Erstmal ein herzlichen Gruß hier, an alle Freunde der Mikrowelt.
Mit dem, was ich machen möchte (von REM Aufnahmen 3D Objekte und Hologramme herstellen), bin ich hier bei den Lichtmikroskopikern wohl nicht im richtigen Forum aber ich finde kein REM Forum in DE für meine Fragestellung.
Früher habe ich mich in der Holografie und Mikroskopie betätigt und jetzt will ich versuchen, meine jahrzehnte alte Leidenschaft der Mikrowelt mit mit alten (Holografie) und neuen (3D Objekte) Technologien miteinander zu verheiraten.
Meine aktuelle Schwierigkeit ist es, das "Kleingetier" vor / nach der Präparation für die REM Ablichtung lebensecht in Pose zu bringen. Ich habe mir zwei Schrittmotorgetriebene Mikromanipulatoren gebaut, mit den ich unter der Stereolupe die Beinchen / Flügel aus der angezogenen Position in eine natürliche Stellung bringe und dann mit einem UV-Kleber fixiere. Im Prinzip funktioniert dieses aber die Beinchen meiner Probanden brechen nach der chem. Fixierung (GA, OsO4) und Entwässerung (Alk., HMDS) oft dabei ab.
Um hier keinen mit Details zu langweilen mache ich es kurz und warte erstmal die Resonanz hier ab, ob ich hier mit meinen exotischen Fragestellungen überhaupt richtig bin.
Ach ja, noch eines, ich bin eher an der Ästhetik des Kleinen interessiert, als an der wissenschaftlich exakten Bestimmung der Spezies. Hier einige Beispiele dessen, was ich meine.
Ein ca. 200µ langes "Tierchen" aus dem Waldboden, was von mir wegen der Benzolringstruktur auf seiner Oberfläche unwissenschaftlich "Polyphenylkäfer ;) " getauft wurde.
LG
Bernd
480 kx
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/214915_39901840.jpg)
120 kx
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/214915_25362729.jpg)
50 kx
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/214915_33238929.jpg)
Hallo Bernd,
Zitatbin ich hier bei den Lichtmikroskopikern wohl nicht im richtigen Forum
Ganz im Gegenteil ! Hier bist Du goldrichtig
Du warst ja offensichtlich schon vor längerer Zeit mal hier im Forum. Das Forum hat seitdem überhaupt, nicht allein was die technischen Möglichkeiten betrifft, erheblich an Statur gewonnen!
REM-Experten gibt's gleich mehrere: (z.B. wilfried48)
Wenn du schon so lange nicht mehr im Forum warst, lohnt sich gewiss eine "sightseeing"-tour"!
Herzliche Grüße von
Heinrich
Zitat von: bernd552 in Mai 03, 2017, 12:46:05 NACHMITTAGS
"Polyphenylkäfer
Hallo Bernd,
Die Mikroskuptur sieht faszinierend aus. Tolle Aufnahmen! Ist das ein Springschwanz, den Sie da praepariert haben?
Die Praeparation von kleinen Insekten haengt ganz von der Tiergruppe ab. Harthaeutige Insekten (z.B. die meisten Kaefer) werden mit Essigsaeureethylester getoetet (nur so bleiben sie praeparierbar), dann ausgerichtet und langsam an der Luft getrocknet.
Weichhaeutige Insekten erfordern groesseren Aufwand.
Beste Gruesse,
Jon
Hallo Bernd,
ich finde Deine Bilder sehr beeindruckend! So eine Struktur hätte ich an der Oberfläche des Tierchens nicht erwartet. Hast Du eine Komplettansicht des Tiers? dann könnten die Experten es bestimmen. Vermutlich haben verwandte Tierchen ähnlich interessante Strukturen zu bieten.
Zur Umsetzung in 3D-Modelle: Wie sehen Deine Pläne da aus? Ich beschäftige mich gerade mit dem Thema, da wir an der Uni Hamburg ein große Vitrine zum Thema Mikroskopie einrichten, und gerne auch vergrößerte Modelle von Kleinlebewesen dort zeigen würden.
Viele Grüße,
Bob
Hallo Bernd,
tolle Aufnahmen, drängt sich die Frage nach der Funktion der Strukturen auf. Sicher ein Thema für die Bionik.
Gruß,
Michael
Hallo Bernd,
faszinierende Aufnahmen!
Kommt nicht vor der notwendigen Trocknung die übliche Methode der feuchten Kammer mit ein zwei Thymolkristallen in Frage? Dann die Anhänge nach Wunsch ausrichten und dann trocknen?
Schöne Grüsse
Jürgen
Hallo an die Mikrofans hier,
... ich bin sehr angenehm überrascht, das ist ja ein richtig lebendiges Forum hier, .... danke für die positive Resonanz.
Mal der Reihe nach:
@Jon
korrekt, es ist ein Springschwanz. Wegen der interessanten äußeren, filigranen Struktur würde ich weichhäutige Insekten bevorzugen, die gepanzerten Käfer sind von der äußeren, eher glatten Form erstmal nicht in meinem Fokus.
Hier mal die Haut eines anderen Springschwanzes, die im Prinzip ähnlich ist.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/215035_8970811.jpg)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/215035_32258963.jpg)
@Bob
nachdem ich jetzt endlich ein vernünftiges REM habe, ich suche aktuell nach leistungsfähiger Photogrammetrie-Software, die Haare und feine Details in 3D abbilden kann. Bisher habe ich noch leider noch keine geeignete gefunden. Wenn jemand diesbezüglich Tips und Erfahrung hat ... ich würde mich freuen.
Ansonsten bin ich zu allen Schandtaten bereit und nach allen Seiten hin offen, denn mit diesem Thema bin ich hier im Rhein Main Gebiet eher ein Eremit.
@Michael
laut Internet ist der Springkäfer ein Hautatmer und diese Oberflächenstruktur verhindert nach dem Lotusblattprinzip dass die Luft von der Haut durch Wasser verdrängt wird. Sehr wahrscheinlich sind die hochstehenden "C-Atome der Benzolringe" hydrophob und halten das Wasser so auf Abstand.
@Jürgen
Die Thymolvariante kenne ich noch nicht (bin kein Biologe), da werde ich mal recherchieren. Es ist nur bei dem REM wichtig, dass keine Verunreinigungen aus den Proben sublimieren aber da kann ja im Vakuum vorgereinigt werden.
Im letzten Sommer habe ich (per UV-Falle und Absaugung) sehr kleine Fluginsekten gefangen, im Detail siend diese sehr beeindruckend nur als Ganzes waren diese nicht zu gebrauchen da deformiert und / oder in kürzester Zeit - noch im Fangfilter - ausgetrocknet und brüchig waren.
Gibt es evtl. Möglichkeiten, kleine Fluginsekten auf eine Klebefalle zu locken (habe mir eigens dafür einen REM-tauglichen UV-Kleber entwickelt, der sofort nach Belichtung fest wird), diese so in "natürlicher" Pose mechanisch zu fixieren, mit Kältespray (-50°C) schochzugefrieren und dann gefriertrocknen?
Ich mich sehr über Anregungen bezüglich "naturgetreuer" Präparation von visuell ansprechenden Kleintieren interessieren.
Gruß
Bernd
Hallo Bernd,
Ich glaube nicht, dass eine Klebevariante z.B. eine Gelbtafel sinnvoll sein wird, da das Insekt versuchen wird sich loszureißen und sich dabei verkrümmen wird.
Ich würde einmal versuchen, ein gefangenes Tier mit CO2 abzutöten. Das geht sehr schnell und ohne irgendwelches erkennbares Krampfen des Tiers. Auf diese Weise töte ich die Kleininsekten für meine histologischen Zwecke. Das gefangene Tier kommt in einen kleinen Glasbehälter, CO2 hinzu.
Ob das Ergebnis für Dich befriedigend ist, müsstest Du ausprobieren, habe ich nie näher untersucht, weil die Körperhaltung uninteressant ist; bei mir kommt das Tier danach direkt ins Fixans, um dann in Paraffin eingebettet zu werden.
Schöne Grüße
Jürgen
Hallo Bernd!
Wirklich sehr schöne REM-Aufnahmen machst Du! Da das Elektronenmikroskop keine Farben erkennen läßt, ist es egal dass diese beim Konservieren mit Alkohol oft verfälscht werden. Deshalb würde ich das critical point drying empfehlen. Erst wird das Präparat mit Fixiermittel oder Konservierungsmittel total entwässert. ZB Alkohol wird durch unter hohem Druck stehendem, flüssigem CO2 ersetzt und langsam dem normalen Druck angepasst, wobei das CO2 wieder entweicht, das Gewebe aber seine Form behält. Ich denke es ist ein gängiges, gutes wenn auch nicht billiges Präparationsverfahren für die Elektronenmikroskopie.
Es wäre auch für die Auflichtmikroskopie sehr geeignet, wenn nicht die natürliche Farben durch Fixierung sehr leiden würden. Da ist Gefriertrocknung, muß ja nicht die hightech Variante sein, erfolgversprechender. Und als vergleichsweise kostengünstige Variante kann man ja mal versuchen ein Insekt im Kühlschrank zum Schlaf in natürlicher Haltung zB in einer Streichholzschachtel zu überreden, es dann flott tiefgefrieren und wenn die Haltung gefällig ist, es in ein Glas mit trockenen, tiefgefrorenen Silika-Gel-Kügelchen geben und dieses zu vakuumieren, entweder simpel mit einer großen Perfusorspritze und selbst gebastelten klemmbaren Plastikschlauch im Deckel oder besser mit Twist-Off-Gläsern in einer Vakuumglocke. Das Ganze bei Temperaturen idealerweise knapp unter dem Gefrierpunkt zwischen -3 und -6 Grad je nach Objektgröße Tage oder Wochen lagern. Dann sollte man das Glas langsam an die Zimmertemperatur anpassen bevor man es öffnet. Zum Vorschein kommen sollte ein in natürlicher Haltung, Färbung und Gestalt gefriergetrocknetes Präparat.
Die geschilderte Methode habe ich mir die letzten Tage aus der entomologischen Literatur im Netz zusammengesucht um Kleinschmetterlings-Raupen (Motten-Larven) kostengünstig zu präparieren. Hier einige Links:
http://www.mapress.com/zootaxa/2012/f/zt03412p061.pdf
http://britishspiders.org.uk/bulletin/040206.pdf
http://www.natsca.org/sites/default/files/publications-full/Journal%20of%20Biological%20Curation%201_2.pdf
https://archive.org/stream/cbarchive_118842_freezedryingadultmosquitoesfor1983/MS_V15_N1_P050-54_djvu.txt
http://images.peabody.yale.edu/lepsoc/jls/1970s/1972/1972-26(2)68-Dominick.pdf
Erfahrungen habe ich derweilen mit meinem geschilderten Verfahren noch nicht, aber das wird kommen. Vielleicht hat ja der Eine oder Andere noch Einfälle, Tipps oder Kritisches mitzuteilen. Das würde auch mich sehr freuen!
Schöne Grüße aus Wien,
Oli
Hallo Oli,
danke für deine Tips, die klingen sehr plausibel und sind auch einfach umzusetzen ebenso die Links zu den älteren Arbeiten - ich liebe die alte Literatur, da wurde vieles so deutlich und ausführlich beschrieben, dass ein "Nachbau" mit einfachen Mitteln leicht durchzuführen ist -.
Eine Mikrogefriertrocknung mit einem 40x40 mm Peltier dass in Sekunden (einstufig) auf -30°C abkühlt, in einer ebenso kleinen vakuumdichten Plexiglaskammer, ist bei mir aktuell im Bau.
Statt das Wasser an einer Kältefläche auszufrieren ein Adsorptionsmittel einzusetzen, finde ich sehr vereinfachend und trickreich!
Verstehe ich dich richtig, du evakuierst nur einmal und sperrst dem Vakuumschlauch nur ab? Ich kenne die Gefriertrocknung nur mit permanent laufender Vakuumpumpe.
LG
Bernd
Hallo Bernd,
die REM Bilder sind wirklich beeindruckend !
Darf ich raten welches REM es sich Handelt ? Ein Hitachi mit kaltem Feldemitter ?
Zur Gefrier- Präparation kann ich soviel beitragen, dass im TEM Bereich (und in den Vergrösserungsdimensionen befindest du dich mit deiner 430 kx Aufnahme ja locker auch) für den guten Strukturerhalt sehr schnelle Einfriergeschwindigkeiten notwendig sind, damit sich kein kristallines sondern nur amorphes Eis bilden kann. Hierzu friert man in bei -160 grad Celsius gerade noch flüssigem Propan ein und muss bei Temperaturen von kleiner -80 grad Celsius gefriertrocknen, damit das vitrifizierte Eis nicht auskristallisiert. Das wiederum heisst, dass das Vakuum beim Gefriertrocknen deutlich besser als der Dampfdruck des Wassers bei -80 grad sein muss, sonst trocknet ja nichts.
viele Grüsse
Wilfried
Hallo Bernd, hallo Wilfried!
Wahrscheinlich ist das vereinfachte Verfahren von Dominick, 1972 nicht für allerhöchste Auflösung zu gebrauchen aber die Fotos der farblich gut erhaltenen Raupen hat mich begeistert. Und da sein Verfahren mit der Investition in eine Camping-Gefrierbox und Vakuum-Pumpe rel. billig umzusetzen sein sollte, wollte ich es bezugnehmend zur Überschrift des Threads mal erwähnt haben.
Zu Bernds Frage:
Ich habe den Dominick so verstanden, dass bei relativ hoher Temperatur von kurz unter dem Gefrierpunkt es lediglich notwendig ist, mit adäquatem Vakuum das Wasser zu sublimieren und zu einem hohen Prozentsatz an ein Adsorptionsmittel zu binden. Dazu wäre meiner Meinung nach keine permanente Luftbewegung notwendig.
Die Empfehlung Wilfrieds finde ich interessant. Ist die CriticalPoint-Trocknung nicht billiger und im Ergebnis vergleichbar oder gibt es da wesentliche Unterschiede in der Erhaltung von Feinstrukturen?
Schöne Grüße, Oli
Hallo Wilfried, hallo Oli,
@Wilfried
Aus Deiner Fragestellung erkenne ich sofort, Du bist in der REM-Welt "zu Hause", als Erimit ist es schön jemanden zum Fachsimpeln zu kennen!
Nach über 3 Jahren Schrauben an einem 30 Jahre alten CFE Hitachi wollte ich endlich ein stabiles System haben und das ist eine thermische FE von Tescan.
Da ich auf kleine Mengen LN2 sehr schwer bzw. nur kostenintensiv Zugriff habe, habe ich diese Präparationsmethode (erstmal) auf "Eis" gelegt.
Erst will ich ausgiebig testen, in wie weit die durch Eiskristalle geschädigte Zellen mich im makroskopischen überhaupt stören.
@Oli
Ich bin ein großer Freund von einfachen Lösungen, deshalb habe ich schon erste Teste frei nach Dominick gemacht. Bisher sieht es bei gepanzerten Kleintieren ganz gut aus.
Zum richtigen Testen eines für mich geeigneten Gefriertrocknungs-Verfahrens muß ich mir noch ein Objekt suchen, dass beim Trocknen besonders leicht kolabiert.
Nur am Rande, wenn das Objekt "Schockgefroren" ist (ich nehme dazu Kältespray aus der Elektronik -50°C) und sofort auf < 6 mbar evakuiert wird (= Trippelpunkt des Wassers), dann taut das Wasser auch bei Plusgraden nicht mehr auf. Man muß aber permanent Evakuieren.
Bei diesen Panzertieren hat es so halbwegs geklappt
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/215462_48017968.jpg)
Schönen Gruß
Bernd
Zitat von: bernd552 in Mai 14, 2017, 16:38:33 NACHMITTAGS
Erst will ich ausgiebig testen, in wie weit die durch Eiskristalle geschädigte Zellen mich im makroskopischen überhaupt stören.
Hallo Bernd,
im makroskopischen stören sie sicher nicht, ich hatte nur an deine phänomenalen Aufnahmen bei 480 kx facher Vergrösserung
gedacht.
Für eine thermische Feldemissionskathode sind die schon erste Sahne, deshalb habe ich auf ein Hitachi mit kaltem Feldemitter getippt. Mit der Mira 3 von Tescan scheinst du ja über ein sehr gutes Gerät zu verfügen. Hast du sowas etwa zu Hause ?
viele Grüsse
Wilfried
Hallo Wilfried,
Du hast völlig recht, das REM ist ein Hammer - wobei ich nur eine Vergleichsmöglichkeit mit CFE habe.
Ich dachte, so lange meine Augen noch etwas sehen und das, was sie sehen mich noch beglückt, ich auf meine Ersparnisse für später aktuell Strafzinsen zahlen muß (wobei "später" für mich jetzt ist), erfülle ich mir jetzt meinen Lebenstraum..... ja, das Ding steht bei mir zu Hause.
LG
Bernd
Hallo Bernd,
tolle Aufnahmen, mein Glückwunsch. Mit welchem Arbeitsabstand sind die ersten Bilder gemacht?
ZitatIm Prinzip funktioniert dieses aber die Beinchen meiner Probanden brechen nach der chem. Fixierung (GA, OsO4) und Entwässerung (Alk., HMDS) oft dabei ab.
Ich glaube nicht, dass das Abbrechen der Beinchen ein Resultat der Fixierung ist. Ich würde nach der Fixierung und Entwässerung in ein Alkohol/Glyzerin Gemisch gehen, dann die Probe ausrichten und aufkleben und erst danach trocknen.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Hallo Eckhard,
... noch ein REM-Fachmann hier im Forum, das freut mich.
Wegen der starken Proben-Kippung , Platz zur Endlinse (Proben waren auf einen großen Hitachi-Probenteller) und der erwünschten, größeren Tiefenschärfe WD=9 mm bei 5 kV.
Bild als Beispiel: Hier hätte ich gerne noch mehr Tiefeschärfe herausgekitzelt. (Risse in Probe von Trocknung mit HMDS nicht -silizan sondern -siloxan?)
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures007/215506_23415032.jpg)
Sicherlich ist alles noch nicht optimal eingestellt (der REM Fachman bin ich aufgrund Mangel an Übung keinesfalls), deshalb bin ich für alle Tipps sehr dankbar.
LG
Bernd
p.s. ich hoffe die guten "alten" Lichtmikroskopierer hier nicht allzu sehr mit "artfremden" Bildern zu überfrachten...
Hallo Bernd,
es heisst ja Mikroskopie-Forum und nicht Lichtmikroskopie-Forum ;D
Das sieht doch alles gut aus. Oftmals ist eine REM Aufnahme ein Kompromiss. Ich hätte gerne mehr Auflösung, aber dann muss ich eine kleinere Blende wählen. Da ist der Strahlstrom geringer, ich habe ein schwaches Signal und es rauscht mehr. Etc etc. Was wir alle wollen, ist große Blende (viel Signal), großer Arbeitsabstand (hohe Tiefenschärfe), wenig Beschleunigungsspannung (viel Oberflächendetails), schnelle Scanzeit etc etc. Leider verlangt die Physik da einige Kompromisse. Vor dem Hintergrund solltest Du mit den Bildern hoch zufrieden sein.
Herzliche Grüsse
Eckhard
Hallo Eckhard,
.... und nicht zu vergessen der Kampf mit den Aufladungen bei organichen Getier und den Einbrennern bei niedrigen kV.
Danke auch für die positive Rückkopplung.
LG
Bernd
Zitat von: Eckhard in Mai 15, 2017, 10:22:47 VORMITTAG
.... Ich würde nach der Fixierung und Entwässerung in ein Alkohol/Glyzerin Gemisch gehen, dann die Probe ausrichten und aufkleben und erst danach trocknen.
Lieber Eckhard,
das würde ich gerne mal erproben, hast du da ein genaues Rezept ?
Verstehe ich das richtig, dass man nach der Fixierung mit einer Alkoholreihe bis 100% Alkohol entwässert und dann Glyzerin
(wieviel %?) zusetzt und aus diesem Gemisch trocknet. Bleibt das Glyzerin (Dampfdruck bei 20°C < 0,1 Pa) dann in der Probe ?
Oder wird bei Vakuum oder höherer Temperatur getrocknet ? Für das Lichtmikroskop spielen Glyzerinreste sicher keine Rolle, aber in das Vakuum im REM würde ich damit nur ungern gehen wollen.
viele Grüsse
Wilfried
Lieber Wilfried,
Glyzerin macht die Insekten wieder "weich", so das man sie arrangieren kann, ohne das sie kaputt gehen. Das Glyzerin würde ich über Ethanol wieder entfernen und dann normal trocknen.
Herzliche Grüße
Eckhard