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Bibliothek => Aufnahmen => Leben im Wassertropfen => Thema gestartet von: Ralf am April 28, 2013, 20:58:50 Nachmittag

Titel: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am April 28, 2013, 20:58:50 Nachmittag
Hallo,

habe mal versucht die Chlorophyll Primärfluoreszenz bei Hydra viridis dazustellen. Anregung mit 365 nm LED, LP 519 nm IF Filter, 3,2 sec. Belichtungszeit bei ISO 800. Kondensor in DF Stellung.
Neben der roten Fluoreszenz des Chlorophylls der symbiontischen Grünalgen sieht man auch noch grüne Beulen auf der Hydra. Diese sind laut Wassertropfen Hoden oder Eizellen, genau kann ich es nicht sagen.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124626_50387247.jpg)



Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Eckhard am April 28, 2013, 21:05:16 Nachmittag
Hallo Ralf,

das ist eine schöne Aufnahme von einem grossen "Vieh". Was war das denn für ein Objektiv?

Herzliche Grüsse
Eckhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am April 28, 2013, 21:28:42 Nachmittag
Hallo Eckhard,

die Aufnahme wurde mit einem CP-Achromaten, 5x/0,12 ∞/- gemacht.

Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 13:47:41 Nachmittag
Ja toll, lieber Ralf


dabei hier auch noch mal öffentlich meine Frage an die Fluoreszenzexperten:

Während z.B Mooschloroplasten bei Blauanregung (bei 470nm Anregung und LP 515) leuchten wie ne rote Verkehrsampel, sehe ich bei UV Anregung (365nm und Leitz Filterwürfel A = LP 430nm) gar nichts. Ist die Fluoreszenz nur zu schwach (immerhin braucht Ralf eine sehr lange Belichtungszeit) oder liegt es am Sperrfilter?

Viele Mikrogrüße

Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am April 29, 2013, 15:29:42 Nachmittag
Zitat
sehe ich bei UV Anregung (365nm und Leitz Filterwürfel A = LP 430nm) gar nichts.

Das wird an der falschen Anregungswellenlänge liegen lieber Bernhard.
Musikalisch gesprochen: zur Resonanz gehört die passende Anregungsfrequenz.

Und abgesehen davon mit UV machst du das Chlorophyll  janz schnell kapott!
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 15:40:39 Nachmittag
Zitat
sehe ich bei UV Anregung (365nm und Leitz Filterwürfel A = LP 430nm) gar nichts.

Das wird an der falschen Anregungswellenlänge liegen lieber Bernhard.



...und warum klappt es dann beim Ralf mit 365nm??  Weil der unmusikalisch ist und den Kammerton nicht gehört hat?  ;D

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am April 29, 2013, 16:10:50 Nachmittag
Vielleicht hat er einen anderen dichroitischen Teiler oder das ist gar kein Chlorophyll, das da leuchtet, oder ich muss es selbst mal überprüfen und staunen? :o
Mach ich doch glatt!
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Jan Dunst am April 29, 2013, 16:24:05 Nachmittag
Hallo zusammen,

könnte es bei der doch relativ langen Belichtungszeit von 3,2 Sekunden nicht einfach nur "Hintergrund"leuchten sein?
Aus meinen Erfahrungen mit der Immunhistochemie sind bei mir meist bereits schon mit Belichtungszeiten von > 2 Sekunden fast alle Strukturen auch ohne positives Signal sichtbar, aber bei Chlorophyll fehlen mir da Erfahrungswerte.

Diese Anmerkung wollte ich nur mal in die Runde geben und harre der Antwort der Fachleute.

Wie dem auch sei, ein schönes Foto.

Liebe Grüße,
Jan
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 17:13:28 Nachmittag
Vielleicht hat er einen anderen dichroitischen Teiler oder das ist gar kein Chlorophyll, das da leuchtet, oder ich muss es selbst mal überprüfen und staunen? :o
Mach ich doch glatt!

Das würde mich wirklich interessieren. Ralf wird sich ja noch selber äussern, wenn er von der Arbeit kommt.  ;)

So viel sei schon verraten: Ralf knallt einfach von unten seine Nichia 365 im DL drauf. Normalerweise sogar ohne Sperrfilter UND NATÜRLICH NUR FOTOGRAFISCH; NICHT VISUELL; LIEBE KINDER!!!

Das Wort dichroitischer Teiler kennt er gar nicht  ;D

Warum er hier einen LP 519 genommen hat, wird er uns wohl selber verraten.

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am April 29, 2013, 18:19:18 Nachmittag
Zitat
Warum er hier einen LP 519 genommen hat, wird er uns wohl selber verraten.

Kann ich auch ;D : den hat er von mir, das ist ein hochwertiger Interferenzfilter, der gab bessere Ergebnisse wie der Farbglas LP 520.
Das ist aber der Sperrfilter.

Ich habe gerade Tests gemacht, allerdings im Auflicht und mit richtigen Filterblöcken. Muss die Bilder noch runter laden.
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 18:21:30 Nachmittag
Zitat
Warum er hier einen LP 519 genommen hat, wird er uns wohl selber verraten.

Kann ich auch ;D : den hat er von mir, das ist ein hochwertiger Interferenzfilter, der gab bessere Ergebnisse wie der Farbglas LP 520.
Das ist aber der Sperrfilter.


Ja klar Sperrfilter. Aber ist 365nm und 519nm nicht ein bisken weit auseinander?


LG Bernhard


Tante Edit: Zusatzfrage: einen Reinfalleffekt wie bei meinen ersten Versuchen können wir ausschliessen, ja?

http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?2,50556,50556#msg-50556
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am April 29, 2013, 18:39:14 Nachmittag
Liebe Freunde,

Dank an Bernhard, dass er die Diskussion angeregt hat. Dadurch ist mir erst klar geworden, was ich da eigentlich gemacht habe:

Die Nichia LED hat zwar eine Wellenlänge von 365 nm, aber auch, bedingt durch den Diffuser aus Plastik, der auf der LED sitzt, einen erheblichen Blauanteil. Klaus hat also als Chemiker natürlich recht: 365 nm sind für die Anregung von Chlorophyll denkbar ungeeignet, weil es dort nicht absorbiert. Aber der Blauanteil vom Diffuser kann sehr wohl die Chlorophyllfluoreszenz angeregt haben, weil Chlorophyll um die 440 nm eine starke Absorptionsbande zeigt. Den LP 519 IF nehme ich, weil dann das Blau aus dem Diffuser weniger stört.
Auch die Überlegung von Jan geht in diese Richtung und natürlich konnte er nicht wissen, dass der Blauanteil so stark ist.

Demnächst zeige ich die Hydra mal angeregt mit einer blauen LED. Dies sollte dann auch zu kürzeren Belichtungszeiten und damit besseren Fotos führen.

Bernhard hat damit recht, dass ich nicht weiß was ein dichroitischer Teiler ist, würde mich aber gerne belehren lassen. Zu Unrecht hat er mich als unmusiklaisch bezeichnet, denn immerhin bin ich ein großer Fan von Frank Zappa.




Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: reblaus am April 29, 2013, 20:39:57 Nachmittag
Hallo Ralf -

da ich ebenfalls mit einer Nichia arbeite, würde mich die Sache mit dem "Diffuser" genauer interessieren. Im Datenblatt steht ja nichts davon und die 365 nm Bande sieht doch ziemlich schmal aus; soweit man das aus der Grafik entnehmen kann ist bei 400 nm Schluss. Unbestreitbar scheint aber ein größerer Blauanteil vorhanden zu sein, zumindest kommt man meist nicht ohne Erregerfilter aus.

Mit der Lupe kann ich über dem Emitter nur eine klare Kunststoff(?)-Scheibe entdecken. Wirkt diese eventuell im UV-Bereich dann als Diffuser? Das allein würde aber wahrscheinlich nicht zu einem höheren Blauanteil führen - es müsste ja dann ein Fluoreszenzfarbstoff enthalten sein. Gibt es da irgendwo weitere Infos?

Viele Grüße

Rolf

P.S. Die Nichia CSU 033 wird derzeit für etwa 70.- anscheinend ohne Bürokratie angeboten.
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Rolf-Dieter Müller am April 29, 2013, 20:59:48 Nachmittag
Ralf, eine sehr interessante Aufnahme zeigst Du, und ich bin schon auf Deine Ergänzung mit Blauanregung gespannt. Hierbei wirst Du aber sicherlich nicht um einen Anregungsfilter herum kommen, jedenfalls bekomme ich nur mit einem dicken BG3 bei Durchlichtfluoreszenz ein mit Auflichtfluoreszenz vergleichbares Ergebnis.

@Bernhard, ist Deine eigentlich sehr interessante Frage mit Ralf’s letztem Beitrag beantwortet? Ansonsten müssten wir weiter diskutieren, bzw. Du einen Anregungsfilter >440 nm einsetzen.

Unteren anderem auch diese Diskussion lässt mich zweifeln, ob LED’s als Anregungslicht für uns eine gute Wahl ist. Ich meine Thomas (TPL) hat sich schon einmal dazu geäußert, viel interessanter und spannender wäre Anregungslicht mit einem breitem Spektrum im kurzwelligen Bereich. Für mich heißt es, die HBO wieder anflanschen und Spardose daneben stellen, denn eine Stunde Betrieb dürfte so um die 1 Euro kosten. Oder mit Bernd (Nomarski) über eine Xenon verhandeln.

Viele Grüße
Rolf-Dieter
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 21:34:13 Nachmittag
Liebe Freunde,

Die Nichia LED hat zwar eine Wellenlänge von 365 nm, aber auch, bedingt durch den Diffuser aus Plastik, der auf der LED sitzt, einen erheblichen Blauanteil. Klaus hat also als Chemiker natürlich recht: 365 nm sind für die Anregung von Chlorophyll denkbar ungeeignet, weil es dort nicht absorbiert. Aber der Blauanteil vom Diffuser kann sehr wohl die Chlorophyllfluoreszenz angeregt haben, weil Chlorophyll um die 440 nm eine starke Absorptionsbande zeigt. Den LP 519 IF nehme ich, weil dann das Blau aus dem Diffuser weniger stört.
Auch die Überlegung von Jan geht in diese Richtung und natürlich konnte er nicht wissen, dass der Blauanteil so stark ist.


Aaahaaa...dann bin ich wieder im Film, jetzt verstehe ich!


Zitat
Zu Unrecht hat er mich als unmusiklaisch bezeichnet, denn immerhin bin ich ein großer Fan von Frank Zappa.


 ;D ;D keine weiteren Fragen Euer Ehren  ;)


LG Bernhard





Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 29, 2013, 21:37:08 Nachmittag

Unteren anderem auch diese Diskussion lässt mich zweifeln, ob LED’s als Anregungslicht für uns eine gute Wahl ist. Ich meine Thomas (TPL) hat sich schon einmal dazu geäußert, viel interessanter und spannender wäre Anregungslicht mit einem breitem Spektrum im kurzwelligen Bereich. Für mich heißt es, die HBO wieder anflanschen und Spardose daneben stellen, denn eine Stunde Betrieb dürfte so um die 1 Euro kosten. Oder mit Bernd (Nomarski) über eine Xenon verhandeln.

Viele Grüße
Rolf-Dieter

Hallo Rolf-Dieter

scheint wohl so zu sein. Ich darf mich also wieder nach einem passenden Lampenhaus umschaun.  ::) Bernd: mach Dich schon mal warm!  ;)

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Horst Wörmann am April 30, 2013, 12:44:56 Nachmittag
Liebe Floureszenzler,

die Nichia-UV-LEDs haben keinen Diffusor oder ähnliches, zumindest meine Nichia NCSU033B nicht. Sie emittiert sehr schmalbandig bei 365 nm mit einer Halbwertsbreite von 9 nm. Oberhalb von 400nm kommt nichts.
Die 470-nm-LED hat - nach dem Filtersatz 09 in Präparateebene gemessen - ein Peakmaximum bei 476 nm und eine Halbwertsbreite von 22 nm, siehe Spektrum (blau: Nichia-UV-LED, grün: LUXEON REBEL LXML PB01. Die Intensitäten sind nicht vergleichbar, weil unterschiedliche Meßbedingungen):

IMG](https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124699_5501827.jpg)

@ Rolf-Dieter: Xenon anflanschen und breitbandig einstrahlen nützt nichts. Man sollte schon versuchen, definierte Wellenlängen einzustrahlen, das gibt außerdem noch interessante Hinweise zum Chlorophyll-System bzw. zur Fluoreszenz allgemein. Also Monochromator bauen (wann fangen wir an?)
Interessanterweise habe ich bei Messungen von Chlorophyll-Extrakten mit dem Labor-Spektrometer bisher keine eindeutigen Ergebnisse bei der Anregung erhalten. Die Emission gibt dagegen immer eine saubere Bande in der Gegend 650...680 nm. Werde am Donnerstag noch ein paar Versuche machen. Vielleicht kann ich danach ein Anregungsspektrum im Bereich 220 bis 500 nm zeigen, könnte hier vielleicht interessieren.

Viele Grüße aus Bonn
Horst
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Nomarski am April 30, 2013, 14:01:11 Nachmittag
Hallo Horst,

deine Ausführungen nach drängt sich mir die Frage auf, ob der Autor dieses Threads überhaupt mit 365nm angeregt haben kann. Oder wird da mal wieder Blau mit UV verwechselt?

Viele Grüße
Bernd
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am April 30, 2013, 14:42:24 Nachmittag
Hallo Horst,

deine Ausführungen nach drängt sich mir die Frage auf, ob der Autor dieses Threads überhaupt mit 365nm angeregt haben kann. Oder wird da mal wieder Blau mit UV verwechselt?

Viele Grüße
Bernd

Ähem..hüstel...also wenn ich das richtig erinnere, sagte mir Ralf, dass ihm ein gewisser Bernd W. die LED höchstpersönlich eingebaut hat  ???

Wir kriegen schon noch raus warum im Hause Wagner alles anders fluoresziert als auf dem Restplaneten  ;D

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Nomarski am April 30, 2013, 18:15:36 Nachmittag

Ähem..hüstel...also wenn ich das richtig erinnere, sagte mir Ralf, dass ihm ein gewisser Bernd W. die LED höchstpersönlich eingebaut hat  ???

Wir kriegen schon noch raus warum im Hause Wagner alles anders fluoresziert als auf dem Restplaneten  ;D

LG Bernhard

Das trifft zwar zu, aber dabei handelte es sich um eine weiße LED (Cree XM-L T6), die nur bedingt für Blauanregung geeignet ist und jedenfalls keine 365nm emittiert.

VG
Bernd
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: knipser009 am April 30, 2013, 19:38:23 Nachmittag
Liebe Fluoreszenzler,

Interessanterweise habe ich bei Messungen von Chlorophyll-Extrakten mit dem Labor-Spektrometer bisher keine eindeutigen Ergebnisse bei der Anregung erhalten. Die Emission gibt dagegen immer eine saubere Bande in der Gegend 650...680 nm. Werde am Donnerstag noch ein paar Versuche machen. Vielleicht kann ich danach ein Anregungsspektrum im Bereich 220 bis 500 nm zeigen, könnte hier vielleicht interessieren.

Viele Grüße aus Bonn
Horst


hallo Horst

ohne Dich in Deinem Versuchseifer bremsen zu wollen: aber ich glaube , dass diese Spektrenaufnahme eines Chlorophyllextraktes in Vergleich zum nachfolgenden Wikipediaspektrum nichts
anderes ergibt.

http://de.wikipedia.org/wiki/Chlorophylle

Die rote Eigenfluoreszenz einer Rohchlorophylllösung wird ja üblicherweise dadurch erklärt, dass die Chlorophylle in einer intakten Zelle im blauen und insbesondere im roten Anteil des sichtbaren Lichtes absorbieren und diese Energie an Photosysteme der Lichtreaktionen weitergeleitet wird. In einer Rohchlorophylllösung, d.h. bei defekter Zelle , kann diese Energie nicht zur weiteren Photosynthese genutzt werden - und wird als rote Fluoreszenz abgegeben.

Grüsse aus dem regnerischen Saarland

Wolfgang
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am April 30, 2013, 19:54:04 Nachmittag
Hallo @all,

noch einmal zur LED:

- es ist ebenfalls eine Nichia NCSU033B
- diese ist durch einen Drittanbieter mit einem passenden Reflektor/Diffuser aus Plastik ausgerüstet.
- durch das UV Licht der LED wird der optische Aufheller im Plastik zu einer blauen Fluoreszenz angeregt. Kennt jeder von den weißen Hemden.
- Die LED hat in Kombination mit dem Plastikteil also einen erheblichen Blauanteil. Dieser regt das Chlorophyll an.
- Die Nichia NCSU033B ist nicht von Bernd.

Die Ausrüstung mit dem Reflektor/Diffuser ist sicher ungewöhnlich, wird in meiner Firma aber aus anwendungstechnischen Gründen so gemacht. Ein Kollege hat mir freundlicherweise die LED zusammengelötet.



Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Nomarski am April 30, 2013, 20:39:25 Nachmittag
Hallo,

Zitat
P.S. Die Nichia CSU 033 wird derzeit für etwa 70.- anscheinend ohne Bürokratie angeboten.

warum einfach, wenn es umständlich auch geht. Eine Royal Blue, die dasselbe direkt bewirkt und das viel besser kostet etwa ein Zehntel des Preises. :D

VG
Bernd
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Horst Wörmann am Mai 01, 2013, 11:29:46 Vormittag
Hallo Wolfgang,

"ohne Dich in Deinem Versuchseifer bremsen zu wollen: aber ich glaube , dass diese Spektrenaufnahme eines Chlorophyllextraktes in Vergleich zum nachfolgenden Wikipediaspektrum nichts anderes ergibt."

Schön wär's. Das habe ich anfangs auch gedacht. Ergibt aber doch was anderes! Warum? Deshalb die Experimente. Daß eine Rohchlorophyll-Lösung anderes reagiert als Chlorophyll in situ ist klar, aber am Mikroskop habe ich anregungsseitig keinen Monochromator, nur emissionseitig.

"Die rote Eigenfluoreszenz einer Rohchlorophylllösung wird ja üblicherweise dadurch erklärt, dass die Chlorophylle in einer intakten Zelle im blauen und insbesondere im roten Anteil des sichtbaren Lichtes absorbieren und diese Energie an Photosysteme der Lichtreaktionen weitergeleitet wird. In einer Rohchlorophylllösung, d.h. bei defekter Zelle , kann diese Energie nicht zur weiteren Photosynthese genutzt werden - und wird als rote Fluoreszenz abgegeben."
Chlorophyll in intakter Zellen gibt auch rote Floureszenz, bei voll funktionierendem Photosystem, wie wir in den Fotos in diesem und vielen anderen Beiträgen sehen. Das ist alles doch recht kompliziert, und ich verstehe das auch noch nicht ganz.
Das Chlorophyll-Thema gehört aber eigentlich nicht hierhin, hier ging es ja um die Beleuchtung.

Viele Grüße aus Bonn
Horst
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am Mai 01, 2013, 12:59:39 Nachmittag
Hallo,

ich hatte gesagt, dass ich noch Testbilder von Chlorophyll ("lebend" in frischem Blatt aus dem Garten) zeige mit Auflichtfluoreszenz am Olympus BX 50
Erst Filterblock WIB (Blauanregung) und dann noch WU (UV-Anregung).

Der WIB BP 460-490 und LP 515 IF entsprich etwa dem Zeiss 11
der WU BP 330-385 und LP 420 entspricht etwa dem  Zeiss 01

Bei der UV-Anregung sieht man die Chloroplasten sehr scharf begrenzt, bei der Blauanregung kommt viel diffuse Anregung aus dem Untergrund des Blattes dazu, bei der - eigentlich korrekten - Grünanregung ist alles rot überstrahlt, die Bilder habe ich gelöscht.
Das dritte Bild zeigt in der UV-Anregung schön die Stomata. Das Blatt ist natürlich gewölbt und ich habe kein DG aufgelegt, was für das 20er nicht ganz korrekt ist, da hier die DG-Korrektur schon wichtig wird.

Vor dem Hochladen in PB sind die Bilder ordentlich, jetzt sind sie flau. Da macht die Software irgendwie Matsch draus.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124750_31910704.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/IMG_8488_zpsbc4e2b62.jpg.html)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124750_26695543.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/IMG_8489_zpsb961f55b.jpg.html)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124750_60448749.jpg) (http://s106.photobucket.com/user/microklaus/media/Mikropraeparate%202012/Micropaeparate_2013/IMG_8494_zpsc1dffc8f.jpg.html)
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: reblaus am Mai 01, 2013, 13:04:49 Nachmittag
Hallo -

wer sich mit Fluoreszenz am (noch) intakten System beschäftigt, sollte auch mal im Wiki unter "Kautsky-Effekt" nachlesen. Wenn z.B. ein Blatt aus dem Dunkeln kommt (wie meist bei diesen Untersuchungen), und plötzlich mit photosynthetisch aktivem Anregungslicht beleuchtet wird, dann zeigt es zunächst eine kräftige Fluoreszenz, die im Laufe von 1- 3 min exponentiell auf etwa 10% abnimmt. Das kommt daher, weil der doch sehr komplexe Photosytheseapparat einige Zeit braucht bis alle Bestandteile synchron laufen - während dieser Zeit kann er nicht die ganze Energie aus dem Chlorphyll aufnehmen und diese wird dann als Fluoreszenz wieder abgegeben.

Ich weise deshalb darauf hin, weil dieses Nachlassen der Fluoreszenz häufig auf Schädigung des Chlorophylls durch das Anregungslicht zurückgeführt wird, denn wenn man mit einem 40er Objektiv einige Zeit (nicht zu heftig) belichtet und schwenkt dann ein Zehner ein, oder wenn man die beobachtete Stelle etwas verschiebt, sieht man an der belichteten Stelle einen dunklen Fleck. Dieser ist aber reparabel, man muss nur das Blatt etwa eine halbe Stunde im Dunkeln liegen lassen. In der Ruhephase kommt der Photosyntheseapparat sozusagen wieder "außer Takt" was bei erneutem Belichten wieder zu kräftiger Fluoreszenz führt.

Natürlich wird das Chlorphyll auch tatsächlich zerstört, wenn man UV oder kräftiges Blaulicht lange genug darauf donnert und dann erholt sich der dunkle Fleck nicht mehr.

Viel Vergnügen mit diesen Effekten!

Rolf
 

Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am Mai 01, 2013, 19:53:00 Nachmittag
Hallo Ralf -

da ich ebenfalls mit einer Nichia arbeite, würde mich die Sache mit dem "Diffuser" genauer interessieren. Im Datenblatt steht ja nichts davon und die 365 nm Bande sieht doch ziemlich schmal aus; soweit man das aus der Grafik entnehmen kann ist bei 400 nm Schluss. Unbestreitbar scheint aber ein größerer Blauanteil vorhanden zu sein, zumindest kommt man meist nicht ohne Erregerfilter aus.

Mit der Lupe kann ich über dem Emitter nur eine klare Kunststoff(?)-Scheibe entdecken. Wirkt diese eventuell im UV-Bereich dann als Diffuser? Das allein würde aber wahrscheinlich nicht zu einem höheren Blauanteil führen - es müsste ja dann ein Fluoreszenzfarbstoff enthalten sein. Gibt es da irgendwo weitere Infos?


Hallo Rolf,

ich hatte ganz vergessen auf dein Posting näher einzugehen. Ich hoffe, dass meine letzte Antwort Klarheit geschaffen hat und wenn du Interesse hast, kann ich dir auch den Lieferanten für die Diffuser nennen. So sieht meiner aus:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures003/124763_7864017.jpg)

Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am Mai 01, 2013, 19:54:26 Nachmittag
Danke Klaus, wirklich sehr interessant!!  Ich nehme an Du regst mit einem HBO Brenner an?

Danke auch Dir, Rolf. Da werde ich mich mal einlesen!

Angeregte Mikrogrüße

Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am Mai 01, 2013, 21:45:05 Nachmittag
...für Mitinteressierte hier noch ein PDF.

http://jxb.oxfordjournals.org/content/51/345/659.full.pdf+html

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am Mai 01, 2013, 23:00:06 Nachmittag
Zitat
Ich nehme an Du regst mit einem HBO Brenner an?
... und wie, lieber Bernhard mit 100 W - da wird jedes Auge trocken! ;D

Gibt es eingentich einen "Neutralfilter" für HBO??? Zur  homogenen Reduzierung der Intensität.
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Holger Adelmann am Mai 01, 2013, 23:18:38 Nachmittag

Zitat
Gibt es eingentich einen "Neutralfilter" für HBO??? Zur  homogenen Reduzierung der Intensität.

Lieber Klaus, am besten besorgst Du Dir einen Leitz Variolum, dann kannscht Deine Entladungslampen stufenlos in der Helligkeit regulieren :)

Herzliche Grüsse
Holger
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am Mai 01, 2013, 23:25:07 Nachmittag
Lieber Holger,

gibt es das wirklich? Und wie funktioniert das über alle Wellenlängen linear?
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: knipser009 am Mai 02, 2013, 03:12:38 Vormittag
Lieber Holger,

gibt es das wirklich? Und wie funktioniert das über alle Wellenlängen linear?

hallo Klaus

hier gab es eins :

http://www.ebay.de/itm/Leitz-Variolum-Microscope-Mikroskop-Unit-Colour-Temperature-Compensator-More-/251059422572?ViewItem=&item=251059422572&nma=true&si=vJGn4Sm8ndl0hKKGtxXYC0Z15XE%253D&orig_cvip=true&rt=nc&_trksid=p2047675.l2557

und so funktioniert´s :

http://cryptomonads.net/Leitz_Variolum.pdf

lG

Wolfgang
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Klaus Herrmann am Mai 02, 2013, 09:57:35 Vormittag
Danke Wolfgang,

aber 700.- für ein Teil, das nur am Ortholux 2 passt ich habe ja ein BX, da stimmt gar nix.

Trotzdem verblüffend, dass man HBO-Spektrum linear dämpfen kann.
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Holger Adelmann am Mai 02, 2013, 10:03:31 Vormittag
Lieber Klaus, ja das gibt's wirklich.


Durch die mehrfache Totalreflektion in einem 360 Grad gebogenen Glasstab werden alle Inhomogenitäten beseitigt, u.a. solche auf der Lampenseite, wo man mit einem adjustierbaren Schieber mehr oder weniger Licht zulassen kann.

Mein Variolum (ich habe eine mit Orthoplan-Schwalben) hat ein Schweineschwänzchen aus Quarzglas . ich habe das gestestet und es überträgt auch UV recht gut.

Herzliche Grüsse
Holger
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Nomarski am Mai 02, 2013, 12:34:30 Nachmittag
Hallo,

demnach wandelt also diese Plastik-Streuscheibe UV-Strahlung in blaues Licht um. Gibt es auch solche Scheiben, die das rückwärts können?

VG
Bernd
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am Mai 02, 2013, 16:32:52 Nachmittag
demnach wandelt also diese Plastik-Streuscheibe UV-Strahlung in blaues Licht um. Gibt es auch solche Scheiben, die das rückwärts können?

Hallo Bernd,

es ist, wie ich schon geschrieben habe, nicht die Plastikscheibe selbst, sondern der darin enthaltene optische Aufheller,
der ein Umwandlung des UV-Lichts in blaues Licht bewirkt. Optische Aufheller, meist Coumarin Derivate, findet man im täglichen Leben sehr häufig. Sie werden eingesetzt, um die Wäsche oder auch Papier weißer erscheinen zu lassen. Durch die Kombination der leicht blauen Fluoreszenz dieser Farbstoffe mit dem sichtbaren Licht erscheinen diese Bedarfsgegenstände dann in einem weißeren Weiß. Halte mal eine UV Lampe über Kopierpaier, dann siehts du die blaue Fluoreszenz dieser optischen Aufheller. Eine weitere Funktion der optischen Aufheller ist die, vor einer Schädigung (chemische Zersetzung) durch UV Strahlung zu schützen. Dann nennt man sie auch gerne UV Absorber. Kunstsoffe werden häufig so vor einer vorzeitigen Schädigung durch Sonnenlichteinstrahlung geschützt. Und so eben auch der Plastikdiffuser auf meiner LED.

Umgekehrt funktioniert dieser Vorgang leider nicht. Die Erklärung hierzu findest im sogenannten Jablonski Diagramm (Wikipedia). Es kann immer nur Licht höherer Energie in Licht geringerer Energie umgewandelt werden. Die Energiedifferenz wird durch sogenannte strahlungslose Deaktivierung (Wärme) vom Molekül abgegeben. Der umgekehrte Vorgang, dass energiearme Strahlung in energierreiche Strahlung durch ein Molekül umgewandelt wird widerspricht dem Energieerhaltungssatz.

Ein auch in der (Pilz)Mikroskopie bekannter optischer Aufheller ist das 7-Diethylamino-4-methylcoumarin, auch unter dem Handelsnamen Calcofluor White bekannt. Die Zellwände der Pilzhyphen zeigen damit eine bläuliche Fluoreszenz.



Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Ralf am Mai 02, 2013, 19:42:08 Nachmittag
Hallo,

hier, wie versprochen, noch die Hydra viridis mit Blauanregung abgelichtet.

LED: ALUSTAR 3 W 10°, 470 nm von CONRAD
Anregungsfilter: "FITC-Anregungsfilter" vermutlich ein Bandpässfilter mit Transmissionsbereich um 470 nm.
Sperrfilter: LP 519,6 IF
Belichtungszeit 1,6 sec bei ISO 400

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/124808_66433212.jpg)

Im Vergleich zur Anregung mit meiner Nichia LED ist die Primärfluoreszenz des Chlorophylls der symbiontischen Grünalgen jetzt wesentlich intensiver.

Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: Bernhard Lebeda am Mai 03, 2013, 22:40:41 Nachmittag

LED: ALUSTAR 3 W 10°, 470 nm von CONRAD
Anregungsfilter: "FITC-Anregungsfilter" vermutlich ein Bandpässfilter mit Transmissionsbereich um 470 nm.
Sperrfilter: LP 519,6 IF



Hallo Ralf

der Anregungsbereich für FITC liegt zwischen 460 und 490nm. Insofern ist Dein Filter in Kombi mit Deinem LP 519nm ideal für die Blauanregung mit der Alustar.

Schau Dir damit mal leicht verholzte Pflanzenschnitte an (wie ich es heute wieder getan habe): die wirst Dein blaues Wunder erleben!  ;D

LG Bernhard
Titel: Re: Hydra viridis - Chlorophyll Primärfluoreszenz
Beitrag von: JB am Mai 04, 2013, 00:24:19 Vormittag

Umgekehrt funktioniert dieser Vorgang leider nicht. Die Erklärung hierzu findest im sogenannten Jablonski Diagramm (Wikipedia). Es kann immer nur Licht höherer Energie in Licht geringerer Energie umgewandelt werden. Die Energiedifferenz wird durch sogenannte strahlungslose Deaktivierung (Wärme) vom Molekül abgegeben. Der umgekehrte Vorgang, dass energiearme Strahlung in energierreiche Strahlung durch ein Molekül umgewandelt wird widerspricht dem Energieerhaltungssatz.


Das ist sehr OT, aber ganz so stimmt das nicht. Es kann durchaus energiereichere Strahlung emitiert werden, wenn dem eine Zwei- oder Multiphotonenabsorption vorausgeht. http://en.wikipedia.org/wiki/Two-photon_absorption

Auch wenn dies ein sehr ineffizienter Prozess ist gibt es dafuer sogar verschiedene technische Anwendungen (two photon microscopy). Ein "Scheibchen" das diesen Prozess praktisch ausnutzen koennte gibt es aber nicht :)

Exzitierte Gruesse,

Jon


"Cats do not abide by the laws of nature, alright?"