In die Histologie Literatur wird oft geschrieben das eine Fixierung von Gewebe in Glutaraldehyd ein besseres Ergebnis gibt im Vergleich mit Formalin. Details werden besser/deutlicher dargestellt! (In die Elektronen Mikroskopie wird immer mit Glutaraldehyd oder eine Kombination von Formalin und Glutaraldehyd Fixiert und oft nachfixiert mit Osmiumtetroxid).
In mein versuch habe ich ein Teil von die Zunge eine Ratte Fixiert in ein Kombination von Formalin/ Glutaraldehyd und ein Teil in Gepuffertes Formalin 4%. Eingebettet wurde in Plastik (Technovit 7100).
Das FA/GA Gemisch stammt von 'Karnovsky' (Morris J. Karnovsky, Professor of Pathological Anatomy, Emeritus, http://neuro.med.harvard.edu/faculty/karnovsky.html).
Rezept:
- Formaline 16%, 13ml (Frisch herstellen aus z.B. 16 Tabletten Paraformaldehyde Lösen auf 60 Grad in AD und mit 1N Natriumhydroxid Tropfenweise Justieren bis PH7.0);
- Glutaraldehyd 50% (EM grade), 5ml;
- Phosphat Puffer nach Sorensen PH 7.2, 50ml;
- AD, 32ml.
Resultat ist ein Gemisch von 100ml Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5% in Puffer mit ein PH 7,2.
Das Gewebe wurde geschnitten am LKB 2218 Historange mit ein Leica Hartmetallmesser in 'D' Schliff.
Mikroskopiert am Leitz Orthoplan und Fotografiert mit ein Moticam 2300.
Periphere Nerven (Theorie aus: Sobotta/Welsch),
Periphere Nerven bestehen aus Bündeln markloser und markhaltiger Axone, deren Perikarya (Zellleib) im ZNS (zentrales Nervensystem) oder in Ganglien liegen. Sie dienen der Übertragung von Informationen von der Peripherie zum ZNS und vom ZNS oder den vegetativen Ganglien zur Peripherie. In peripheren Nerven findet man Axone, Gliazellen (Schwann-Glia), Bindegewebe und Gefäße.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_9996212.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_34315526.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_61714922.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_1750743.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_64777520.jpg)
In diesen Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in 4% gepuffertes Formalin sind zwei periphere Nerven zu beobachten wo die Markscheiden der Nerven nicht sehr deutlich hervorkommen.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 63x, NA 1.4
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_47958018.jpg)
Ein weiteren Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5% kommen die Markscheiden schon besser hervor.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x.
Mu = Muskelzelle;
K = Kern eine Muskelzelle;
Fz = Fettzelle;
Mz = Mastzelle;
P = Perineurium;
Ms = Markscheide.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_29616221.jpg)
Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 40x.
Mz = Mastzelle;
P = Perineurium;
Ms = Markscheide;
Ax = Axon;
Sch = Kern eine Schwann-Zelle;
Pfeilpunkten = drei kleine periphere Nerven mit zwei Markhaltige Axonen.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_22058356.jpg)
Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Perjod/Schiffs Reagenz (PAS).
Objektiv Leitz Planapo 40x.
Mu = Muskelzelle;
K = Kern eine Muskelzelle;
Mz = Mastzelle;
Ms = Markscheide;
Ax = Axon;
Sch = Kern eine Schwann-Zelle.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_10852821.jpg)
Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 63x, NA 1.4.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/133534_66010091.jpg)
Viel spass beim anschauen, grusse Ronald
Lieber Ronald,
WOW - wer braucht da noch ein Elektronenmikroskop! ;)
Herzliche Grüße,
Florian
Lieber Ronald!
Grandios, sensationelle Bildqualität und hoch interessant!
Liebe Grüße
Franz
Lieber Ronald,
schön, mal wieder einen Deiner sehr interessanten histologischen Beiträge zu lesen! Ich weiß gar nicht, was mir besser gefällt: Deine fantastischen Bilder oder Deine eingänglichen Erläuterungen.
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Ronald,
super Bilder und klasse gefärbt!
Allerdings muss ich etwas berichtigen:
Du meintest in der Elektronenmikroskopie wird IMMER mit Glutaraldehyd (GA) beziehungsweise einer Kombination aus GA und Formaldehyd fixiert.
Das ist so nicht richtig.
Oftmals wird bei kleinen Proben (2x2x2mm) auch nur in Osmium fixiert.
Bei noch kleineren Proben (1x1x1mm) sogar nur in Osmiumdampf.
Größere Proben fixieren wir in meinem Institut meist mit einer Mischung von Osmiumtetraoxid, Uranylacetat und Natriumperjodat.
Zwar wird GA oft und gern eingesetzt aber es ist nicht für alle elektronenmikroskopischen Untersuchungen geeignet da es auf manche nachzuweisenden Strukturen sehr aggressiv reagiert (zum Beispiel beim Nachweiß von Ribosomen und Virenstrukturen).
Aber dennoch wie gesagt eine ausser ordentlich schöne Arbeit von dir, ich freue mich jedes mal wenn ich deine Bilder sehe! :)
Hallo Max,
kleine Ergänzung: GA oder GA/FA ist immer dann unerlässlich, wenn es um die Darstellung von Struktur-Proteinen geht. Das ist der Grund, warum die Mikrotubuli erst entdeckt wurden, nachdem Karnowski sein Rezept publiziert hatte. Außerdem dringen die Aldehyde schneller ins Gewebe ein und verhindern so autolytische Prozesse.
Gruß
Detlef
hallo Ronald
ich schliessse mich andere Schreibern an
sehr schoene Bilder und gut dokumentiert
herzlichen Gruss
Jan
Hallo Detlef,
Ich sagte ja auch nur nicht immer ;).
Das es nicht immer komplett ohne geht weiss ich, sonst könnten wir ja verschiedene Strukturen nicht nachweisen.
@*.*
Danke für eure Beitrage. Ich war schon sehr beeindruckt das es wirklich Unterschiede gibt. Das nächste Projekt wird sein um ein Teil von das gleiche Gewebe, das ich auch zusatslich Osmiert habe, in Durcupan ein zu betten (wird zur zeit durch ein Histo-Freund durchgeführt) und von das Gewebe Semidunn Schnitte an zu fertigen. Bin sehr gespannt was da vor ein Detail unterschied raus kommt.
Bilder davon werden bestimmt nochmal in ein Beitrag vorgeführt.
Grusse Ronald
Ronald,
ich bin gespannt drauf! ;)
Osmiumtetraoxid habe ich mir nun auch wieder bestellt.
Darin werde ich nun bald die Spinalganglien von Teichmolchen, Feuersalamandern und Chameleons fixieren. :)
Max,
Ich habe immer grosse mühe um Ganglien zu finden. In meine Bücher sieht es immer einfach aus aber wenn den Bauch dann geöffnet ist sieht alles doch wider was anders aus. Woran kannst du Ganglien erkennen? Hast du da zufällig was Bilder von?
Grusse Ronald
Ronald,
man erkennt sie nur als eine Verdickung im Bereich der Nerven die von der Medulla spinalis (dem Rückenmark) abgehen.
Sozusagen wie kleine "Knötchen" in den Nerven.
Ein Bild habe ich leider nicht.
Max,
Danke, ich werde beim nächstes Projekt mal besser schauen.
Eigentlich wäre es mal gut das eine, der es beherrscht, mal ein Schnell-Kurs: 'Autopsie oder Sektion eine Ratte', organisieren möchte. Irgendwo ein Samstag in November/Dezember oder so etwas.
Grusse Ronald
Ronald,
für Studenten biete Ich soetwas an.
Das nächste mal Im September.
Kosten:
Ratte 8€
Verbrauchsmaterial 5-7€
In Jena.
Lieber Ronald,
das sind wieder tolle Bilder :-)
Du könntest noch etwas mit der Vehicle- Osmolarität experimentieren.
Entweder mit einem Zusatz von NaCl (+ z.B. 50 oder 100 mOsmol) oder Plasmaexpander (z.B. 2-4% HES oder Dextran).
Das kann sich selbst bei einer Immersionsfixierung deutlich auf das Gewebe auswirken. Bei einer Perfusionsfixierung ist die Anpassung von Osmolarität und kolloidosmotischem Druck noch sehr viel wichtiger.
Bei Nervengewebe kann man auch mal das Griffith- full- strength ausprobieren.
Da sind es dann sogar 5% GA und 4% FA in 0.8M Na- Cacodylatpuffer. Besonders
bei Immersionsfixierungen des Gehirns soll das gut sein.
Bei so starken Fixativen wirkt sich auch die Fixativ- Osmolarität spürbar auf das Gewebe aus (deutlich über 1000mOsmol). Die Osmolarität des Vehicles (Puffer + Salze oder Plasmaexpander) hat in der Regel aber mehr Einfluss auf das Gewebe, sodass man diese bei der Berechnung stärker gewichten sollte.
Da gibt es ja die praktische "Maunsbach- Formel" in Deinem Buch :-)
Die genannten Begriffe in der Elmi sind immer etwas undeutlich finde ich. Die Behandlung mit Osmiumtetroxid ist ja eine Fixierung, eine "Osmierung" und eine Kontrastierung. Die Behandlung mit Uranylacetat ist en- bloc auch eine Fixierung und Kontrastierung, am Grid eine Kontrastierung.
Die Fixierung in der Elmi ist sehr kniffelig. Die Chemikalien reagieren relativ spezifisch. Detlef hat die Reaktion der Aldehyde ja schon angesprochen.
Früher wurde nur mit ungepuffertem Osmiumtetroxid fixiert. Palade hat 1952 die gepufferte Osmiumtetroxidfixierung vorgestellt, denn das Osmiumtetroxid reagiert mit Gewebe sauer.
Sabatini hat später die Eigenschaften von Aldehyden verglichen, Glutaraldehyd war der "Testsieger". So musste auch nicht mehr mit dem hochgiftigen Osmiumtetroxid perfundiert werden.
Stark vereinfacht könnte man vielleicht sagen:
Formaldehyd reagiert mit vielen Komponenten, vernetzt aber primär reversibel und fixiert dadurch eher schwach. So ist das Gewebe für die anschließende Verarbeitung anfälliger für Artefaktbildung.
Glutaraldehyd reagiert primär mit den Proteinen. Nukleinsäuren und Lipide werden idR. nur durch assoziierte Komponenten (Kernproteine oder Lipoproteine) fixiert. Nukleinsäuren reagieren möglicherweise bei höheren Temperaturen mit dem GA, nach Aufspaltung der Wasserstoffbrückenbindungen der DNA.
Osmiumtetroxid reagiert primär mit den Lipiden.
Die genauen Reaktionen sind meines Wissens nach nicht vollkommen geklärt. Das Glutaraldehyd soll in Lösung in mind. 13 verschiedenen Formen vorkommen, die Verteilung ist u.a. abhängig von pH und Temperatur.
Eine Primärfixierung mit FA/GA deckt bei der Immersionsfixierung m.E. ein sehr breites Spektrum ab. Mit einer anschließenden Osmierung hat man dann viele verschiedene Komponenten fixiert und für die weitere Verarbeitung stabilisiert.
Du könntest ja mal verschiedene fixierte Gewebe im Kühlschrank in Puffer lagern. Solche Gewebe können sich sehr lange gut halten. Möglicherweise bietet sich mal die Gelegenheit, das Gewebe in Epon einzubetten. Dann könnte man davon Semis und Ultras schneiden und am TEM fotografieren :-)
Ich bin sehr gespannt auf weitere Fotos und freue mich, dass Du so aufwändige Verarbeitungen meisterst.
Viele Grüße,
Carsten
Tolle Bilder Ronald.
Ich gehe ganz konform mit Carsten was die Qualität und den hohen Standard auch Deiner Fixierung angeht.
Ja, bei Nervengewebe solltest Du mit Plasmaexpandern arbeiten um die Gewebe-Osmolalität möglichst gut zu treffen, sonst hast Du entweder Schrumpfungen oder 'Pseudoräume' durch hypotones 'Aufquellen' des Gewebes.
Statt Plasmaexpandern kannst Du auch mal 2-5% Saccharose (Haushaltszucker) in der Fixierlösung experimentieren.
Manche Strukturen werden im EM auch mit Kaliumpermanganat fixiert - ich glaube das waren Ribosomen, bin mir aber nicht absolut sicher....
Bei der Osmierung ist weiterhin zu beachten, dass das OsO4 nur sehr schlecht ins Gewebe eindringt, da es sich ja sofort an die ersten erreichbaren Lipide bindet. Obwohl Du fuer Deine Feingewebsuntersuchungen sicher nur sehr kleine Stuecke fixierst, wirst Du dennoch bei der Immersionsfixierung hier einen Gewebegradienten der Osmierung bekommen. OsO4 geht nach meinen frueheren Erfahrungen am besten / gleichmässigsten per Perfusionsfixierung.
Es ist wahrscheinlich trivial anzumerken, bzw. irgendwo hier schon geschrieben, aber vor der Perfusion mit Fixativen ist zuerst das Gefässystem mit einer möglichst isotonischen / isoosmolaren Lösung frei von Protein / Blut zu spuelen.
Mehr davon bitte !!!
Herzliche Gruesse
Holger
Das Kaliumpermanganat stellt primär die Membranen in einem sehr harten Kontrast zum Zytoplasma dar (es gibt auch im Maunsbach einen kurzen Abschnitt dazu). Wie bei der Osmierung mit O4 und Kaliumhexacyanoferrat erscheint das Zytoplasma sehr licht, wodurch sich die Membranstrukturen sehr gut abgrenzen lassen.
Ribosomen werden durch das Kaliumpermanganat entweder maskiert oder nicht fixiert und ausgewaschen. Das Glykgogen wird wohl gut dargestellt, hier sind einige Seiten aus dem Maunsbach online: (S. 44)
http://books.google.de/books?id=xpoYa960wesC&pg=PA31&hl=de&source=gbs_toc_r&cad=4#v=onepage&q&f=false
Das Chromatin, bzw. die DNA, soll durch das Kaliumpermanganat gut stabilisiert werden und füllt damit eine kleine Lücke in vielen Fixierungen. Oft wird die DNA erst bei der Entwässerung durch Alkohol oder Aceton fixiert, allerdings nicht vernetzend sondern denaturierend.
In "Fixation for electron microscopy" von "Hayat" sind viele Überlegungen zur Fixierung zusammengefasst, auch wenn es für meinen Geschmack etwas zu chemisch erklärt wird ;-)
Das Osmiumtetroxid macht immer mal gerne Probleme bei uns. Es ist wohl an der Bildung von Präzipitaten beteiligt, besonders nach Fixierungen in einem Phosphatpuffer. Es sind besonders häufig membranreiche Komponenten beteiligt (z.B. Mitochondrien und Lysosomen). Evtl. ist das auch abhängig von der Dauer der Osmierung. Diese Präzipitate werden möglicherweise auch erst durch die Kontrastierung dargestellt, Mollenhauer hat 1987 2 Paper zu dem Thema publiziert.
Contamination of thin sections: Some observations on the cause and elimination of "embedding pepper"
Comparison of surface roughness of sections cut by diamond, sapphire, and glass knives
Wer sich traut, mit O4 zu perfundieren, wird bestimmt auch interessante und gute Ergebnisse bekommen. Das Zeug ist allerdings extrem giftig, deswegen hat man sich bestimmt auch sehr über das Glutaraldehyd gefreut :-)
Außerdem neigen Gefäße bei der Perfusion mit O4 eher zur Vasokonstriktion, deswegen hat man dem Fixativ früher häufiger Vasodilatatoren zugefügt. Das passiert beim Glutaraldehyd erst bei sehr hohen Konzentrationen in ähnlicher Weise.
Ich hoffe, meine Ausführungen sind nicht zu ausschweifend. Ich dachte mir nur, dass ich jetzt endlich mal Wissen aus meinem kleinen (manchmal praxisfernen) Spezialgebiet vorstellen kann.
Ein kleiner Tipp für Pankreas und Dünndarm bei Perfusionsfixierungen: Besonders hier sollte man auf den kolloidosmotischen Druck achten. Das Pankreas braucht nicht so viel, vielleicht 1-2% HES. Der Dünndarm braucht deutlich mehr.
(auch hier wird man im Maunsbach fündig).
Viele Grüße,
Carsten
Ah - dachte mir doch, dass ich da möglicherweise bzgl KMnO4 und Ribosomen was durcheinander gebracht habe, Carsten.
Ich hatte nur in Erinnerung, dass es für bestimmte Strukturen gut geeignet ist.
Wir hatten damals mit OsO4 in Cacodylatpuffer perfundiert, und zwar nach Ga/ Fa.
Das ist aber halt beides giftig und damit für den Hobbyisten mit Vorsicht zu geniessen.
Hast Du auch Erfahrung mit Zuckerzusatz ?
Gruss, H.
Mit Zuckerzusatz habe ich wenige Erfahrungen gemacht, nur in der Vorspüllösung. Er ist möglicherweise auch für das Fixativ sehr gut geeignet. HES und Dextran sind durch die z.T. sehr langen Moleküle vielleicht etwas problematisch, besonders in der Niere.
In einer Publikation wurden mal 2 oder 3 verschiedene Plasmaexpander gegenübergestellt, den Namen habe ich leider grade nicht parat. Hoffentlich erinnere ich mich da richtig... Die Wirkung wurde dabei auf den kolloidosmotischen Druck zurückgeführt, weniger auf die verschiedenen Moleküle, denn große Unterschiede in der Morphologie gab es nicht.
Es gibt unglaublich viele Publikationen und Bücher zu diesem Thema, hätte ich nie gedacht. So richtig greifbar sind die Mechanismen für mich aber noch nicht.
Von Hopwood gibt es da ein tolles review:
"Cell and tissue fixation, 1972-1982." (1985)
Viele Grüße,
Carsten
@Carsten, Holger,
Tolle Erweiterungen schreibt ihr da. Ich Drucke es auch mal aus so das es nicht verloren gehen wird.
Den 'Maunsbach' wovon Carsten spricht ist ein sehr schönes Buch und kann ich jeden der was in Histologie macht und was mehr von z.B. Fixierungen wissen möchte, sehr empfehlen.
Von Saccharose Zusatz wird auch da gesprochen nur bin ich zur zeit nicht zu Hause so kann es nicht aufsuchen.
In meine Fixierung habe ich es nicht gebraucht weil ich nicht zufiel zugleich machen möchte. Ich möchte ja gerne Unterschiede lernen und sehen und Ratten haben die noch mehr wie genug.
Die Osmierte Gewebeteile habe ich selbstverständlich sehr klein gehalten und 12 Stunden Kalt (Kühlschrank) Immersion nachfixiert.
Die Teile die nicht Osmiert sondern nur FA/GA Fixiert sind kommen aber von die gleiche Niere, Leber usw.
Grusse Ronald
Gern geschehen, Ronald.
Deine Fortschritte und Ergebnisse sind mehr als Lohn für unsere Anmerkungen :)
Ich weis nicht ob Dir das folgende Buch schon empfohlen wurde, aber es enthält viele Hinweise zur Fixierung von Feingeweben für's EM,
und ist damit auch für Deine feingeweblichen Untersuchungen an Semis hochinteressant.
Es zeigt auch anhand von EM-Bildern die Effekte und Pros&Cons der verschiedenen Fixative auf Membranen, Ribosomen, DNS etc.
Ich lese gerne darin.
Herzliche Grüsse
Holger
http://www.amazon.de/Electron-Microscopy-Principles-Techniques-Biologists/dp/0763701920
@Holger,
Das Buch sieht gut aus nur denke ich das vorläufig mein 'Maunsbach' reicht. Membranen und Ribosomen geht für die LM denke ich schon was zu weit, ich werde schon so froh sein das ich mal gut Fixierte grossere Mitochondrien in z.B. die Proximalen Tubules in die Niere sehen könnte.
Wohl habe ich schon gehört das im Semibereich mein 63x NA 1.4 planapo richtig wertvoll sein wird. Das glaube ich auch gerne weil ich es jetzt schon ein Topp-Objektiv finde.
Grusse Ronald
Lieber Ronald,
Glückwunsch zu diesen überaus gelungenen Schnitten, deren Bilder ich nach Rückkehr aus meinem Urlaub genieße. Im Urlaub hatte ich mich gerade mit der Neuroglia beschäftigt: da kommen Deine Präparate genau zur rechten Zeit. Und schönen Dank auch für die liebevolle Zusammenstellung der Erläuterungen!
Schöne Grüße
Jürgen
Jürgen,
Danke, es freut mich immer wenn Theorie und/oder Bilder richtig genutzt werden. Dazu ist es ja auch gedacht, auch um eine Diskussion zu starten so das 'wir' alle was lernen können.
Hoffe das ich zukünftig mit den Semidunn Technik noch mehr Details bekommen kann.
Grusse Ronald
Lieber Ronald,
ja - klar kannst Du Mitochondrien in den Nierentubuli sehen, wenn Du so toll fixierst, dünn schneidest und mit deinem Leitz PL APO 63/1.4 fotografierst.
Ich möchte entsprechende Beispiele der Form halber nicht hier in Deinem schönen Thread posten, mache aber einen anderen Beitrag auf, wo Du siehst, dass dies möglich ist.
Ich bin wie immer auf Deine Ergebnisse gespannt.
Gruss
Holger