg,

ich weiss jetzt nicht, ob Du die Erklärung nur nicht gesehen hast, oder ob du sie schlecht oder falsch findest. Ich schreibe daher noch mal den Erklärungsansatz.
Alle Moleküle und das gilt soweit auch für Chlorophyll müssen das Photon erstmal absorbieren, effektiver ist hier die Wellenvorstellung, du kannst dir ein einzelnes Photon als Welle vorstellen, diese hat eine Schwingungsebene (eigentlich zwei, aber das spielt hier keine Rolle). Das Molekül kannst Du dir vereinfacht für diesen Fall als aus zwei Dipolen zusammengesetzt denken, einem Absorptionsdipol und einem Emissionsdipol (Die Lage dieser Dipole kann nicht so ohne weiteres an der Struktur abgelesen werden, oft sind die beiden aber parallel, spielt aber auch keine Rolle). Nur wenn die Schwingungsebene des Photons mit der Orientierung des Absorptionsdipoles zusammenfällt (und weitere Bedingungen zutreffen die hier keine Rolle spielen) wird die Energie des Photons zu 100% absorbiert.  Die ganzen anderen willkürlich orientierten Dipole absorbieren auch (fast alle), aber nur einen Bruchteil der Energie. Wenn nun alle wieder emittieren über den starr zum Absorptionsdipol ausgerichteten Emissionsdipol, dann wird der Löwenteil der Energie in der Polarisationsebene abgestrahlt (wenn sie parallel liegen, was sie aber oft tun).
Das heisst, das Licht wird leicht depolarisiert, hat aber in der Energieverteilung ein Maximum in der Polarisationsebene.

Zu Abweichungen kommt es natürlich, wenn zwischen Absorption und Emission so viel Zeit vergeht, dass das Molekülk sich drehen kann. Bei Chlorophyll kann sehr viel Zeit vergehen.

Viele liebe Grüße
Timm

Hallo Timm,

vielen Dank für Deine nochmaligen Erläuterungen. Ich hatte Deine vorherigen zwar gelesen, aber, da auch nur mit Wasser kochend, zunächst nicht vollumfänglich verstanden. Ich möchte die wesentlichen Erkenntnisse aus den erhaltenen Infos noch einmal ganz einfach formuliert zusammenfassen (so, wie "de Dampfmaschin" in der "Feuerzangenbowle") und wäre Dir für berichtigende Hinweise dankbar, falls sich bei mir Denkfehler eingeschlichen haben sollten.

Jede fluoreszierende Substanz oder Struktur muss man sich zusammengesetzt aus zwei Dipolen vorstellen: Der eine Dipol nimmt das Erregerlicht auf (Absorptionsdipol), und der andere Dipol gibt das Fluoreszenzlicht ab (Emissionsdipol). Jedes einzelne emittierte Fluoreszenzlicht-Quant bzw. jeder einzelne emittierte Lichtwellenzug schwingt in derjenigen Ebene, welche der Ausrichtungsebene des emittierenden Dipols entspricht. Umgekehrt wird ein einfallendes Erregerlicht-Quantum bzw. ein einfallender Erregerlicht-Wellenzug in umso höherem Maße absorbiert, wie dessen Schwingungsebene mit der Ausrichtungsebene des Absoptionsdipols übereinstimmt. Eine maximale Übereinstimmung liegt vor, wenn die einfallende Erregerlichtwelle parallel zur Längsache des Absorptionsdipols schwingt und daher diesen Dipol sozusagen auf voller "Breitseite" trifft. In analoger Weise wird eine Fluoreszenzlichtwelle von der "Breitseite" des Emissionsdipols emittiert, so dass der emittierte Lichtwellenzug parallel zur Längsachse des Emissionsdipols schwingt.

In fluoreszierenden biologischen Proben (Lebendmaterial) sind die insgesamt vorhandenen Dipole in ihrer Orientierung zufallsverteilt und wechseln ständig ihre Position im Raum. Daher ist das von solchen Proben emittierte Fluoreszenzlicht insgesamt nicht polarisiert, und zwar unabhängig davon, ob das Erregerlicht polarisiert ist oder nicht.

Polarisiertes Fluoreszenzlicht kann folglich nur in Sondersituatioinen emittiert werden, wenn mehr oder weniger alle Emissionsdipole parallel zueinander ausgerichtet sind. Dies dürfte wahrscheinlich nur in manchen kristallinen oder einigen polymeren Strukturen der Fall sein, spielt also für biologisch-medizinische Anwendungen keine Rolle.

Wenn das Erregerlicht unpolarisiert ist, kommt wahrscheinlich für jeden vorhandenen Absorptionsdipol ein Lichtwellenzug in Betracht, welcher "zufällig" parallel zu dessen Ebene schwingt, so dass die Energie des Erregerlichtes im Bezug auf ein Ansprechen möglichst vieler Absorptionsdipole besonders gut ausgenutzt werden dürfte. Wird das Erregerlicht polarisiert, werden nur diejenigen Absorptionsdipole voll angesprochen, welche "zufällig" in der Polarisationsebene des Erregerlichtes liegen. Aber auch hier bleibt das emittierte Fluoreszenzlicht unpolarisiert, so lange die Emissionsdipole in ihrer Raumorientierung zufallsverteilt sind.

Diese Zusammenhänge erklären, dass die Intensität des Fluoreszenzbildes bei bei den gezeigten Blaualgen unverändert bleibt, wenn der Objekttisch gedreht wird, auch dann, wenn das Erregerlicht polarisiert ist und mit einem gekreuzten Analysator nach der Objektpassage ausgeschaltet wird. Auch geht bei dieser Methode -zumindst theoretisch betrachtet - keine visuelle Information im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenztechnik verloren, sofern die Energie des Erregerlichtes und die Intensität des emittierten Lichtes ausreichend sind.

Die hier gezeigte grüne Fadenalge fluoresziert also im Gegensatz zu den benachbarten Blaualgen nicht, weil die Intensität des polarisierten Erregerlichtes (zumindest im Hinblick auf die erforderlichen Wellenkängen) zu gering ist und die Blaualgen offenbar weniger Erregungslicht (ggf. in einem abweichenden Wellenlängenbereich) benötigen, um in sichtbarer Menge Fluoreszenzlicht abzustrahlen. Die grüne Fadenalge stellt sich daher im gezeigten Bild in konventioneller Dunkeldeld-Manier dar, weil offensichtlich voerhandene Restanteile des einfallenden polarisierten Lichtes, welche den Analysator passieren können, für eine Bildgebung ausreichend sind.

Hiermit wäre das Zustandekommen der hier gezeigten Bilder erklärt.

Sind diese Schlussfolgerungen so richtig?????

Liebe Grüße Jörg

Hallo Jörg,

Danke für die schöne Darstellung! Du müsstest nur noch einbauen, "die Zellwände der Grünalge sind im Gegensatz zu den Blaualgen doppelbrechend".

Herzliche Grüsse
Eckhard

Hallo Jörg,

Zitat von: Piper in Februar 16, 2011, 22:41:48 NACHMITTAGS
Jede fluoreszierende Substanz oder Struktur muss man sich zusammengesetzt aus zwei Dipolen vorstellen: Der eine Dipol nimmt das Erregerlicht auf (Absorptionsdipol), und der andere Dipol gibt das Fluoreszenzlicht ab (Emissionsdipol). Jedes einzelne emittierte Fluoreszenzlicht-Quant bzw. jeder einzelne emittierte Lichtwellenzug schwingt in derjenigen Ebene, welche der Ausrichtungsebene des emittierenden Dipols entspricht. Umgekehrt wird ein einfallendes Erregerlicht-Quantum bzw. ein einfallender Erregerlicht-Wellenzug in umso höherem Maße absorbiert, wie dessen Schwingungsebene mit der Ausrichtungsebene des Absoptionsdipols übereinstimmt. Eine maximale Übereinstimmung liegt vor, wenn die einfallende Erregerlichtwelle parallel zur Längsache des Absorptionsdipols schwingt und daher diesen Dipol sozusagen auf voller "Breitseite" trifft. In analoger Weise wird eine Fluoreszenzlichtwelle von der "Breitseite" des Emissionsdipols emittiert, so dass der emittierte Lichtwellenzug parallel zur Längsachse des Emissionsdipols schwingt.

Exakt so hatte ich das gemeint.

Zitat
In fluoreszierenden biologischen Proben (Lebendmaterial) sind die insgesamt vorhandenen Dipole in ihrer Orientierung zufallsverteilt und wechseln ständig ihre Position im Raum.

Das ist erstmal nicht nur bei Lebendmaterial so, sondern bei allen Proben in Lösung. Fluoreszenzpolarisation als Messmethode wird regelmäßig in Lösung angewendet.

Zitat
Daher ist das von solchen Proben emittierte Fluoreszenzlicht insgesamt nicht polarisiert, und zwar unabhängig davon, ob das Erregerlicht polarisiert ist oder nicht.

Gerade eben doch! Die zufällige Verteilung spielt in dieser Vorstellung erstmal keine Rolle, weil die ,,falsch" orientierten Moleküle nicht so gut absorbieren und daher weniger zum Fluoreszenzlicht beitragen. Wie gesagt, Fluoeszenzpolarisation wird regelmäßig mit organischen Molekülen, DNA und Proteinen in Lösung angewandt.

Zitat
Polarisiertes Fluoreszenzlicht kann folglich nur in Sondersituatioinen emittiert werden, wenn mehr oder weniger alle Emissionsdipole parallel zueinander ausgerichtet sind.

Nein, das ist ein Missverständnis, entschuldigung! Was ich meinte ist, dass das emittierte Licht in der selben Ebene polarisiert ist, wie das absorbierte Licht, wenn der fiktive Emissionsdipol parallel zum fiktiven Absorptionsdipol ist. Ist der Apsorptionsdipol um 10° gegen den Emissionsdipol verdreht, ist das bei allen Molekülen so, und das polarisierte Emissionslicht ist eben um 10° gegen die Polarisationsebene des Einfallenden Lichtes verdreht.

Die Emissionsdipole sind untereinander natürlich statistisch verteilt und niemals parallel, was aber keine Rolle spielt, weil ja die falsch angeordneten Dipole nur schwach emittieren, weil sie auch vorher nur wenig Energie über den Absorptionsdipol aufgenommen haben.

Zitat
Dies dürfte wahrscheinlich nur in manchen kristallinen oder einigen polymeren Strukturen der Fall sein, spielt also für biologisch-medizinische Anwendungen keine Rolle.

s.o. Fluoreszenzpolarisation ist ein Standardverfahren zur Bestimmung von Bindungskonstanten in der biologischen und medizinischen Forschung und zwar in Lösung und nicht in Kristallen oder festen Polymeren.

Zitat
Wenn das Erregerlicht unpolarisiert ist, kommt wahrscheinlich für jeden vorhandenen Absorptionsdipol ein Lichtwellenzug in Betracht, welcher "zufällig" parallel zu dessen Ebene schwingt, so dass die Energie des Erregerlichtes im Bezug auf ein Ansprechen möglichst vieler Absorptionsdipole besonders gut ausgenutzt werden dürfte. Wird das Erregerlicht polarisiert, werden nur diejenigen Absorptionsdipole voll angesprochen, welche "zufällig" in der Polarisationsebene des Erregerlichtes liegen. Aber auch hier bleibt das emittierte Fluoreszenzlicht unpolarisiert, so lange die Emissionsdipole in ihrer Raumorientierung zufallsverteilt sind.

Das ist soweit fast das was ich meinte, bis auf einen Punkt: Bei normalen Molekülen, auch DNA oder Proteinen ist der Absorptionsdipol fest zum Emissionsdipol orientiert. Eine räumlich zufällige Anordnung von Emissionsdipolen zu ihren dazugehörigen Absorptionsdipolen wäre eine seltene Ausnahme. Deswegen gilt gerade wegen dem was du schreibst: Pol rein => Pol raus.

Bei Chloroplasten könnte es allerdings nach dem was Jörg schreibt anders sei.

Zitat
Diese Zusammenhänge erklären, dass die Intensität des Fluoreszenzbildes bei bei den gezeigten Blaualgen unverändert bleibt, wenn der Objekttisch gedreht wird, auch dann, wenn das Erregerlicht polarisiert ist und mit einem gekreuzten Analysator nach der Objektpassage ausgeschaltet wird. Auch geht bei dieser Methode -zumindst theoretisch betrachtet - keine visuelle Information im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenztechnik verloren, sofern die Energie des Erregerlichtes und die Intensität des emittierten Lichtes ausreichend sind.

Das ist auch bei Pol rein => Pol raus so. Eine normale Probe mit meinethalben kurzsträngiger DNA würde auch keine Intensitätsänderung zeigen, wenn man die Polarisationebene verdreht (analog zu Probe dreht).
[/quote]

Viele liebe Grüße

Timm

Hallo -

nicht dass ich die Diskussion auf meine unphysikalisch primitive Ebene ziehen wollte -
aber vielleicht könnte man das noch mit einbeziehen:

a) In den 1930-Jahren entdeckte Kautsky (mit bloßem, gut dunkel adaptierten  Auge und geeigneten Filtern), dass ein intaktes grünes Blatt, nachdem es längere Zeit in der dunklen Schublade verweilt hatte, beim schnellen Verbringen in photosynthetisch aktives Licht relativ "stark" (rot) fluoreszierte. Diese Fluoreszenz ging dann innerhalb von etwa 3 Minuten auf etwa ein Zehntel zurück (= Kautsky-Effekt).
Erklärung: Die eingestrahlte Energie kann zunächst nicht abgenommen werden, da es einige Zeit braucht, bis alle Einzelstufen des Elektronentransports synchronisiert sind. Ein Teil der nicht verwerteten Energie wird als Wärme, ein weiterer als Fluoreszenz wieder abgestrahlt. Beweis: Behandlung des Blattes mit Hemmstoffen für den Elektronentransport (z.B. die Herbizide Simazin oder Diuron) verhindert den Rückgang der Fluoreszenz.

b) Man nehme ein Blatt, lege es einige Minuten auf das Fensterbrett in die Sonne und verbringe es eilig ins Dunkle unter einen Photomultiplier. Dann kann man ein "Nachleuchten" messen, das zwar exponentiell abnimmt aber noch über Minuten zu beobachten ist.

Frage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Viele Grüße

Rolf

Lieber Rolf,

ZitatFrage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Diese Frage ist ja wohl rhetorischer Natur?

Herzliche Grüße

Detlef

Hallo Timm,

vielen Dank für Deine weitergehenden Erläuterungen, die ich nun, wie ich hoffe, gut verstanden habe. Wenn ich richtig schlussfolgere und ein Drehen des Objekttisches keine Aussage erlaubt, ob das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert ist, oder nicht, bliebe doch nur der Weg, dies herauszufinden, wenn man direkt vor das Okular bzw-. vor ein beobachtendes Auge einen Polfilter hält und diesen während der Beobachtung dreht. Sofern das Fluoreszenzlicht polarisiert ist, müsste es sich durch Drehen dieses Polfilters doch in seiner Intensität verändern lassen, ansonsten nicht.

Ich halte die Frage nach der Polarisation für wesentlich, da doch der Bärenanteil des Fluoreszenzlichtes bei der Polarisationsmethode verlorengehen müsste, wenn das Fluoreszenzlicht in etwa parallel zur Ebene des polarisierten Erregerlichtes schwingt und der Analysator hierzu gekreuzt ist. Dann dürfte man doch eigentlich nichts mehr oder nicht mehr viel hiervon sehen, oder??? Der Umstand, dass man die Blaualgen trotzdem fluoreszierend sieht, müßte demnach doch "beweisen", dass bei diesem Objekt das emittierte Fluoreszenzlicht unpolarisiert ist, oder dessen Schwingungsebene deutlich von derjenigen des Erregerlichtes abweicht. Erklärungen zu diesem Phänomen wurden ja schon gepostet.

Vielleicht könnte Eckhard mal in einer ruhigen Minute einen Polfilter vor sein Auge halten, diesen drehen und uns mitteilen, ob sich an der Helligkeit der fluorszierenden Strukturen etwas ändert. Dies könnte doch aufschlussreich sein.

Schöne Grüße

Jörg

Zitat von: reblaus in Februar 17, 2011, 14:15:47 NACHMITTAGS
a) In den 1930-Jahren entdeckte Kautsky (mit bloßem, gut dunkel adaptierten  Auge und geeigneten Filtern), dass ein intaktes grünes Blatt, nachdem es längere Zeit in der dunklen Schublade verweilt hatte, beim schnellen Verbringen in photosynthetisch aktives Licht relativ "stark" (rot) fluoreszierte. Diese Fluoreszenz ging dann innerhalb von etwa 3 Minuten auf etwa ein Zehntel zurück (= Kautsky-Effekt).
Erklärung: Die eingestrahlte Energie kann zunächst nicht abgenommen werden, da es einige Zeit braucht, bis alle Einzelstufen des Elektronentransports synchronisiert sind. Ein Teil der nicht verwerteten Energie wird als Wärme, ein weiterer als Fluoreszenz wieder abgestrahlt. Beweis: Behandlung des Blattes mit Hemmstoffen für den Elektronentransport (z.B. die Herbizide Simazin oder Diuron) verhindert den Rückgang der Fluoreszenz.

Hallo Rolf,

ein spannender Effekt. Ich habe mittlerweile ein wenig über Photosynthese gelesen und die Ursache für den Kautsky-Effekt ist, so habe ich gelesen, an der Stelle zwischen dem gebundenen Plastochinon Q_A und Q_B. Diuron zum Beispiel bindet wohl an die Bindungsstelle an die ansonsten das Q_B binden würde.

Würde das denn nicht dafür sprechen, dass in diesem Fall bei der Fluoreszenz die Emission durch genau das selbe Chlorphyll-Molekül erfolgt wie die Absorption? Das würde ja in diesem Fall für eine Polarisation sprechen, selbst wenn wegen der großen Stabilität des angeregten Zustandes die Lebensdauer recht lang ist, aber das Chlorophyll ist ja mechanisch mit dem gesamten Photosystem 1 gekoppelt, und somit doch eher schwer, oder?

Viel wichtiger: Wäre denn eine Vorgehensweise analog zu der von dir beschriebenen nicht der ideale Weg zu testen, ob die Abwesenheit der Fluoreszenz bei Eckhards Anordnung an der Fluoreszenz-,,Schwelle" liegt?

Zitat
b) Man nehme ein Blatt, lege es einige Minuten auf das Fensterbrett in die Sonne und verbringe es eilig ins Dunkle unter einen Photomultiplier. Dann kann man ein "Nachleuchten" messen, das zwar exponentiell abnimmt aber noch über Minuten zu beobachten ist.

Frage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Auch ich kann mir nicht vorstellen, dass hier Polarisation auftritt.

Viele liebe Grüße

Timm

Hallo,

hier noch ein kleiner Nachtrag zu meinem letzten Kommentar.
Natürlich setzt der von mir vorgeschlagene Test (Drehen eines vor dem Auge befindlichen Polfilters) voraus, dass mit einem normalen Fluoreszenzmikroskop gearbeitet würde, bei dem das Erregerlicht polarsisiert ist. Konkret könnte man hinter dem Erregerfilter einen Polfilter in den Strahlengang einbauen, so dass das Erregerlicht polarisiert zum Objekt verläuft. Zusätzlich könnte man einen drehbaren (!) zweiten Polfilter, der als Analysator wirkt, oberhalb des Objektivs vor dem Sperrfilter platzieren. Sofern das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert ist, müsste sich dessen Intensität bei Drehen des Analysators verändern. Sollte das Fluoreszenzlicht hingegen unpolarisiert sein,würde sich durch Drehen des Analysators nichts ändern.
Unter der Voraussetzung, dass die Eigenschaften von polarisiertem Licht bei Passage der Erreger- und Sperrfilter nicht verändert werden, könnte man natürlich auch den ersten Polfilter direkt an der Lichtquelle platzieren, d.h. vor dem Erregerfilter und den zweiten Polfilter auch hinter dem Sperrfilter, so z.B. auch vor dem beobachtenden Auge.
Wenn man nun bestimmte Objekte, die in der Fluoreszenzpolarisiation gut leuchten, z. B. die von Eckhard gezeigten Blaualgen, parallel mit einem so bestücken konventionellen Fluoreszenzmikroskop nachuntersuchen würde, könnte experimentell geklärt werden, ob das von diesem Objket emittierte Fluoreszenzlicht bei eintreffendem polarisiertem Erregerlicht ebenfalls polarisiert ist, oder nicht.
Zusätzlich könnte man in dem Fall, dass das Fluoreszenzlicht polarisiert ist, abschätzen, um wieviel Grad die Ebenen der Absorptions- und Emissionsdipole gegeneinander versetzt sind, wenn man die Winkelabweichung der eingestellten Ebenen des Polarisators und Analysators kennt (bezogen auf diejenige Analysatorstellung, bei der die Fluoreszenzintensität maximal ist).

Die letzten von Timm beigesteuerten Überlegungen lassen m.E. nun den Rückschluss zu, dass die Eckhardsche Fluoreszenzpolarisation wohl doch nicht geeignet ist, jegliche fluoreszierenden Objekte sichtbar zu machen, sondern nur solche, bei denen das emittierte Fluoreszenzlicht entweder unpolarisiert ist, oder bei denen die Ebene des polarisiert emittierten Fluoreszenzlichtes wesentlich von der Schwingungsebene des einfallenden Erregerlichts abweicht, sei es, weil sich die Moleküle im Zeitintervall zwischen Absorption und Emission in ihrer Lage im Raum hinreichend verändern, sei es, weil die Ebenen der Absorptions- und Emissionsdipole deutlich voneinander abweichen.

Dies könnte auch erklären, weshalb die lebenden Blaualgen gut in der Fluoreszenzpolarisation erkennbar sind, wohingegen ein Dauerpräparat mit Wackerfärbung in der Fluoreszenzpolarisation "unsichtbar" bleibt. In letzterem dürften nämlich die Absorptions- und Emissionsdipole parallel zueinander ausgerichtet sein und die fluoreszierenden Moleküle dürften sich, wenn überhaupt, nur sehr wenig in ihrer Position verändern. Somit würde bei einfallendem polarisiertem Erregerlicht das Fluoreszenzlicht in derselben Ebene polarisiert sein und folglich von dem in Kreuzstellung befindlichen Analysator geblockt werden. Und wenn man den Analysator verstellt, würde das wenige Fluoreszenzlicht direkt von dem Erregerlicht bzw. dem hiervon generierten Dunkelfeldbild überlagert.

Ich hoffe, dass diese Überlegungen so richtig sind und die geschilderten diskrepanten "Vorbefunde" erklären.

Schönes Wochenende

Jörg Piper

Liebe Fluorenzianer,

sollte tatsächlich ein messender Mensch sich an dieses Thema trauen, so ist ihm doch sicher bekannt, dass im gesamten Strahlengang keine weiteren Polarisationselemente stecken dürfen. Damit scheidet Auflicht-Fluoreszenz nach meinem Verständnis aus, denn es gibt einen unter 45° stehenden Strahlenteiler !
Und selbst Durchlichtfluo. darf nicht über ein Bino- Trino- Tubus erfolgen, denn da sind Prismen verbaut.
Als Sensor funktioniert vermutlich auch nur eine monochrome Kamera ohne jede Automatikfunktion oder ein Fotomultiplier mit Meßblende oder ausgesuchte Si-Diode. Natürlich alle wesentlichen Komponenten stabilisiert.

Selbst bei Durchlichtfluo. wäre ich im Beleuchtungsstrahlengang durch die Umlenkung des Lichtes mit Spiegel sehr vorsichtig. Vermutlich also ein Sonderauf- und/oder Umbau an einem Mikroskop.

Sehe ich diese Punkte als übertrieben ?

Nachdenklich
Peter H.

Hallo, Herr Höbel,
ich teile Ihre Nachdenklichkeit. Daher schlug ich auch vorsorglich vor, die beiden Polfilter idealerweise so zu platzieren, dass die Erreger- und Sperrfilter außerhalb der Polfilter bleiben - wenngleich ich nicht aus dem Stehgreif weiß, ob die Polarisation durch solche Filter beeinflusst wird (könnte vielleicht auch von der Art ders Filter abhängen - Farbgläser versus Interferenzfilter). Dann hatte auch ich eine Durchlicht-Anregung vor Augen, so, wie Eckhard es beschrieben hatte. Damit entfällt ein Strahlenteiler. Grundsätzlich wäre auch ein Monokulartubus vorteilhaft, schon wegen der geringen Lichtausbeute. Ob darüberhinaus Prismen in einem Binotubus die Polarisation verändern, weiß ich nicht bzw. halte ich für fraglich; denn ansonsten müsste doch auch ein Standard-Polarisationsbild in einem Monotubus ohne Prismen anders aussehen als in einem Bino-oder Trinotubus mit Prismen (wenn ich jetzt keinem Denkfehler aufsitze).
Zusammenfassend müsste man wohl ein "archaisches" Fluoreszenzmikroskop verwenden, entsprechend der ersten Anfänge, bei welchem man auch noch beliebig am Strahlengang herumbasteln kann.
Herzlich-nachdenkliche Grüße
Jörg Piper

Hallo Herr Piper,

vielleicht schaffe ich es in der nächsten Woche ein altes richtiges (weil alle Teile austauschbar) Mikroskop wie Standard 18 usw. oder Olympus BH-2 so umzurüsten dass keine unnützen Prismen oder Strahlenteiler im Strahlengang sind und nach Vorversuchen mit einer entsprechenden Kamera die Polarisation der Fluoreszenz zu untersuchen.
Falls es einen Effekt gibt, so erwarte ich ihn im 10e-2 bis 10e-3 Bereich.

Nachtrag:
Ein Schnellversuch zeigt bereits eine Teilpolarisation der Beleuchtungseinrichtung.
Testbedingung:
Kein Kondensor, kein Präparat, kein Objektiv, kein Bino- oder Trino sondern Ofenrohr ohne Optik, Kamera ohne Automatikfunktion mit Live-Mode Histogramm.
Beleuchtung mit stab. LED. Auf der Leuchtfeldblende ein drehbarer Polarisator.

Erklärung:
Es reicht bereits die Lichtumlenkung durch den Spiegel im Fuß des Olympus BH-2 um eine Teilpolarisation zu erzeugen.

Zusatztest:
Der Trinotubus verändert nocheinmal die Polarisation auch wenn auf 100% zum Fototubus geschaltet wird. Die Vermutung mit der Störung durch das Prisma ist damit bestätigt.

Viele Grüße
Peter H.

Hallo Eckhard,

es liegt nun schon einige Tage zurück, aber ich habe noch nicht aufgegeben. Aus einem Verein für Aquarienkunde konnte ich mir frische Blaualgen besorgen. Wieder ein Versuch und wieder keine Fluotreszenz, so wie auf Deinen Aufnahmen schön zu sehen. Gibt es noch etwas zu beachten, was noch nicht erwähnt wurde?
Selbstverständlich leuchten diese Blaualgen in üblicher Auflichtfluoreszenz bei Blaulichtanregung ( 455nm ) wunderschön auf.

Viele Grüße
Peter

Hallo Peter,

ich bin derzeit in Los Angeles - leider ohne Mikroskop. Ich bin in 10 Tagen zurück und werde ein paar weitere Aufnahmen von Algen machen. Mal sehen, ob ich mit 100W Halogen auch Grünalgen zur Autofluoreszenz bekomme.

Bei Carl Zeiss ist dieser Effekt übrigens bekannt.

Herzliche Grüsse
Eckhard

@ Jörg Pieper,

Hallo

ZitatOb darüberhinaus Prismen in einem Binotubus die Polarisation verändern, weiß ich nicht bzw. halte ich für fraglich; denn ansonsten müsste doch auch ein Standard-Polarisationsbild in einem Monotubus ohne Prismen anders aussehen als in einem Bino-oder Trinotubus mit Prismen (wenn ich jetzt keinem Denkfehler aufsitze).

Jedes Teilersystem beeinflußt die Polarisation des Lichts - mit einer Ausnahme: das von Max Berek entwickelte Prisma für die Auflichtmikroskopie.
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8136.msg56715;topicseen#msg56715

Daher sitzt bei einem Polarisationsmikroskop der Analysator immer vor dem Binotubus. Um unliebsame Polarisationseffekte bei Untersuchung im linerar polarisierten Licht zu vermeiden muß man außerdem das Licht vor dem Binotubus "depolarisieren". Dafür gibt es teure Einrichtungen:
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8509.0

Gruß, Olaf

Hallo zusammen,

diesen Polarisationseffekt kann jeder selbst mal nachvollziehen, wenn er nicht gerade ein Depolaristionsfilter in den Bino-Tubus eingebaut hat (Pol-Bino-Tuben haben das sicher, PZO-Binotuben hatten das generell): Wenn man ein homogenes Bild einstellt bei nicht allzu starker Helligkeit (muss nicht fokusiert sein), und nur einen drehbaren Polfilter entweder als Polarisator oder Analysator langsam dreht, kann man sich mit dem Drehen für die beiden Tubuseinblicke unterschiedliche Helligkeitsveränderungen wahrnehmen. Ich persönlich empfinde das dann durchaus als etwas unangenehm, es irritiert das binokulare Sehen. Die Prismen wirken dann eben für die beiden Einblicke als unterschiedlich ausgerichtete, feststehende Polfilter.

Betse Grüße !

JB

...... noch schlimmer: wenn man in einem Dünnschliff farblose Minerale im linear polarisierten Licht - also nicht bei gekreuzten Polarisatoren - fotografieren will, werden die, je nach Orientierung, durch die Pol-Effekte im Strahlenteiler schön pastellfarben bunt >:(.

Gruß, Olaf

Zitat von: olaf.med in März 03, 2011, 14:21:08 NACHMITTAGS
...... noch schlimmer: wenn man in einem Dünnschliff farblose Minerale im linear polarisierten Licht - also nicht bei gekreuzten Polarisatoren - fotografieren will, werden die, je nach Orientierung, durch die Pol-Effekte im Strahlenteiler schön pastellfarben bunt >:(.

Gruß, Olaf

Hallo Olaf

gibt es irgendeine behelfsmäßige Methode um zwischen Analysator und Tubus zu depolarisieren?


Viele Grüsse

Bernhard

Bernhard

schön dass Du diese Frage stellst. Ich habe mich nicht getraut  ;)

Gruß
Peter

Hallo Bernhard, Hallo Peter,

ich kenne leider keine verläßliche andere Methode. Zunächst dachte ich, daß es reicht das Licht einfach zirkular zu polarisieren - also einfach ein Lambda-Viertel-Plättchen in Diagonalstellung einzusetzen, aber das geht leider nicht, da durch die Minerale auch die Schwingungsebenen des ursprünglich E-W schwingenden Lichts verändert werden. Dann steht das Hilfsplättchen eben nicht meht diagonal, sondern für jeden Kristall anders - es resultiert elliptisch polarisiertes Licht, das die gleichen Dreckeffekte hervorruft. Also: teuren Depolarisator einbauen - leider >:(.

Gruß, Olaf

Zitat von: olaf.med in März 05, 2011, 09:56:44 VORMITTAG
Hallo Bernhard, Hallo Peter,

ich kenne leider keine verläßliche andere Methode. Zunächst dachte ich, daß es reicht das Licht einfach zirkular zu polarisieren - also einfach ein Lambda-Viertel-Plättchen in Diagonalstellung einzusetzen, aber das geht leider nicht, da durch die Minerale auch die Schwingungsebenen des ursprünglich E-W schwingenden Lichts verändert werden. Dann steht das Hilfsplättchen eben nicht meht diagonal, sondern für jeden Kristall anders - es resultiert elliptisch polarisiertes Licht, das die gleichen Dreckeffekte hervorruft. Also: teuren Depolarisator einbauen - leider >:(.

Gruß, Olaf

http://www.edmundoptics.com/onlinecatalog/displayproduct.cfm?productid=3246


(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/60289_5581277.jpg)