Hallo Carsten,
ohne die Leistung Deiner Schittserien und deren Montagen schmälern zu wollen, möchte ich doch etwas Kritik üben. Ich habe den Eindruck, dass im Bereich der zoologischen Histologie im Forum der Wahn ausgebrochen ist, möglichst dünn zu schneiden. Diese Dünnschnitte werden häufig an paraffinisch eingebettetem Material vorgenommen und als Semidünnschnitte bezeichnet. Hierbei handelt es sich aber keinesfalls um Semidünnschnitte im klassischen Sinne, sondern um Paraffinschnitte, die extrem dünn geschnitten wurden. Als Folge entstehen Schnitte, bei denen die eigentlichen histologischen Grund- und auch Feinstruktur, die für Paraffinschnitte typisch wären, verloren geht (gleiches war auch schon an Aufnahmen botanisch-histologischen Schnitten im Forum zu beobachten).
Im Unterschied zur Herstellung von Paraffinschnitten wird das Objekt bei der klassischen Semidünnschnitttechnik so fixiert, dass ein deutlich höherer Vernetzungsgrad der cytologischen Strukturen erreicht wird. Dieser höhere Vernetzungsgrad (besonders unter gleichzeitiger Verwendung von Osmiumtetroxid zur Fixierierung lipider Bestandteile), wirkt stärker härtend auf das Objekt, als die Fixierung, die zur Herstellung von Paraffinschnitten verwandt wird. Diese Steigerung des Härtegrades spielt bei der Semischnitttechnik meist keine Rolle, da das Objekt nicht in ein weiches Medium (Paraffin), sondern in einen Kunststoff (Technovit, Durcupan, usw.) eingebettet wird. Die Härte der jeweiligen Kunststoffes lässt sich hierbei steuern und dem Objekt anpassen. Der Kunststoff infiltriert das Objekt vollständig und erhält auf diese Weise die histologische Grundstruktur in einem Maße, die bei der Paraffinschnitttechnik aus methodischen Gründen nicht erreicht werden kann.
Bei einer Schnittpräparation der in Kunststoff eingebetteten Objekte, werden hauchdünne "Kunststofffolien" vom Messer (Stahl oder Glas) abgenommen und auf Wasser gestreckt. Bei dieser Streckung kommt es aber nicht zu dem paraffinischen Effekt, dass die Gewebstrukturen durch Quellung auseinanderreißen. Die vollständige Kunststoffinfiltration leistet so einen wesentlichen Beitrag zum Strukturerhalt. Im Unterschied zum extremen Dünnschneiden von Paraffinschnitten resultieren bei der Kunststoffschnitttechnik nicht Gewebefetzen, sondern vollständig erhaltene und zusammenhängende Gewebestrukturen. Bei Paraffinschnitten ist eine Schnittdicke von minimal 5 Mikrometern völlig ausreichend.
Des Weiteren muss unterschieden werden zwischen Kunststoffschnitten und klassischen Semidünnschnitten. Objekte, die als Kunststoffschnitte verarbeitet werden, können Größen erreichen, die denen der Paraffinschnitt-technik entsprechen. Kunststoffschnitte können an motorisch getriebenen Rotationsmikrotomen (mit Stahl-, Glas- oder Diamantmessern) hergestellt werden. Hierbei sollte aus Gründen der Schnittstabilität darauf geachtet werden, dass nicht der Hub, sondern der Messerschlitten motorisch bewegt wird. Semidünnschnitte werden an Ultramikrotomen mit Glas- oder Diamantmessern geschnitten. Die Kantenlänge eines Semidünnschnittes sollte nicht größer als 2 mm sein.
Eine Bewertung einer jeweiligen Schnittmethoden auf besser oder schlechter kann nicht vorgenommen werden. Jeder dieser Methoden bedient eine andere Fragestellung. Die Paraffinschnittechnik zu nutzen, um Semis herzustellen, ist sicher genauso fragwürdig, wie zu versuchen mit Semis ein gesamtes Tier (z. B. den Bau eines Regenwurmes) zu rekonstruieren!
Bezogen auf Deine Schnittpräparation glaube ich, dass dickere Schitte aus histologischer Sicht sicher ein Gewinn wären. Dies wird besondern dann deutlich, wenn Du Deine eigenen Schnitte einmal bei höherer Vergrößerung durch-musterst.
Ich hoffe, dass Du mir diese Ausführungen nicht übel nimmst.
Viele Grüße!
Dieter
Hallo Dieter,
vielen Dank für diese Erläuterungen. Als Hobbyhistologe ist es natürlich schwer an ein Diamantmesser und ein Rotationsmikrotom
für Semidünnschnitte zu kommen. Ein Glasbrecher reicht natürlich auch, aber die Ergebnisse sind oft schöner beim Diamanten.
In der Uni habe ich vor einem halben Jahr damit begonnen, mich in die Elektronenmikroskopie einzuarbeiten. Dabei habe ich soweit
alle Arbeitsschritte "mal durchgemacht". Semis und Ultras schneide ich regelmäßig, die Qualität ist oft überwältigend, die Schwierigkeit
bei gewissen Präparationen, und der Aufwand dabei, übersteigt aber die Paraffintechnik deutlich.
Als kleine Ergänzung hier ein paar Bilder:
Der Kunststoffblock (Epon), darin ein Stück Niere eingebettet. Kantenlänge (zugeschnitten) ca. 1x1,5mm (eher etwas weniger)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_48654706.jpg)
Ein Glasmesser (knapp 1cm dick), abfotografiert durch das Okular des Mikrotoms)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_48685910.jpg)
Ein Foto eines Semidünnschnitts unter dem Mikroskop (Graustufen). Man sieht sogar die Mitochondrien, die Gallenkanälchen mit Zellverbindungen (Abdichtung), das raue und das glatte ER.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_49965275.jpg)
Um die Strukturen zu bestätigen hier die TEM-Aufnahme: (dunkle Punkte: Mitochondrien, dunkle Flecken mit Punkten: rauesER, helle "Röhren": glattes ER)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_35310361.jpg)
Bevor ich diese Möglichkeiten hatte, musste ich mit Paraffin dünn schneiden. Das bringt gewisse Vorteile, aber natürlich auch Nachteile:
Vorteile: Strukturen liegen nebeneinander, weniger übereinander (Aussagekraft bei Zellgrenzen usw. erhöht-> In der Patho wird ca. 0,5-1,5 oder 3µm geschnitten), gut für Fotos bei guten Objektiven (und natürlich gutem Mikroskop)
Nachteile: Kürzere Haltbarkeit der Färbungen (weniger geeignet für Kurspräparate), kein gutes Bild bei schlechten Mikroskopen, ist sehr schwer, Aussagekraft in Ausnahmefällen geringer (Rekonstruktion des "3D-Aufbaus").
Die Färbezeiten müssen natürlich angepasst werden. 5µm sind kein Problem. Aber bei hohen Vergrößerungen ist das Bild unschärfer als bei dünnen Schnitten (großer Zellhaufen statt Strukturen ordentlich nebeneinander geordnet). z.B. habe ich mal eine Tonsille (wurde mit Glutaraldehyd fixiert) 0,5µm geschnitten. Die HEVs waren sehr gut zu sehen, kein Vergleich zu Routinepräparaten.
Ein Bild von meiner Homepage: www.dittmayer.com
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_38438674.jpg)
Carsten
Kleine Ergänzung:
Hier sieht man auch die Vorteile von dünnen Schnitten:
0,5µm (eingestellt)
Glomerulum, Niere: (im zweiten Bild sieht man sogar die Podozytenfortsätze, wie sie die Glomeruluskapillaren umgreifen)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_32481774.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_56684351.jpg)
Die Haarschichten: Von außen (rechts) nach innen (links): Bindegewebige Wurzelscheide, Glasmembran (dünner Strich), äußere epitheliale Wurzelscheide (hell wegen viel Glykogen, viele Schichten), innere epitheliale Wurzelscheide (Henle-Schichte, Huxley-Schicht, Scheidenkutikula), Haarkutikula, Rinde, Mark
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_42357054.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_58917644.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_66813169.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62177_54985374.jpg)
Ein großes großes Problem dieser Präparate: Übersichtsaufnahmen sind nicht so schön, sie sind zu hell und haben weniger Kontrast. Daher mache ich von schönen Präparaten meist sehr dünne (für Fotos bei hohen Vergrößerungen), und auch 1-2 dicke für Übersichtsaufnahmen (aber nur manchmal).
Hallo Carsten,
ich bin froh, dass Du mir meine Ausführungen nicht übel genommen hast. Ich habe immer Probleme, wenn ich histologische Bilder sehe, die so dünn geschnitten sind, dass von der eigentlichen histologischen Struktur nicht mehr viel übrig bleibt. Häufig wird demjenigen, der histologisch arbeitet dieser Umstand erst klar, wenn er gezwungen wird, seine Schnitte auszuwerten und bei entsprechend hohen Vergrößerungen zu fotografieren.
Die bittere Pille des Semi- und/oder des Kunststoffschneidens ist sicher im Preis der Gerätschaften zu sehen und, wie Du auch schon beschrieben hast, für den Hobbyhistologen in der Regel unerschwinglich. In der Uni mit Diamantmessern schneiden zu dürfen, ist sicher ein Previleg, das nicht jedem Studentem zu Teil wird. Ich selber schneide die Masse mit Glas, perfekte Anschnitte aber auch mal mit einem Histodiamanten. Mir ist aufgefallen, dass Ihr Eure Glasmesser nicht mit einer Aluminiumwanne umgebt und mit Wasser füllt, auf dem dann die Schnitte abschwimmen. Vermutlich handelt es sich bei Deinem Bild um einen Blockanschnitt. Dein Beitrag macht auch nochmals deutlich, wie klein die absolute Probenfläche beim Semischneiden ist.
Vielen Dank für Deinen ergänzenden Beitrag!
Dieter
Hallo Dieter,
Du hast Recht, es ist ein Blockanschnitt. Semis schneide ich oft auch "nur" mit Glas. Mit einem Glasmesser trocken anschneiden,
anschließend mit Wanne anschneiden (anderes Messer) und dann mit einem neuen Messer sauber. Zusammen also 3 Messer.
Einen Histodiamanten habe ich leider nicht, nur die Ultras schneide ich damit. Ein paar Mal konnte ich mit einem alten Ultradiamanten Semis schneiden,
aber es war dann vom Ergebnis nicht viel besser als das Glas. Mehr Scharten, aber weniger Aufwand.
Bisher habe ich noch keinen Diamantenunfall gehabt, bin auch sehr froh darüber.
Bei der Dicke kommt es also m.E. immer auf das Ziel an. Kurspräparate, Objekt, Ausrüstung (Kamera, Mikroskop, Objektive) ...
Vielleicht könntest Du ja ein paar Fotos von zu dünnen Präparaten zeigen? Würde mich sehr interessieren. Speziell bei schlecht fixieren Präparaten dürfte es
stören, denke ich. Da dominieren vielleicht die Artefakte (Schrumpungslakunen, Risse etc.).
Viele Grüße,
Carsten
Dieter und Carsten,
Da habt ihr ja ein sehr interessantes Thema 'angeschnitten'.
Den Leber schnitt von Carsten ist ja gewaltig so schön.
Wenn ich das vergleiche mit ein Leber Bild die ich gestern gemacht habe fehlt da einiges.
Der schnitt ist 2µm dick und ist mit Technovit eingebettet. Die Färbung ist ein Methylenblau-AzurII Färbung.
In die Zellen sind viele kleine Öffnungen zu beobachten (schwarze Pfeilen). Gallen kapillairen sind das glaube ich nicht.
- Die Kerne sind nicht so Homogen wie es Normal im Leber zu beobachten ist; ist hier die durchtrankung nicht Gans?
- schnitt zu dünn so das Material ausgerissen wird?
- vielleicht gehört Maus-leber auch so aus zu sehen?
Wer weis es? Bin gespannt auf eure reaktionen!
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62253_37281880.jpg)
Grüße Ronald
Hallo Ronald,
vielleicht sollten wir zunächst den Semidünnschnitt der Leber von Carsten mit Deinem Technovit-Kunststoffschnitt vergleichen. Ich vermute, dass das Objekt von Carsten in gepuffertem Glutaraldehyd fixiert und gleichzeitig lipide Strukturen mit Osmiumtetroxid stabilisiert wurden. Eingebettet wurde nicht in einem Glykolmethacrylat, sondern in einem hochvernetzenden Epoxidharz. Die Schnittdicke liegt wahrscheinlich zwischen 0,5 und 1 Mikrometer. Ob der Schnitt mit Toluidinblau (einem Farbstoff mit hoher Farbdichte) gefärbt wurde, kann ich nicht beurteilen. Die Umwandlung in Graustrufen unter gleichzeitiger Verwendung eines Grünfilters während der Aufnahme, sorgt zusätzlich für eine deutliche Steigerung des Kontrastes. Diese Schwarz-Weiß-Aufnahmetechnik ist für Semis in naturwissenschaftlichen Publikationen typisch. Sicher kann Carsten klarstellen, wie genau methodisch vorgegangen wurde.
Deine Mausleber wurde in Neutralformol fixiert und ist nicht osmiert worden. Ob das Polymer vollständig eingedrungen ist, muss geprüft werden. Bei Deinem Schnitt fällt auf, dass die Färbung unzureichend ist. Mit Methylenblau sollten sich eigentlich nur die Kerne blau färben. Offensichtlich ist die Farbbindung des Azur II zu schwach um differenzierend auf das Methylenblau zu wirken. Bitte tausche das Azur II gegen basiches Fuchsin. Die optimale Schnittdicke des Technovits 7100 liegt bei ca. 3 Mikrometern. Bei dünneren Schnitten ohne gesteigerten Härterzusatz kann sich das Polymer beim Schnitt instabil verhalten und die nachgeschaltete Kombinationsfärbung kann zu schwach ausfallen. Ich vermute, dass der Fehler vor allem bei der Färbung Deines Technovitschnittes zu suchen ist.
Ich denke wir werden das Problem bald lösen können.
Herzliche Grüße!
Dieter
Hallo Ronald,
ich weiss nicht, ob alle diese "Vakuolen", die Du zeigst real sind oder Artefakte, aber hier zum Vergleich ein "Profipräparat" (Schnitt durch die Leber der Ratte) aus einem toxikologischen Institut. Dort geht es um das sichere Erkennen von Veränderungen der Feinstruktur der Leber durch ein Medikament, daher ist man auf optimale Fixierung angewiesen. Das Bild zeigt allerdings eine Kontrollgruppe ohne Behandlung. Man sieht einige Vakuolen, diese sind aber in der Regel im Disse'schen Raum zu sehen wo sie hingehören, nicht aber um die Kerne herum. Man sieht auch ein gar nicht so selten anzutreffendes endzündliches Infiltrat mit Lymphozyten, Granulozyten und Macrophagen.
Das Präparat wurde von einem Profi in diesem Bereich geschnitten, Semidünnschnitt, EPON 0,5 µm, Toluidinblau, Fixierung in Cacodylatgepuffertem Glutaraldehyd mit Nachfixierung in OsO4 (welches die gelblichen Lipidtröpfchen gut erhalten hat). Vom gleichen Block wurden auch Dünnschnitte fürs EM gemacht.
Lass uns gerne mal telefonieren zwecks Vergleich.
Herzliche Grüsse
Holger
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62273_11198822.jpg)
Hallo Ronald,
vielleicht noch eine kleine Ergänzung. Du hast in Deinen Schnitten Hohlräume beobachtet. Ich gehe davon, dass es sich hierbei um die leeren Vesikel von Lipide handelt, die während des Präparationsganges herausgelöst wurden. Des Weiteren speichert die Leber Zucker in Form von Glykogen. Auch dieses Glykogen wird während der Präparation verschoben und herausgelöst. In welchem Speicherzustand sich eine Leber befindet hängt wesentlich vom physiologischen Zustand des Tieres ab. Bitte vergleiche noch einmal die Semidünnschnitte von Carsten und die Schnitte des Profis in Hinblick auf den lipiden Anteil. Die fixierten Lipide erscheinen als schwarze Vesikel.
Ich habe heute Deinen Block weiter angeschnitten. Das Objekt ist vollständig Kunststoff infiltriert. Die Schnitte sind fehlerfrei. Vielleicht schaffe ich es heute Abend einige Aufnahmen einzustellen, damit Du Dein Farbergebnis abgleichen kannst.
Herzliche Grüße!
Dieter
Hallo Ronald,
wie versprochen möchte ich einige Bilder der gefärbten 2 Mikrometer dicken Technovit-Schnitte "Leber der Maus" zeigen. Da es hier nur um einen methodischen Vergleich gehen soll, habe ich an den Aufnahmen keine weitere Beschriftung vorgenommen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62307_33393526.jpg)
Leber der Maus, Vergrößerung 120x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62307_26957286.jpg)
Leber der Maus, Vergrößerung 200x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62307_31506902.jpg)
Leber der Maus, Vergr. 200x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62307_16714592.jpg)
Leber der Maus, Vergrößerung 650x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/62307_14209669.jpg)
Leber der Maus, Vergrößerung 650x
Ich bitte Dich um einen Vergleich mit Deiner eigenen Färbung. Leider sind meine Aufnahmen noch etwas unscharf, da ich die Präparate erst vor wenigen Stunden eingeschlossen habe.
Viel Spaß beim Ansehen der Bilder!
Dieter
Ronald,
Dieter's Vermutung ist wahrscheinlich zutreffend, Die in Deinem Schnitt markierten "Löcher" sind offenbar Hohlräume, entstanden durch bei der Präparation herausgelöste Speicherstoffe wie Lipide oder Glykogen.
Herzliche Grüsse
Holger