Hallo,
habe mal eine Zygnema unter UV-Licht (Durchlicht) untersucht. Mit 365 nm Anregung kann man die Autofluoreszenz des Chlorophylls beobachten, aber offensichtlich nur teilwesie. In der Mitte des Chloroplasten ist keine Fluoreszenz zu sehen. Hat jemand eine Idee woran das liegen könnte ?
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91515_53474368.jpg)
Hallo Ralf,
Meines Wissens kommt die Autofluoreszenz von Chloroplasten aus den konjugierten Doppelbindungen des Chlorophylls zustande. Diese Chlorophyllfluoreszenz muss nicht homogen sein, da Chlorophyll im Plastiden nicht homogen verteilt ist.
Dies wäre meine Erklärung, aber mit Botanik habe ich nicht soviel am Hut.
Schöne Grüße,
Jan
Zitat von: Ralf in April 29, 2012, 16:16:18 NACHMITTAGS
Hallo,
habe mal eine Zygnema unter UV-Licht (Durchlicht) untersucht. Mit 365 nm Anregung kann man die Autofluoreszenz des Chlorophylls beobachten, aber offensichtlich nur teilwesie. In der Mitte des Chloroplasten ist keine Fluoreszenz zu sehen. Hat jemand eine Idee woran das liegen könnte ?
Hallo Ralf,
ein sehr schönes Bild! Zu Deiner Frage selbst kann ich leider nichts beitragen, aber eine Frage zur UV-Anregung habe ich: Wie sieht das praktisch aus, bzw. wie realisierst Du das? Wenn ich richtig informiert bin, arbeiten wir ja mit dem gleichen Mikroskoptyp.
Hallo Ralf,
zu Deiner Frage kann ich leider keine Antwort geben, aber es kommt eine Frage von mir.
Wie ist die Hintergrundbeleuchtung zu verstehen? Gab es ein Sperrfilter? Die Nichia mit 365nm sendet leider auch noch einen Teil im Bereich über 400nm aus. Kommt daher der aufgehellte Hintergrund?
Schöne Grüße
Peter
Zitat von: Bernd Kaufmann in April 30, 2012, 10:09:06 VORMITTAG
Wie sieht das praktisch aus, bzw. wie realisierst Du das? Wenn ich richtig informiert bin, arbeiten wir ja mit dem gleichen Mikroskoptyp.
Hallo Bernd,
das sieht bei mir so aus:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91574_33434731.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91574_28646706.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91574_33664274.jpg)
Ein Arbeitskollege hat mir freundlicherweise sowohl den passenden Messingblock (wichtig zur Kühlung) gedreht, als auch die Nichia 365 nm UV LED darin eingebaut. Die Vorichtung wir dann eeinfach auf die Leuchtfeldblende gesetzt.
Zitat von: peter-h in April 30, 2012, 10:41:30 VORMITTAG
Hallo Ralf,
zu Deiner Frage kann ich leider keine Antwort geben, aber es kommt eine Frage von mir.
Wie ist die Hintergrundbeleuchtung zu verstehen? Gab es ein Sperrfilter? Die Nichia mit 365nm sendet leider auch noch einen Teil im Bereich über 400nm aus. Kommt daher der aufgehellte Hintergrund?
Schöne Grüße
Peter
Hallo Peter,
ich verwende keine Filter. Ich habe zwar alle gängigen Filter getestet, aber ohne jedweden Filter erhalte ich das meiner Meinung nach beste Ergebnis. Tatsächlich hat die LED einen nennenswerten Blauanteil. Im hier gezeigten Beispiel habe ich den eigentlich blauen Hintergrund per manuellem Weißabgleich mit der Kamera korrigiert.
Hallo Ralf,
vielen Dank für die schnelle und gut bebilderte Antwort. Da regt sich schon wieder mein sowieso nur mühsam unterdrücktes Sammler-Gen. Mal sehen, wie lang ich da widerstehen kann. ;D
Zitat von: Ralf in April 30, 2012, 11:44:11 VORMITTAGich verwende keine Filter.
Hallo Ralf,
dann ist es mit dem Mikroskopieren aber bald vorbei. Die Nichia mit 365 nm gehört in die Laserklasse 3B und verursacht Schäden im bestrahlten Gewebe. Vielleicht habe ich ja etwas missverstanden, aber ich würde damit
sofort aufhören und die Sache klären.
Gutgemeinte und besorgte Grüße,
Thomas
Hallo Ralf,
die Warnung von Thomas möchte ich heftig unterstreichen:
ZitatVielleicht habe ich ja etwas missverstanden, aber ich würde damit sofort aufhören und die Sache klären.
Hast du nicht eine Filterschublade unterm Tubus? (Für 18 mm Filter.) Ich hätte geeignete Filter zb ein LP 520, das hier besseren Fluokontrast bringen sollte und Schutz für deine blauen Augen bietet!
Lieber Thomas, lieber Klaus,
ich weiß schon, dass man nicht mit ungeschütztem Auge in das UV Licht schauen darf. Hatte dies für selbstverständlich gehalten und daher nicht erwähnt, dass ich mit dieser Anordnung ausschließlich über das Kamerabild mikroskopiere.
Trotzdem Danke für eure Besorgnis, es hätte ja auch anders sein können!
Hallo Klaus,
ZitatIch hätte geeignete Filter zb ein LP 520, das hier besseren Fluokontrast bringen sollte und Schutz für deine blauen Augen bietet!
Bei der Anregungswellenlänge wäre ein LP397 als Sperrfilter geeigneter und wird auch meist verwendet. Sowas hast du bestimmt auch noch. ;) Ansonnsten wäre noch ein Zusatzanregungsfilter ganz sinnvoll, wenn man nur mit UV und nicht noch mit Violett, Blau und anderen Farben anregen will. ;)
Viele Grüße
Bernd
Hallo Bernd,
ZitatLP397 als Sperrfilter geeigneter und wird auch meist verwendet. Sowas hast du bestimmt auch noch
Aber natürlich! Werde ich Ralf zum Test schicken.
# Ralf: leider habe ich keinen
λ -Schieber übrig! Aber den von Bernd vorgeschlagenen Sperrfilter verpacke ich gleich!
Hallo zusammen!
UV entsprechender Wellenlänge, das Gewebeschäden verursacht, ist ja nicht nur bei künstlichen Lichtquellen vorhanden, sondern auch im natürlichen Licht, wo es z. B. auch Kunststoffe zerstören kann. Das bringt mich zur Frage, ob denn Kamerasensoren "immun" gegen UV sind. Gerade bei Kompaktkameras und Spiegelreflexkameras mit Livebild oder Spiegelvorauslösung trifft ja dann im Zweifel starke UV-Strahlung direkt auf den Sensor und das nicht nur kurzzeitig, sondern bei längeren Sitzungen eben auch schon mal grenzwertig lang. Gibt es dazu irgendwelche Erfahrungen, oder Hinweise der Hersteller?
Daraus ergibt sich eventuell eine weitere Frage: Wie schnell verläuft denn die Autofluoreszenz? Könnte man gegebenenfalls "vorbelichten" und dann erst die Kamera für die Aufnahme zuschalten?
Hallo Klaus,
ZitatAber natürlich! Werde ich Ralf zum Test schicken.
Dann mach mal, allein schon zum Schutz der Augen.
Normalerweise können solche Autofluoreszenzen auch schon mit 450nm Anregung erzeugt werden, wozu auch dein LP520 geeignet wäre. ;)
Oder hat es einen besonderen Grund, daß 365nm genommen werden muß?
Gruß
Bernd
Hallo Ralf,
mal auf die Ursprungsfrage zurück, und auch auf die Gefahr hin mich zu blamieren, Zygnema hat doch
zwei sternförmige Chloroplasten, wenn ich mich nicht irre? Sollte dieses ,,dazwischen" denn dann überhaupt
chlorophyllig fluoreszieren?
Die Farbe könnte ja auch ein Artefakt des Weißabgleiches sein?
Viele Grüße
Timm
Noch ein Tipp,
will man kein sichtgares Licht von der Nichia mit 365nm abstrahlen lassen, so hilft ein Bandfilter von Baader "U-Filter" sehr gut. Zentralwellenlänge liegt bei 350nm.
http://www.sonnen-filter.de/Filter-1/Ba-U-lin.gif
Für den Mikroskopiker wird es aber nun etwas gefährlicher, denn man sieht und bemerkt die starke Strahlung nicht mehr. Also nur mit gesichertem Augenschutz hantieren ! Und selbstverständlich ist jede direkte Beobachtung zu vermeiden.
Gruß
Peter
P.S.
Auch optische Zusatzbauteile im Strahlengang (Optovar) sind bei diesen Wellenlängen sehr hinderlich. Aus eigener Fehlersuche : Das Optovar in Stellung 1x läßt gerade mal 25% Strahlung durch und vermindert den Kontrast erheblich. Der Linsensalat mit Kittschichten ist nicht UV förderlich.
ZitatP.S.
Auch optische Zusatzbauteile im Strahlengang (Optovar) sind bei diesen Wellenlängen sehr hinderlich. Aus eigener Fehlersuche : Das Optovar in Stellung 1x läßt gerade mal 25% Strahlung durch und vermindert den Kontrast erheblich. Der Linsensalat mit Kittschichten ist nicht UV förderlich.
Das ist ja hochinteressant! Soweit ich informiert bin, enthält z.B. der der Fluoreszenz-Auflichtkondensor IV-FL auch ein solches Telanlinsensystem wie das Optovar und dürfte demnach auch nicht für UV geeignet sein. Oder sind diese etwa UV-durchlässig?
Viele Grüße
Bernd
Zitat von: treinisch in April 30, 2012, 13:45:04 NACHMITTAGS
Hallo Ralf,
mal auf die Ursprungsfrage zurück, und auch auf die Gefahr hin mich zu blamieren, Zygnema hat doch
zwei sternförmige Chloroplasten, wenn ich mich nicht irre? Sollte dieses ,,dazwischen" denn dann überhaupt
chlorophyllig fluoreszieren?
Die Farbe könnte ja auch ein Artefakt des Weißabgleiches sein?
Viele Grüße
Timm
Lieber Timm,
ich glaube du liegst mit deiner Vermutung genau richtig. Ich habe eben noch mal eine Hellfeldaufnahme gemacht. In der Tat ist in der Mitte kaum Chlorophyll vorhanden. Danke für deinen Hinweis!
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91607_60170116.jpg)
Zitat von: Klaus Herrmann in April 30, 2012, 13:14:48 NACHMITTAGS
Hallo Bernd,
ZitatLP397 als Sperrfilter geeigneter und wird auch meist verwendet. Sowas hast du bestimmt auch noch
Aber natürlich! Werde ich Ralf zum Test schicken.
# Ralf: leider habe ich keinen λ -Schieber übrig! Aber den von Bernd vorgeschlagenen Sperrfilter verpacke ich gleich!
Lieber Klaus, liebe Filterexperten,
ich werde jetzt mal den Filter von Klaus testen und dann hier (in einem neuen Beitrag) darüber berichten.
Hallo Bernd,
richtig, dass auch der Fluoreszenzknochen IV-FL ein Telansystem enthält. Aber die Strahlung durchläuft das Kondensorsystem, den Anregungsfilter, den Strahlenteiler und nun nur einmal eine Telanlinse!
Im Optovar sind es die untere und obere Telanlinse und noch auf dem Drehteller ein Optiksystem. Also im Minimum 6 Linsen zu 3 Glieder mit 3 Kittschichten. Da bleibt eben was hängen.
Jetzt könnte man noch untersuchen, ob die untere Telanlinse vom Optovar und dem IV-FL aus identischen Gläser gefertigt sind. Wer prüft das mal schnell ? ;D
Schönen 1.Mai
Peter
Hallo Peter -
mit der UV-Durchlässigkeit der (Zeiss)gläser ist das so eine Sache.
Bezogen auf die Nichia LED scheint mir die untere Telanlinse des Knochens nicht viel zu sperren (Gefühlsstatistik, sollte aber auch nicht sein).
Einerseits ist es Allgemeingut, dass die Planapochromaten wenig UV 365 durchlassen - andererseits ist hier das Planapo 40/0,95 (trocken) besser als ein Neofluar 40. Natürlich ist der subjektive Eindruck auf die höhere Apertur zurückzuführen, allerdings sind die anderen Planapos tatsächlich fast alle UV-blind!
Viele Grüße
Rolf
Hallo Peter,
Zitatmit der UV-Durchlässigkeit der (Zeiss)gläser ist das so eine Sache.
Bezogen auf die Nichia LED scheint mir die untere Telanlinse des Knochens nicht viel zu sperren (Gefühlsstatistik, sollte aber auch nicht sein).
Aber haben wir es bei Ralfs Aufbau nicht mit der Durchlichtfluoreszenz zu tun? Die UV-Strahlung gelangt also in dem gezeigten Fall von der LED direkt in den Kondensor und so in das Präparat. Weiter braucht und soll sie auch nicht.
So kann die UV-Strahlung also noch getrost vom Objektiv und den folgenden Linsensystemen abgeblockt werden, was dann auch spätestens der LP397 macht, der sich schon vom Klaus auf dem Postweg befindet.
Viele Grüße
Bernd
Zitat von: Nomarski in Mai 01, 2012, 11:51:10 VORMITTAG
So kann die UV-Strahlung also noch getrost vom Objektiv und den folgenden Linsensystemen abgeblockt werden, was dann auch spätestens der LP397 macht, der sich schon vom Klaus auf dem Postweg befindet.
Hallo Bernd,
ich frage vorsichtshalber noch einmal nach: Kann ich mit dem LP397 wirklich bei meinem Aufbau mit den Augen durchs Okular schauen ohne Schädigungen befürchten zu müssen?
Hallo Ralf,
wenn der LP397 als Kantenfilter tatsächlich alle kürzeren Wellenlängen sperrt, dürfte dieses Risiko auf jeden Fall herabgesetzt sein. Denn wenn man keinen Kantenfilter verwendet, kann auch nicht die Anregungswellenlänge gesperrt werden, sei sie im nicht sichtbaren Bereich bei 365nm als auch im sichbaren Bereicht, z.B. bei 455nm oder gar 546nm. Schließlich kann man die Fluoreszenz auch nur als solche erkennen, wenn die Anregungswellenlänge vor dem Lichtaustritt, also vor dem Okular gesperrt wird.
Die Sperrfunktion hängt aber auch noch von der Intensität der Strahlungsquelle ab, deswegen kann ich hier keine Unbedenklichkeitsbescheinigung abgeben, was dein Aufbau betrifft.
Wenn also mit einer Wellenlänge von 365nm angeregt wird und der Kantenfilter diese Wellenlänge auch sprerren kann, sollte normalerweise zunächst der Bildhintergrund schwarz sein. Dein erstes Foto zeigt aber etwas anderes. Es sind dann nur Objekte sichtbar, die aufgrund der Bestrahlung durch die Anregungswellenlänge, in dem Fall 365nm, in einer längeren Wellenlänge gem. der Stokes'schen Regel Licht abstrahlen können. Und diese Wellenlängen müssen im Durchlassbereich des Kantenfilters liegen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/91699_61847716.jpg)
Das ist zwar keine Zygnema, aber mit etwa 365nm angeregt und durch ein LP410er Kantenfilter aufgenommen.
Viele Grüße
Bernd
Hallo Ralf,
ich gebe zu bedenken, dass die Nichia nicht nur bei 365nm emittiert, sondern bis über 400nm noch abstrahlt. Ein Sperrfilter um 400nm wird vor dem Maximum schützen, aber der Untergrund wird vermutlich nicht schwarz sein.
Eine Verbesserung bringt das U-Filter aus der Astronomie ; leider teuer.
Da die Farbfilter der Bayermaske sehr unterschiedlich sind, ist eine allgemeine Aussage nicht möglich. Die Kamera kann also im Gegensatz zum Auge einen ganz anderen Farbeindruck bekommen.
Wenn die Nichia eingeschaltet ist sehe ich niemals durch das Okular und schirme auch jede Streustrahlung gut ab.
Gruß
Peter
Hallo Bernd, Peter, Ralf-
ein LP397 oder irgendein anderes Langpass-Fiter um 400 nm schneidet weder alle Wellenlängen kürzer als den Nennwert sicher ab, noch läst es alle Wellenlängen länger als den Nennwert mit gleicher Intensität durch. Die Transmissionskurve (!) hat selbst bei recht "scharfen" Interferenzfiltern typischerweise einen Anstieg im kurzwelligeren Bereich des Nennwerts und auch eine Annäherung der maximalen Transmission, der Einiges längerwellig ist als der Nennwert des Filters.
Das bedeutet für die Sicherheit der Augen, dass vor den Okularen noch ein weiteres Filter liegen sollte, dass ganz sicher Wellenlängen unter 400 nm vollständig blockiert, oder aber solch Eines schon vor dem Strahlenteiler eingeschaltet ist und dann auch im Wege der Bildgebung liegt. Alles Andere halte ich für bedenklich.
Herzliche Grüße,
Thomas