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Foren => Mikrofoto-Forum => Thema gestartet von: koestlfr am März 21, 2018, 14:46:41 Nachmittag

Titel: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 21, 2018, 14:46:41 Nachmittag
Liebe ForstpathologInnen!

Vorab ein grosses Lob an die Organisatoren und Vortragenden der Kornrade 2018 - tolle Organisation, tolle Beiträge!

Aus dem Lager der Schibbler möchte ich Euch eine Ergänzung zur Kornrade 2018 und zu Jörgs Beitrag über Wollemia nobilis (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?PHPSESSID=20mbkkpv4hslgdo4l64607a302&topic=27181.0) zeigen.

Jörg hat mehrere Pflanzenproben, darunter auch Wollemia nobilis, ausgeteilt, wobei bei meinen Proben der bereits fixierten Blattteile einer mit dunkelbraunen Pusteln war. Jörg hat angeregt, speziell den befallenen Bereich zu schneiden. Die Ergebnisse möchte ich zeigen …

Der Probeschnitt (40µ) war leider im Bereich des Befalls unvollständig, ich habe ihn trotzdem mit W3A gefärbt. Der Schnitt ist im Durchlicht, meiner Meinung nach, nicht aussagekräftig - also Fluoreszenz bei 365nm:

 (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231107_63130991.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemia_n_10_w3a_36500o6l.jpg)

Bild 1 Färbung mit W3A
Aufnahmedaten: Olympus BX51, U-PlanSApo 10x, LED 365nm; U-MWU2; Pentax K3.

In der Fluoreszenzaufnahme des mit W3A gefärbten Schnittes kann ich zwar eine Demarkation erkennen, aber ich kann keine Ursache – weder Hyphen noch sonstige Befallsindizien- ausmachen!

Deshalb habe ich den Pflanzenteil mit PEG infiltriert und nach ca. 48h gegen die Beule ziehend (40µ) geschnitten. An den Schnitten habe ich zwei Färbungen versucht:

 (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231107_22322349.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemie_n_10_365_safmvstv.jpg)

Bild 2 Färbung mit Auramin/Safranin; Aufnahmedaten: wie Bild 1 jedoch mit HBO-Lampe

 (https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231107_64981649.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemie_n_10_365_cormbsme.jpg)

Bild 3 Färbung mit Coriphosphin O/Uvitex 2B; Aufnahmedaten: wie Bild 1 jedoch auch mit HBO-Lampe

Meine Fragen ans Forum:

-   Ist es, so wie ich vermute aber nicht nachweisen kann, ein Pilz?
-   Wie hätte ich vorgehen sollen?
-   Was könnte es sonst sein?
-   Wie könnte ich diesen Schädling nachweisen? Ich habe allerdings kein Frischmaterial.
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: reblaus am März 21, 2018, 16:48:35 Nachmittag
Hallo Franz -

wie sieht denn das gefärbte Präparat in normalem Durchlicht aus, ist die Stelle an welcher die Blaufluoreszenz auftritt gefärbt?
Du hast UV-Fluoreszenz zur Verfügung - das ist günstig, weil du dadurch manche Abwehrstoffe, welche die Pflanze gegen Pilze bildet als Blaufluoreszenz sichtbar machen kannst. werden. In diesem Fall würde aber die Fluoreszenz der W3A-Farbstoffe nur stören. Wenn du also noch ungefärbte Schnitte hast, schau mal ob die blaue Fluoreszenz (ist das die "Demarkationslinie"?) auch ohne Färbung auftritt, dann würde es interessant!

Viele Grüße

Rolf
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 21, 2018, 18:08:17 Nachmittag
Hallo Rolf!

Herzlichen Dank für die Anregung! Ich habe ein Schnippel mit Wasser eingedeckt und sowohl Hellfeld wie Fluoreszenz bei 365nm mit 20x gemacht:

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231115_21855962.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemie_n_20_hf_unge5gsoe.jpg)

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231115_43994237.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemie_n_20_365_ungqpsb4.jpg)

Die Demarkationslinie ist wieder blau ... die Pflanzenteile sind fixiert!?
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Klaus Herrmann am März 21, 2018, 20:09:55 Nachmittag
Hallo Franz,

tolle Aufnahmen! Eine Frage Ist das Coryphosphin für rot grün und das Uvitex für blau zuständig?

Hast du eine Beschreibung der Färbung?
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: reblaus am März 21, 2018, 21:32:13 Nachmittag
Hallo Franz -

die letzten Fotos also von ungefärbtem Material? Dann ist es so wie ich vermutet habe! Es handelt sich um Metaboliten, die von der Pflanzenzelle in die Zellwände eingebaut werden um einen Pilzbefall am Fortschreiten zu hindern. Der Blaufluoreszenz nach könnte es sich um Stilbene handeln. Der Chemismus ist verwandt mit der Ligninsynthese in Holzteilen.
Nach Pilzhyphen brauchst du nicht zu suchen, es ist eine Wissenschaft für sich, solche in abgestorbenem Gewebe sichtbar zu machen.
Lies mal in Wikipedia unter "Stilben" und "Resveratrol" nach. Du musst aber nicht alles glauben, was über dessen wundertätige Wirkung geschrieben wird: Als wir vor 40 Jahre die Resveratrolproduktion in Weinreben nach Pilzbefall bzw. UV-Stress auf einen Kongress zeigten, wurden wir von besorgten Zuhörern gefragt, ob wir das alles auch toxikologisch hätten untersuchen lassen ... Nachdem sich aber herausgestellt hatte, dass Resveratrol besonders in den Beerenschalen der Rotweinsorten vorkommt, wurde das sofort begierig Marketingleuten und Gesundheitsaposteln ohne weitere Bedenken ausgeschlachtet.

Viele Grüße

Rolf
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 22, 2018, 06:29:16 Vormittag
Hallo Rolf!

Herzlichen Dank für Deine ausführliche Antwort!

Ja, die beiden letzten Bilder sind fixiertes, ungefärbtes Material. Schade, dass die Reste des Pilzes so schwer sichtbar zu machen sind. Das befallene Material wirkt schon wie in Zersetzung begriffen,

Hallo Klaus!

Danke für das Kompliment.

Die Färbung war, so meine ich mich zu erinnern, in einem Büchlein von Reichert über die Fluoreszenzmikroskopie.
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: anne am März 22, 2018, 08:19:26 Vormittag
Hallo Franz,
unabhängig vom fachlichen Hintergrund, finde ich das 3.Bild sagenhaft!!

lg
anne
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 22, 2018, 08:44:23 Vormittag
Hallo Anne,

danke für das Lob!

Die Kombination der Fluoreszenzfarbstoffe ist recht plakativ ...
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Fahrenheit am März 22, 2018, 10:25:11 Vormittag
Lieber Franz,

Du könntest eine ungefärbten schnitt mit Chloralhydrat bleichen und dan mit Baumwollblau färben.
Da die Hyphen in aller regle nicht so nett sind parallel zur schnittebene zu verlaufen, sollte der schnitt etwas dicker sein - zwischen 100 und 150µ.

Da müsstes Du zumindest am Rand der befallenen Stellen kräftig blau gefärbte Hyphenstückchen finden.

Die Fluoreszenzbilder find eich auch wirklich toll. Fantastische Farben.

Herzliche Grüße
Jörg
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Klaus Herrmann am März 22, 2018, 10:37:53 Vormittag
Vielen Dank Franz,
unter dem Stichwort habe ich nichts gefunden aber hier eine beschreibung, die mich davon abgehalten hat es auch zu versuchen:

https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-015-0096-0
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Horst Wörmann am März 22, 2018, 11:29:20 Vormittag
Lieber Franz,

Uvitec bei Pilzhyphen ist immer einen Versuch wert!
Entschuldige, wenn ich Deinen Thread kapere, aber hier sind Bilder, die die Uvitex-gefärbten Hyphen meiner Ansicht sehr schön zeigen:

Querschnitt einer Pflanzengalle, einer "Ambrosia-Galle" mit Pilzbewuchs in der Larvenkammer. Rechts Reste der Larve, deren Chitin ebenfalls mit Uvitex angefärbt wird, dann die mit Piklzhyphen durchzogene Innenwand, und anschließend der Gallenkörper.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231149_64923656.jpg) (https://www.pic-upload.de)

Deteil der Innenwand: Hyphen nicht eindeutig erkennbar.
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231149_44624228.jpg) (https://www.pic-upload.de)

Hier dieselbe Stelle im UV bei 365-nm-Anregung:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231149_17654054.jpg) (https://www.pic-upload.de)

Paraffineinbettung, Mikrotomschnitte ca. 8 µm, Färbung Uvitex und Eindeckung in DePeX (ist nicht fluoreszierend!).

Viele Grüße
Horst
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: reblaus am März 22, 2018, 11:40:16 Vormittag
Hallo Franz -

ich erfreue mich zwar auch immer an der Farbenpracht der Farbstoff-Fluoreszenz bei gefärbten Schnitten, Begeisterung bricht aber - dank meiner déformation professionelle - erst aus, wenn uns die Fluoreszenz zusätzliche Erkenntnisse bringt , und das ist bei Deinen letzten beiden Bildern der Fall! Solch knackige "Auto"fluoreszenz kriegt man selten.
Kannst Du noch nähere Angaben zu den Filtern machen?

Viele Grüße

Rolf

Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 22, 2018, 13:54:02 Nachmittag
Lieber Jörg!

Danke, diesen Versuch kann ich am Wochenende nachliefern - diese Schnittdicke sollte kein Problem darstellen! Ich hoffe ich habe noch genug befallene Stellen.

Hallo Klaus!

Danke für den Link, werde ich studieren ...

Lieber Horst!

Danke für Deine anschauliche Ergänzung!

Ich habe mit Histokitt eingedeckt, das hat auch keine Eigenfluoreszenz, aber manche Farbstoffe gehen geringfügig in Lösung und dann kommt es zu leichten Säumen.

PS: ich sollte für manche Problemstellungen auch mit Paraffin infiltrieren und unter 10µ schneiden.

Hallo Rolf!

Die Diskussionen um Fluoreszenzbilder kenne ich gut, bin aber der Meinung, dass man bei 365nm sehr oft gute zusätzliche "Verdeutlichungen" bekommt.

Der Filterwürfel ist der U-MWU2 von Olympus mit:

Excitation filter   Emission filter   Dichromatic mirror
330-385nm       420nm                   400nm

PS: in dieser Situation ist der Chip der K3 "mit ohne" Tiefpassfilter wirklich auch hilfreich!
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Rolf-Dieter Müller am März 22, 2018, 14:28:04 Nachmittag
Hallo Franz,

ein spannender Beitrag mit hochinteressanten Erläuterungen, Ergänzungen und sehr schönen Bildern, wobei mich ebenfalls und besonders die Primärfluoreszenz anspricht.

Bisher dachte ich mit Blauanregung auskommen zu können, aber UV-Anregung gibt ja auch einiges her.

Viele Grüße,
Rolf-Dieter
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 22, 2018, 15:23:36 Nachmittag
Hallo Rolf-Dieter!

Danke für das Lob!

Für Autofluoreszenz sollte man unter 400nm gehen, besonders schön bei Lebendschnitten.

Wie könnte es in der Werbung heissen: ist ja nur ein Würfel ... (und ev. eine LED ...)
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 29, 2018, 17:10:58 Nachmittag
Lieber Jörg!

Wie Du empfohlen hast, habe ich fixierte Schnitte 4,5 Tage in Chloralhydrat versucht zu bleichen - vergebens! Der Vorteil ist jedoch, das Baumwollblau greift besser.

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231557_42815147.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemia_10_bwb_hf_01mzo20.jpg)

Bilddaten: Blatt quer 40µm, Baumwollblau, Olympus BX51, U-PlanSApo 10x, Hellfeld, Pentax K3.

Ich habe das Bild dennoch eingestellt, weil ich finde es zeigt, wie die Pflanze versucht den Pilz auszuschliessen - besser sieht man das allerdings bei Fluoreszenz ...

(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures009/231557_47633461.jpg) (http://abload.de/image.php?img=wollemia_10_primulin_1go41.jpg)

Bilddaten: Blatt quer 40µm, Primulin 1/1000, Olympus BX51, U-PlanSApo 10x, LED 365nm; U-MWU2; Pentax K3.

Resignierendes Resümee: es ist mir nicht gelungen, den Pilz an sich sichtbar zu machen, ich konnte nur nur seine zerstörenden Auswirkungen darstellen.
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: reblaus am März 29, 2018, 18:36:39 Nachmittag
Hallo Franz -

lass Dich nicht entmutigen - das tolle Foto dieser Barrage-Zone war den Aufwand wert!
Meine wenig optimistische Voraussage betr. Pilzhyphen beruhte auf Erfahrungen, die ich im Laufe einiger hauptberuflichen Jahre mit diversen Holz- und Mehltaupilzen gemacht habe und die heute entsprechend veraltet sind. Aber in 10 Jahren Forumslektüre habe ich oft gesehen, dass engagierte Liebhaber im Stande der Unschuld viel bessere Ergebnisse erzielten, als "Experten" deren "angebor'ne Farbe der Entschließung von des Gedankens Blässe angekränkelt" war.

Viele Grüße

Rolf
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 29, 2018, 18:43:01 Nachmittag
Hallo Rolf!

Herzlichen Dank für die aufmunternden Worte - ich war in dem Glauben, den Pilz ähnlich einfach darstellen zu können, wie z.B. Braunfäule in Fichte. Das sind halt andere Dimensionen ...
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: reblaus am März 29, 2018, 20:36:10 Nachmittag
Hallo Franz -

wenn man bedenkt, wie heterogen das "Pilzreich" ist und wie verschiedenartig seine Bewohner aufgebaut sind, wundert es nicht, dass diese Hyphenfärbungen manchmal gut funktionieren und manchmal überhaupt nicht. Und gerade in der Kampfzone wo sich eine höhere Pflanze mit "Abwehrstoffen" gegen einen parasitischen Pilz wehrt, laufen sehr komplexe chemische Reaktionen ab, wobei die Beträge der beiden Kontrahenten zu diesem Chaos nicht immer gut zu trennen sind. Bei saprophytischen Pilzen ist es übersichtlicher, weil das tote Pflanzenmaterial keinen eigenen Metabolismus  liefert.

Viele Grüße

Rolf
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 29, 2018, 20:48:51 Nachmittag
Hallo Rolf,

danke für die anschauliche Erklärung!

Ich kann mir auch vorstellen, dass man mit Fluoreszenz an Lebendschnitten bessere Ergebnisse erzielen kann.
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Klaus Herrmann am März 29, 2018, 21:11:01 Nachmittag
Hallo Franz,

Zitat
Resignierendes Resümee: es ist mir nicht gelungen, den Pilz an sich sichtbar zu machen, ich konnte nur nur seine zerstörenden Auswirkungen darstellen.

Dafür sind dir aber traumhaft schöne Aufnahmen gelungen! Kannst du bitte das Färbeprotokoll der Primulin-Färbung angeben und die Rezeptur für die Farbstofflösung?

Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am März 29, 2018, 21:19:28 Nachmittag
Hallo Klaus!

Danke für das Lob!

Das Färbeprotokoll ist sehr einfach: Primulin ca. 2min einwirken lassen, dann wie bei W3Asim ... letzte Stufe ein Tropfen TEP, ich decke mit Histokitt ein.

Die Lösung wird mit 1:1000 empfohlen ...
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: hebi19 am April 12, 2018, 22:05:02 Nachmittag
Glückwunsch zum Foto des Monats !!!

Auch ich bin von "wissenschaftlichen, emotionalen, färbetechnischen und künstlerischen" Bildinhalt beeindruckt. Aus der rundum interessanten Dokumentation hat die Jury ein tolles Bild ausgewählt.

Martin
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am April 13, 2018, 09:10:11 Vormittag
Hallo Jury!

Herzlichen Dank für die Nominierung!

Hallo Martin,

sehr nette Worte! Danke!
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: A. Büschlen am April 13, 2018, 11:32:04 Vormittag
Lieber Franz,

das freut mich für dich. Herzlichen Glückwunsch zum Bild des Monats!

Gruss Arnold
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: Herbert Dietrich am April 13, 2018, 11:39:46 Vormittag
Glückwunsch

zum schönen Bild des Monats.

Herzliche Grüße

Herbert
Titel: Re: Wollemie - ein pathologischer Versuch
Beitrag von: koestlfr am April 13, 2018, 16:59:27 Nachmittag
Lieber Arnold!

Herzlichen Dank! Meine Sujets sind nicht so zart und duftig wie Deine ...

Hallo Herbert,

besten Dank!