Hallo zusammen!
ich spiele mich schon seit einiger Zeit mit dem Gedanken Schnitte von Insekten anzufertigen. Besonders interessant fände ich Ameisen - leider sind diese in ihrem filigranem und segmentiertem Körperbau etwas empfindlich. Doch das grundsätzliche Problem: Wenn ich keine Mazeration durch KOH herstellen will (Romeis, Mikroskopische Technik), bei der die "Innereien" verloren gehen, dann muss ich das Exoskelett aufweichen, damit ich eine einigermaßen konstante Härte für den Schnitt erziele. Der "Romeis" empfiehlt unter dem Aspekt des "Bleichens und Aufhellens" das Diaphanol (Chlordioxidessigsäure). In anderen Quellen wird das Diaphanol auch zum Zwecke der Weichmachung des Chitins erwähnt. Kennt Ihr das Diaphanol zum diesen Zwecken? Wisst Ihr, woher man dieses beziehen kann? Gibt es alternative Reagenzien, die die Chitinstruktur mit den starken Bindungen angreifen, jedoch nicht die interessanten Gewebeteile zerstören? Hat von Euch jemand Schnitte von Insekten mit starkem Exoskelett (z.B. ähnlich wie bei der Ameise od. Heuschrecken, Läuse) angefertigt? Ist als Färbemethode bei Insekten eine Hämatoxylin-Färbung die erste Wahl?
Entschuldigt die vielen Fragen :-\
Danke für Euere Bemühungen
Viele Grüße Armin
Hallo Armin,
Ich habe weder mit Ameisen noch mit Diaphanol Erfahrungen. Alle Insekten sind wohl etwas problematisch, wegen des Chitinskeletts.
Willst Du in Paraffin oder in sonstigen Materialien einbetten um zu schneiden? Hast Du ein gutes Mikrotom?
Es ist es extrem wichtig, die Tierchen sorgfältigst zu entwässern. Jeder Wasserrest führt unweigerlich zu Sprödigkeit des Chitins. Ich benutze zur Entwässerung meiner Insekten, um eine unnötige Härtung zu vermeiden, keinen Ethylalkohol sondern Isopropanol und gehe dann über N-Butylalkohol ins Paraffin.
Eine H-E Färbung führt zu guten Ergebnissen.
Mikrogrüße
Jürgen
Danke für Deine Antwort!
@ Jürgen Harst:
Ich wollte in Paraffin einbetten, jedoch bin ich gerade am Erweitern meiner "Laborgeräte" (Paraffinstreckbad durch Fritöse mit modifizierter Temperaturregelung etc.) und dies dauert noch ein paar Wochen. Ich verfolge auch die Einbettungsmethode mit n-Butanol. Als Mikrotom habe ich ein Rotationsmikrotom von Euromex zur Verfügung (mit Einmalklingenhalter und 2 Mikrotommessern). Meine Erfahrung in diesem Gebiet ist sehr begrenzt, doch ich habe einen Ansprechpartner in der Nähe, der seit jahrzehnten botan. Schnitte macht. Leider ist bei mir die Einbettung wegen der mangelnden Laborgeräte noch sehr zeitaufwändig und somit bin ich noch ein blutiger Anfänger - das soll sich aber ändern.
Also schneidest Du Deine Insekten ohne Fixierung und Einweichung des Chitins nach der Entwässerung über n-Butonol? Könntest Du vielleicht mal ein Bild, oder einen Link von einem Thread mit insektenhistolog. Aufnahmen posten?
Danke!
Armin
Lieber Armin,
ohne eine anständige Fixierung geht es weder in der pflanzlichen noch in der tierischen Histologie.
Auch bei den Insekten kannst Du ein AFE Gemisch verwenden. Alternativ empfiehlt sich ein alkoholisches Bouingemisch, da dieses Chitin gut durchdringt.
Nach dem Fixieren kannst Du etwa folgende Präpschritte machen:
A.
Isopropanol
80 %
90 %
100 %
100 %
B.
N - Butylalkohol
100 %
C.
Paraffin kalt mit N - Butylalkohol
Paraffin warm mit N - Butylalkohol
D.
Paraffin rein wechseln bis der Geruch vom Butylalkohol verschwunden ist. (ca. beim dritten Mal)
Das Iso muss wasserfrei sein!! Mit Hartosol von Chroma habe ich gute Erfahrungen.
Zeiten von A. und B. je einen halben Tag. Ausreichende Flüssigkeiten verwenden! Die Isostufen 100 manchmal etwas schwenken. Die anderen Stufen können kürzer sein, die Isostufen wahrscheinlich auch, aber ein Halbtagesrhythmus ist einfach bequem und das Iso härtet nicht (im Gegensatz zu Ethylalk)
Weitere Tipps:
Das Insekt muss Eintrittspforten für alle Flüssigkeiten einschließlich Fixierung bekommen. Kleininsekten teile ich.
Du solltest möglichst Tiere unmittelbar nach einer Häutung oder nach dem Schlüpfen verwenden, dann ist der Chitinpanzer noch nicht so hart. Es empfiehlt sich ein etwas härteres Paraffin zu nehmen. Man kann ihm etwas ((etwa 5% ) Bienenwachs zusetzen. Die Temperatur beim Schneiden mit dem Mikrotom sollte kühl sein. Mit dem härteren Paraffin und der kühlen Schneidetemperatur gleichst Du die Härteunterschiede des Chitinpanzers zum Rest etwas aus. Die Temperatur bei den Paraffinstufen sollte möglichst gleichmäßig sein.
Wenn Du noch keine Erfahrungen mit der Paraffineinbettung hast, würde ich erst einmal Paraffinpräparate aus der Botanik herstellen. Sie sind unproblematischer. Dann kannst Du die Ursache von Problemen besser abschätzen.
ZU den "Laborgeräten": ganz vernünftig sind kleine Kaperngläschen, die Du in einen Babyflaschenwärmer ins Wasserbad stellen kannst. Besser und vielfältig verwendbar (Einbettung und Strecken) ist aber auch eine Wärmeplatte, die Ronald Schulte hier einmal empfohlen hat. Bei Interesse suche ich die Bezugsquelle heraus.
Mikrogrüße und viel Erfolg! Ich bin gespannt auf Deine ersten Ergebnisse....
Jürgen