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Bibliothek => Methoden => Histologie => Thema gestartet von: bbb am November 14, 2013, 22:19:32 Nachmittag

Titel: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: bbb am November 14, 2013, 22:19:32 Nachmittag
Hallo Forumsmitglieder und vorallem natürlich Histologie-Interessierte, :)
mittels der NASDCL-Esterase (Naphtol-AS-D-Chloracetat-Esterase) können neutrophile Granulozyten kenntlich gemacht werden.
Ab dem Stadium des Promyelozyten reagieren sie positiv.
Die stärkste Anfärbung besteht im Promyelozyten-Myelozyten-Stadium, bei den Stab- und Segmentkernigen fällt die Reaktion schwächer aus.
Das Gewebe sollte in Formalin (FA) oder Paraformaldehyd (PFA) fixiert werden.

Reagenzien:
Enzym-Lösung:
8 Tropfen 4%-ige methanolische Parrosanilin-Lösung zu 8 Tropfen 4%-iger wässriger Natriumnitrit-Lösung geben und 1min. reagieren lassen (Lösung wird gelblich).
80ml Phosphat-Puffer pH7.0 zugeben
20mg Naphtol-AS-D-Chloracetat in 2ml Dimethylsulfoxid lösen und zugeben
kräftig schütteln!
Filtrieren --> Fertig
Die Enzym-Lösung ist nur ca. 60min. stabil und muss daher immer frisch hergestellt werden!

Hämalaun nach Mayer
(Herstellung siehe hier: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=17948.0
 
Durchführung:
- Schnitte entparaffinieren und in Phosphatpuffer pH7.0 bringen
- Schnitte in Enzym-Lösung stellen für 30min.
- Schnitte in Leitungswasser spülen
- Kernfärbung mit Hämalaun nach Mayer für 5min.
- Schnitte in kaltem Leitungswasser spülen
- bläuen in warmen Leitungswasser für 15min.
- aufsteigende Alkoholreihe, Xylol und Eindecken

Färbeergebnis:
Kerne - blau
neutrophile Granulozyten - leuchtend rot

Das Gewebe ist in Paraformaldehyd fixiert und über Ethanol und Decalin in Paraplast Xtra-plus eingebettet.
Die Schnitte sind alle 1.5 bis 2µm dick.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_32087448.jpg)
Milz - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_46384920.jpg)
Milz - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_38520475.jpg)
Milz - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_15971462.jpg)
Milz - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_54073212.jpg)
Wirbelkörper (blutbildendes Knochenmark) - Mensch
entkalkt mit Na-EDTA
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_54551790.jpg)
Skelettmuskel - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_5150343.jpg)
Lunge - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_56344983.jpg)
Lunge - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_4389596.jpg)
Lunge - Ratte
200fach Vergrößert

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_28197333.jpg)
Lunge - Ratte
300fach Vergrößert

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_36668392.jpg)
Pankreas (Ductus pancreaticus) - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_14553232.jpg)
Leber (links Nekrose) - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_1598697.jpg)
Leber (Periportalfeld/Glisson Trias) - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_59151805.jpg)
Leber (Periportalfeld/Glisson Trias) - Ratte
100fach Vergrößert

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_41133165.jpg)
Leber - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_45532131.jpg)
Herzmuskel quer geschnitten - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_6967251.jpg)
Herzmuskel längs geschnitten - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_56461718.jpg)
Duodenum - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_8708808.jpg)
Duodenum - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_53790462.jpg)
Duodenum längs geschnitten - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_44090058.jpg)
Duodenum quer geschnitten - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_20719440.jpg)
Ileum - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_28421800.jpg)
Colon - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_44973651.jpg)
Colon - Ratte
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(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures004/138140_53412351.jpg)
braunes Fettgewebe (im Bereich der Nieren) - Ratte
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Heute mal ein paar mehr Bilder.
Ich Scanne jetzt immer mit einem speziellen Scanner für Objektträger die Schnitte ein und mache dann aus den Scans Fotos.

Viel Spass beim anschauen !!!
:)


Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: Ronald Schulte am November 15, 2013, 12:02:54 Nachmittag
Max,

Eine sehr Interessante Nachweiß nur frage ich mich was denn genau nachgewiesen wird!
Zitat
Die stärkste Anfärbung besteht im Promyelozyten-Myelozyten-Stadium, bei den Stab- und Segmentkernigen fällt die Reaktion schwächer aus.

Welches Enzym ist in die Promyelozyten-Myelozyten-Stadium Stärker nachweisbar wie in die Stab- und Segmentkernigen Stadium und warum ist das so?

Grüße Ronald
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: bbb am November 15, 2013, 21:19:26 Nachmittag
Hallo Ronald,
ja da habe ich wohl vergessen etwas mit hin zu schreiben.

Also es wird das Enzym Naphthol-AS-D-Chloroacetat (spezifische neutrophilen Esterase) nachgewiesen, dieses ist ein spezifisch in neutrophilen Granulozyten vorkommendes Enzym.
Es kann auch in Monozyten und anderen Granulozyten nachgewiesen werden, ist dort allerdings kaum bis schwach mit dieser Färbung nachzuweisen und nicht spezifisch.

Es ist in dem Stadium der Promyelozyten und Myelozyten stärker nachzuweisen weil in diesem Stadium die neutrophile Granulation ausgebildet wird und durch die Bildung eine besonders starke Enzymaktivität hat.
Die Granulation enthält unter anderem die Enzyme Lysozym, Kollagenase, Laktoferrin, Elastase, Plasminogenaktivatoren, Neuramidase, Cathepsin G und natürlich Esterase.
Wenn die Esterase-Reaktion hoch ist, reagieren auch die anderen Enzyme stark.
Bei manchen Erkrankungen können die Reaktionen auch negativ ausfallen, deis liegt dann an Fehlbildungen im Bereich der Granulation oder hat andere Gründe wie Aminosäure-Fehlbildungen.
Kurz und knapp gesagt ist die Esterase somit ein Marker für die allgemeine Funktion der Granulozyten und für den Nachweiß dieser.
Unter anderem um Infiltrate bei Entzündungen, Leukämien und anderes nachzuweisen. :)

Ich hoffe ich konnte deine Fragen beantworten.
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: reblaus am November 15, 2013, 21:44:06 Nachmittag
Hallo Max -

der Nachweis von Esterase-Aktivität dient ganz allgemein als relativ unspezifischer Vitalitätsnachweis von Zellen.

Bei Pflanzenzellen wird z.B. Fluoreszein-Diacetat als Substrat verwendet. Dieses fluoresziert nicht, ist polar und wird von der Zelle aufgenommen. Wird es aber von Esterasen in Fluoreszein und Essigsäure gespalten, entsteht ein stark gelb fluoreszierender Farbstoff, der von der Zellmembarn zurückgehalten wird und sich in der Zelle ansammelt.

Natürlich sind weder Fluoreszein-Diacetat noch Naphtol-AS-D-Chloracetat die natürlichen Substrate für die Esterasen in den Zellen - oft kennt man deren wirkliche Substrate gar nicht. Insofern müssen natürlich diese cyto-/histochemischen Analysen mit Vorsicht interpretiert werden.

Das einzige was klar zu sein scheint: Wenn unfixiert gefärbte Pflanzenzellen keine Reaktion zeigen sind sie wohl tot. Die tierischen Zellen sind aber schon fixiert und geschnitten, also garantiert tot. Nun überleben die meisten Enzyme diese Prozedur wohl nicht. Wenn einzelne Enzyme, wie hier z.B. die Esterasen dies doch tun sind die Ergebnisse natürlich noch vorsichtiger zu interpretieren.

Nichtsdestotrotz - Glückwunsch zu Deiner histochemischen Arbeit!

Rolf
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: bbb am November 15, 2013, 21:57:35 Nachmittag
Hallo Rolf,
danke!

In diesem Fall wurde es mit Vorsicht genossen, da die Ergebnisse zum einen Immunhistochemisch bestätigt sind und durch ein bestimmtes Interferon-Antikörper-Komplexmedikament welches bei uns in der Forschung zur Testung ist wurden Kreuzreagierende Enzyme "abgeschaltet", sozusagen ein Knock-out bestimmter reaktiver Enzymzentren. :)
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: Florian Stellmacher am November 16, 2013, 19:58:54 Nachmittag
Hallo Max,

zu ergänzen wäre, dass auch Mastzellen CAE-positv reagieren, und ich bin ziemlich sicher, dass etliche Zellen in Deinen Schnitten (z.B im der Dünndarmscheimhaut) tatsächlich Mastzellen und keine neutrophilen Granuozyten sind.

Herzliche Grüße,
Florian
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: bbb am November 16, 2013, 22:29:04 Nachmittag
Hallo Florian,
darauf bezieht sich ja der Enzym-Knock-Out den ich angesprochen habe.
Dabei werden die Enzymvorstufen in bestimmten Zellen wie zum Beispiel in Monozyten Und Mastzellen blockiert.
Daher sind die Zellen die in den Schnitten von mir positiv sind auch nur neutrophile Granulozyten.
Ist ja auch ein Forschungsschwerpunkte bei uns
Titel: Re: Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase
Beitrag von: Florian Stellmacher am November 17, 2013, 03:58:00 Vormittag
Hallo Max,

okay, vielen Dank!

Herzliche Grüße,
Florian