Hallo,
nun habe ich das Equipment komplett, um auch im UV-Bereich Fluoreszenz-Versuche durchführen zu können. Über meine Experimente mit Blauanregung hatte ich ja schon berichtet (Erste Versuche mit Fluoreszenz (Blauanregung) (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40461.msg298259#msg298259).
Der UV-LED-Einsatz für den Zeiss Fluoreszenz-Auflichtkondensor an meinem Standard 18 stammt wieder von Stephan Hiller und basiert auf einer Nichia NVSU233B mit 365 nm.
Eine Herausforderung ist, mit den Gefahren, die sich durch den Umgang mit UV-Licht ergeben, möglichst stressfrei umgehen zu können. Wir hatten das Thema ja schon an anderer Stelle diskutiert. Ursprünglich wollte ich Plexiglasstücke so an bringen, dass kein Streulicht oder Reflexionen ins Auge gelangen kann. Das erschien mir aber recht aufwendig, da der Auflichtkondensor IV FL doch aus allen Ritzen strahlt. Dazu dann das Licht, das vom Objektträger reflektiert wird. Also habe ich wieder meine UV-Schutzbrille aufgesetzt, die aber mit meiner Computerbrille nicht kooperieren wollte. Jetzt habe ich eine spezielle Überbrille gefunden, die sowohl der DIN EN 166 wie auch der DIN EN 170 entspricht und perfekt über meine Computerbrille passt.
Falls Interesse, das Teil heißt Uvex Super F OTG Schutzbrille (https://www.uvex-safety.com/de/produkte/schutzbrillen/buegelbrille-uvex-super-f-otg/). Die Brille findet man schnell bei allen möglichen Händlern. Trotzdem werde ich noch ein paar Abschirmungsmaßnahmen treffen.
Nun zu den ersten Versuchen:
Ich habe mal mit Micromounts angefangen, weil ich die noch von vorherigen Aufnahmen liegen hatte.
Bild 1: Rubin, wobei auch das umgebende Mineral schön fluoresziert. Kann ich aber nicht sicher zuordnen. Bildbreite=3,2 mm
Bild 2: Nadelige Kristalle von Aragonit. Bildbreite=1,75 mm
Bild 3: Autofluoreszenz von Moosblättern. Bildbreite=1,1 mm
Bild 4: Moosblätter, gefärbt mit Acridinorange. Soweit ich weiß, wird AO eher für Anregungswellenlängen um 500 nm eingesetzt wird. Also nicht für 365 nm. Aber für einen ersten Versuch sollte das mal gehen. Bildbreite=1,1mm
Fortsetzung folgt!
Beste Grüße
Michael
Hallo Michael
Das Bild des Moosblättchen finde ich richtig gut. Ist das Autofluoreszenz oder ein gefärbtes Präparat, das Rot geht ja in diese Richtung, aber die anderen Farben ...
Einfach spannend 🧐
Liebe Grüße
Gerhard
Hallo Gerhard,
das erste Bild der Moosblättchen zeigt Autofluoreszenz, das zweite ist gefärbt. Ich habe dazu Acridinorange verwendet (10µg/ml), 30 min gefärbt, dann mit Wasser gespült. Allerdings habe ich so gut wie keine Erfahrung mit Färbungen, es ist also einfach nur ein Versuch, zumal Acridinorange wohl nicht für UV vorgesehen ist. Allerdings sind, speziell für Färbungen für Fluoreszenz auch nicht so viel Infos zu finden. Im Forum mal hier und dort etwas, aber ansonsten sehe ich nur reichlich Informationen für Profis, die sich mit meinen Amateurmitteln kaum realisieren lassen. Andererseits will ich ja keine Wissenschaft betreiben. Ganz informativ ist allerdings die Übersicht auf der Seite der http://www.mikrohamburg.de/ (http://www.mikrohamburg.de/), unter Goodies.
Mit Fluorescein und Wacker ASim III werde ich dann weitere Versuche machen.
Liebe Grüße
Michael
Bild von dem Moos, das mir die Blättchen zur Verfügung stellt. :)
Hallo Michael,
das 4. Bild könntest du für die neuen Avatar-Fortsezungen einreichen, dann aber in 3D ;)
LG
Bernd
Hallo Bernd,
mache ich doch sofort. Falls mal die Anfrage kommt...
LG
Michael
Hallo zusammen,
ich merke immer mehr, dass das Fotografieren bei Fluoreszenz doch etwas anderes ist, als ich das, was ich sonst gewöhnt bin. Generell stacke ich die meisten Aufnahmen, nur gelegentlich mache ich Schnappschüsse zu Testzwecken oder für mich zur Dokumentation.
Das Hauptproblem ist die, oft vergleichsweise geringe, Lichtausbeute. Das hängt natürlich sehr vom Objekt ab, aber auch von den Fluorochromen, wenn welche zum Einsatz kommen. Natürlich auch vom verwendeten Objektiv.
Ich stacke mit der EOS 750D und steure diese über Helicon Remote. Dort gibt es in den Grundeinstellungen einen Punkt ,,Live View Helligkeit erhöhen". Das geht bis +5EV! Das Live-View-Bild ist dann ordentlich verrauscht, aber immer noch besser als nix!
Die Belichtungszeiten der Aufnahmen, die ich in den letzten Tagen gemacht habe, lagen zwischen 1/20 s (Einsatz von Fluoreszenzfarbstoff) und 6 s bei schwach leuchtenden Kristallen, die ISO-Werte zwischen 100 und 800. Da spielt das Fremdlicht eine entscheidende Rolle, auch von den Bildschirmen in der Nähe. Ich mache bei gedämpftem Licht im Raum immer zuerst eine Probeaufnahme, dabei ist das Auflicht vom Mikroskop ausgeschaltet. Im Idealfall ist das Bild völlig schwarz. Was dann noch ,,unter der Grasnarbe" aufgenommen wird, kann man wohl ignorieren. Unter Umständen muss man das Fremdlicht gezielt abschirmen.
Speziell bei Micromounts stellt sich das Problem, für das Stacken den Start- und Endpunkt richtig festzulegen. Nach einigen Versuchen und Tappen im Dunkeln, habe ich mich dann entschlossen, eine meiner guten alten Schwedenfackeln wieder herauszuholen und nutze diese nun als Einstell-Licht. Geht super. Aber auch nur als Orientierung, denn das Leuchten kommt ja oft von anderen Stellen, als von denen, die man gut im sichtbaren Bereich erkennt.
Da wird schnell ein kleiner Bereich, am Rand oder eine Vertiefung im Objekt, übersehen, der dann im Nachhinein unscharf ist.
Fotografiert wird in RAW. Das mache ich generell so, nicht nur bei Fluoreszenz. Aber hier sind die Anforderungen an die Nachbearbeitung u. U. deutlich höher, als bei ,,normalen Aufnahmen". Das geht vernünftig nur mit RAW!
Ein weiteres Problem sind Staub und Fusseln jeder Art. Die sind ja immer beim Mikrospieren ein Problem, aber bei Blauanregung oder UV leuchten diese zum Teil um Größenordnungen heller, als das eigentliche Objekt. Könnte man eigentlich auch als Einstell-Licht nutzen (Späßle!).
Dann sind da noch die Objektive, die nur zum Teil für UV-Licht geeignet sind...
Fluoreszierende Grüße
Michael
Hier noch zwei Bilder von Moosblättchen, gefärbt mit WASim III.
WASim III ist für diese Art von Präparaten sicher nicht besonders sinnvoll. Aber es geht ja um Versuche und Erfahrungen sammeln.
Weiß jemand, welches Moos das ist? Eventuell Ufermoos?
Bild 1: Bildbreite= 1,75 mm
Bild 2: Bildbreite= 0,27 mm
Danke ADi für dein Lob!
Hier noch ein Bild von Hefezellen. Das ist Frischhefe aus dem Kühlregal, gefärbt mit Acridinorange. Bildbreite 0,15 mm, Einzelbild.
Ich vermute, dass die grünen Zellen leben, während die orangefarbenen abgestorben sind. Bin mir aber mit dieser Interpretation nicht sicher.
Grüße
Michael
Noch ein bisschen Hefe...
Das erste Bild ist aus dem vorherigen Präparat entstanden, nachdem es über Nacht eingetrocknet ist.
Die nächsten beiden Aufnahmen zeigen ebenfalls die Hefezellen, gefärbt mit "Optical Brightener". Das zweite Bild wieder eingetrocknet.
Bildbreite ca. 0,15 mm, nicht gestackt.
Viel Spaß beim Anschauen!
Michael
...und noch eine Detailaufnahme von meinem Moospölsterchen. Ich weiß jetzt immer noch nicht, wie das Moos heißt.
Bildbreite 0,3 mm, gefärbt mit Optical Brightener.
Viele Grüße
Michael
Hallo Michael,
in welcher Konzentration hast Du den denn eingesetzt? Eigentlich sollte der keine Pflanzenzellen färben. Oder gehört das Objekt gar nicht zum Moos und steckt da nur drin? Oder ist das Moos schon verpilzt? ;D
Carsten
Hallo Michael,
der Einwand
ZitatOder gehört das Objekt gar nicht zum Moos und steckt da nur drin? Oder ist das Moos schone verpilzt?
von Carsten ist berechtigt.
Kannst du das Objekt ohne Färbung und Fluoreszenz zeigen?
Gruss Arnold
Hallo Michael,
ganz hervorragende Bilder in technisch und handwerklich höchster Qualität. Die Bilder würde sich sicher toll an der Wand machen!
Grüße,
Simon
Zitat von: witweb in April 24, 2021, 17:55:57 NACHMITTAGS
ich merke immer mehr, dass das Fotografieren bei Fluoreszenz doch etwas anderes ist, als ich das, was ich sonst gewöhnt bin. Generell stacke ich die meisten Aufnahmen, nur gelegentlich mache ich Schnappschüsse zu Testzwecken oder für mich zur Dokumentation.
Ja, Fluoreszenz-Bilder sind was ganz anderes, was die Herausforderung angeht.
In der Forschung kommt nicht umsonst spezielle Ausrüstung zum Einsatz.
Was das Stacken angeht, wird ein z-Stack über eine motorisierte Steuereung angelegt. So ein Stack braucht, je nach Einstellung locker mal 6-10 Minuten.
Die verwendeten Kameras sind üblicherweise extra auf Fluoreszenz-Signale abgestimmt.
Idealerweise werden Laser eingesetzt, die durch klar definierte Wellenlängen das Maximum aus dem FL-Signal holen.
Im Hobby-Bereich ist dies kaum umsetzbar, da die Anschaffungskosten ernorm sind und auch die laufenden Kosten. Die Laser müssen regelmäßig ausgetauscht werden und da reden wir über mehrere Tausent Euro....
Optimieren könntest du deine Bilder durch den Einsatz von Fluoreszenz optimierten Objektiven (bei Zeiss Neofluar) und durch den Einsatz eines besseren Bild-Sensors (Vollformat).
Viel mehr kannst du nicht machen, sofern du bereits das reine FL-Signal durch optimale Filter hast. Ansonsten höchsten noch "bessere" Filter nutzen, welche den Wellenlängen-Bereich deines Signals besser definieren.
Ich kann mich dem Rest aber nur anschließen. Die gezeigten Bilder sind qualitativ sehr gut und könntent ohne Probleme in einer Fachpublikation veröffentlicht werden ;)
Grüße,
Tobias
Hallo Carsten, Arnold, Simon und Tobias
zunächst vielen Dank für die positiven und interessanten Rückmeldungen!
@ Tobias – Danke für die Infos! Zum Thema Aufnahmetechnik und Objektive schreibe ich nochmal etwas in einem extra Beitrag.
@ Carsten – Das Objekt gehört schon zum Moos, siehe Bild unten, das einen Ausschnitt aus einem früheren Bild zeigt (allerdings mit Acridinorange gefärbt).
Ich habe meine Versuchen mit dem Optical Brightener aus dem ,,Fluorescent Dye Starter Kit" zunächst mit Hefe begonnen, da du an anderer Stelle mal angemerkt hattest, dass sich der Optical Brightener sehr gut zur Markierung von Pilzzellen eignet. Und Hefe war gerade greifbar...
Dazu habe ich 100µl aus dem Fläschchen des Sets mit 9,9ml Wasser verdünnt. Davon habe ich dann 2 Tropfen zu der Hefesuspension gegeben.
Für das Moos-Foto habe ich ein Stängelchen (ca. 4 mm) auf einer Tüpfelplatte gefärbt, wobei das Verhältnis Wasser zu o.g. Verdünnung etwa 5:1 betrug. Dann gespült.
Das war das Ergebnis einer Reihe von Versuchen, wobei ich zunächst andere Konzentrationen getestet habe.
@ Arnold – Es kann durchaus sein, dass Teile bereits verpilzt waren. Man sieht auch in den anderen Bereichen des Bildes, dass keineswegs das ganze Blatt gefärbt ist.
Du fragst nach dem ,,Objekt ohne Färbung und Fluoreszenz", könntest du daran erkennen, ob das Objekt verpilzt ist?
Beste Grüße
Michael
Hallo Michael,
Zitat@ Arnold – Es kann durchaus sein, dass Teile bereits verpilzt waren. Man sieht auch in den anderen Bereichen des Bildes, dass keineswegs das ganze Blatt gefärbt ist.
Du fragst nach dem ,,Objekt ohne Färbung und Fluoreszenz", könntest du daran erkennen, ob das Objekt verpilzt ist?
Mir geht es nicht darum, ob verpilzt oder nicht verpilzt, sondern was du uns in deinem Bild Moos FL 1 BB zeigst.
Zeige uns ein ganzes Haar im Durchlicht Hellfeld ohne zu stapeln und zeige wo es am Moos wächst.
Gruss Arnold
Hallo Arnold,
wie gewünscht. Durchlicht Hellfeld ohne zu stapeln. Ganz frisch aus der Kamera.
Allerdings musste ich nach diesem "Objekt" schon etwas suchen. Da hatte ich bei den anderen Bildern wohl etwas Glück.
Ich kenne mich mit Moosen überhaupt nicht aus. Dieses kleine Polster habe aber ich schon ein paar Tage in einer Dose liegen. Kann das eventuell auch eine fehlgeleitete Wurzel sein?
Ergänzend kannst du dir vielleicht noch das Bild in #2 anschauen.
Und ich weiß jetzt immer noch nicht, wie das Moos heißt. Wenn du da eine Idee hättest...
Gruß
Michael
Wovon träumt ein Fluoreszenzmikroskop in der Nacht?
Ich glaube, von fremden Welten im ultravioletten Licht einer fernen Sonne.
Als ich vor ein paar Tagen, spätabends, es war schon lange still und dunkel im Arbeitszimmer, nochmal kurz die Mikroskopkamera ausgelöst habe, ist dieser Schnappschuss entstanden...
Wie aus einem Traum.
Viele Grüße
Michael
Ich wollte noch etwas zu Objektiven und zum Filter-Set sagen.
Zu den Objektiven. Natürlich sollte die numerische Apertur möglichst groß sein. Mein 10er und 40er habe ich schon durch NEOFLUARe ersetzt, wobei diese von Zeiss auch für UV empfohlenen wurden.
Das Plan 2,5/0,08 – 160/- scheint für UV überhaupt nicht geeignet zu sein, so dass ich jetzt das Zeiss 3,2/0,07 – 160/- nutze.
Abgesehen davon, dass beide, wie zu erwarten, sehr wenig Licht liefern, fällt das 2,5er bei UV stark ab:
Bild 1: Plan 2,5/0,08 – 160/- Weißlicht, 1/5 s, ISO 100
Bild 2: 3,2/0,07 – 160/- Weißlicht, 1/5 s, ISO 100
Bild 3: Plan 2,5/0,08 – 160/- UV, 2 s, ISO 400
Bild 4: 3,2/0,07 – 160/- UV, 2 s, ISO 400
Das Objekt ist ein Rubin (Micromount), alle Aufnahmen sind nicht gestackt und unbearbeitet.
Ich weiß nicht, ob es ein 2,5er oder 3,2er als NEOFLUAR gibt, ich glaube wohl nicht. Bei Zeiss habe ich da nur das NEOFLUAR 6,3/0,2 (46 03 20) gefunden.
Das 16er und 25er sind bei mir auch noch normale Plan-Objektive, die ich aber noch durch NEOFLUARe ersetzen will.
Zu den Filtern. Für Blauanregung verwende ich das Zeiss Filter-Set 09.
Für UV (365 nm) habe ich, trotz langer Suche (auch hier im Forum), kein Zeiss Filter-Set 02 auftreiben können. Ich habe aber einen Tipp bekommen und bei der Fa. AHF (https://www.ahf.de/) angefragt. Die haben mir dann ein UV-Filtersatz aus verfügbaren Komponenten zusammengestellt. Allerdings hatte Peter (peter-h) schon einen Hinweis auf die mögliche Notwendigkeit eines zusätzliches Filters (z.B. Baader U-Filter) gegeben. Mal sehen, ob ich das bei dem AHF-Filter-Set noch brauche, im Moment bin ich sehr zufrieden.
Beste Grüße
Michael
Zwei Bilder von Dingen, die alle kennen, egal ob Kleinkind oder Greis:
Bild 1: Bleistiftspitzmaschinenspan, Bildbreite 1,1 mm, UV
Bild 2: Bleistiftspitzmaschinenspäne, Bildbreite 4,0 cm, Tageslicht
Bild 3: Spitze eines gelben Textmarkes, Bildbreite 3,2 mm, UV
Natürlich kann man das auch im normalen Auflicht fotografieren, aber ich bin ja noch beim Experimentieren mit UV. Deshalb UV.
Beste Grüße
Michael
Hi,
zweimal weißer Flieder, einmal Bildbreite 3 mm zur Übersicht, einmal etwa 0,5 mm. Beide Aufnahmen trocken und ohne DG.
Die Pollen selbst fluoreszieren nicht oder sehr wenig, jedoch strahlen andere Teile der Blüte dafür umso stärker.
Viele Grüße
Michael
Hallo,
in der Nachbarschaft habe ich einen Strauch entdeckt, dessen Blätter an der Unterseite ein rechtes Geflecht an Sternhaaren haben. Ich habe mal ein Bild (Stack) davon gemacht. Auf eine Retusche habe ich verzichtet, bei diesem Motiv könnte man sich aber austoben... :)
Weiß jemand, wie das Gewächs heißt?
Grüße
Michael
Bild: Sternhaare, UV-Anregung, Bildbreite= 1,1 mm
Hallo Michael,
das ist ein Viburnum – den Sternhaaren solltest Du unbedingt einmal ,,Pol" angedeihen lassen.
Viele Grüße,
Heiko
Hallo Michael & Heiko,
Ich bin zwar eher Zoologe, aber der Strauch sieht eher nach einem Hartriegel aus: Cornus spec..
Vor dessen Sternhaaren sollte man sich hüten, meint meine Frau, die allergisch auf diese reagiert.
Aber unter dem Mikroskop sind die Haare offenbar wirklich schön! Ich gehe gleich in den Garten und besorge mir welche!
Einen schönen Sonntag noch,
Alfons
Hallo,
Alfons, siehe hier: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5077.0
Gruss Arnold
.... Wegen einer Bestimmung einer Pflanze werde ich mich bestimmt nicht streiten!
Sei es drum: Die Haare des in unserem Garten wachsenden Hartriegels 'Runzelblättriger Schneeballs'*) sind zwar schön stachelig, geben aber im polarisierten Licht nicht allzuviel her. Da gibt es definitiv Schöneres!
Herzliche Grüße,
Alfons
*): Der Busch in unserem Garten wurde seit allen Zeiten offenbar fälschlicherweise als 'Hartriegel' bezeichnet. Da habe ich blind auf die Worte meiner Frau vertraut, und jetzt etwas dazu gelernt! Ein Vergleich der Blätter und Früchte über Wikipedia hat die Sache geklärt
Hallo Alfons, hallo Michael,
eine ältere Aufnahme der Haare von Viburnum lantana:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/309698_36849274.jpg) (https://abload.de/image.php?img=viburnumlantanab0kgw.jpg)
Viele Grüße,
Heiko
Hallo Heiko, Alfons und Arnold,
vielen Dank für eure Beiträge bzw. Bilder. Also handelt es sich um den Runzelblättrigen Schneeball (Viburnum rhytidophyllum).
@ Heiko - danke für den Pol-Tipp. Habe ich gleich umgesetzt, s.u.
Viele Grüße
Michael
Bild 1: Sternhaare von Viburnum an einer Blattkante, Pol, Bildbreite= 1,1 mm
Bild 2: Sternhaare von Viburnum, Pol, Bildbreite= 0,48 mm
Hallo zusammen,
die Vögel haben ein Büschel Moos auf das Fensterbrett geworfen. Habe ich mir gleich im UV-Licht angeschaut (Autofluoreszenz).
Bei der Gelegenheit habe ich auch gleich Helicon Focus 8.0 ausprobiert und speziell das neue Slabbing. Mein Stack bestand aus 157 Bildern, die ich in Sub-Stacks zu je 10 Aufnahmen gestapelt habe. Von den 16 entstandenen Bildern habe ich dann aber letztendlich nur zwei für die Aufnahme unten genutzt. Das war noch nicht so optimal. Ich werde das aber, vor allem mit anderen Motiven, weiter verfolgen.
Beste Grüße
Michael
Bild: Moosblätter, UV, Autofluoreszenz. Bildbreite=1,75 mm
Hallo ADi,
danke! Ich hatte bisher mit Sub-Stacks nichts gemacht, Zerene hatte ich nur mal als Testversion und mit HF ging das noch nicht optimal. Nun scheint es zu funktionieren, aber es macht natürlich auch nur bei bestimmten Objekten Sinn. Insekten wären da sicherlich zu nennen.
Die Methode kannst du jeweils frei wählen, auch für jeden Sub-Stack separat. Macht aber wohl wenig Sinn.
Hier nochmal der Link zu einer Beschreibung für den Einstieg: https://enrico-bonino.eu/sub-stacking-in-helicon-focus/ (https://enrico-bonino.eu/sub-stacking-in-helicon-focus/)
Beste Grüße
Michael
Hallo zusammen,
Jochen (jochen53) hatte vor kurzem angeregt, dass ich mir mal einen dieser rosafarbenen Schleifköpfe vom Dremel im UV-Licht anschauen sollte.
Das habe ich nun gemacht. Schön rot!
Bild 1: Dremel Schleifkopf, UV-Anregung, Bildbreite 3,2 mm
Bild 2: Dremel Schleifkopf, UV-Anregung, Bildbreite 1,1 mm
Beste Grüße
Michael
Hallo Michael,
wird dieser synthetische ,,Rubinkorund" sein, die 2% Cr machen den Effekt. Hier in Würfelform:
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures012/323737_40256670.jpg) (https://abload.de/image.php?img=korundsynth.rubinkorudejzd.jpg)
Viele Grüße,
Heiko
Hallo Heiko,
ja, Chrom macht wohl den Unterschied. Ich habe auch von Thermolumineszenz bei Korund gelesen. Ist aber ein anderes Thema.
Beste Grüße
Michael
Hallo zusammen,
Alexander (Aljoscha) hatte kürzlich an Interessenten eine Farbstofflösung für den Fluoreszenz-Nachweis von Pilzen und Hefen (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=44337.msg327306#msg327306) geschickt. Ich wollte die jetzt mal ausprobieren. Zufällig war von anderen Versuchen noch ein Blütenrest einer Kornblume in einem Behältnis übrig geblieben. Da hatte sich, in feuchter Umgebung, ordentlich Schimmel gebildet. Also ein paar Fäden abgezupft und ein schnelles Präparat nach Alexanders ,,Packungsbeilage" hergestellt.
Hier sind zwei Bilder davon. Funktioniert bestens, danke Alexander!
Beste Grüße
Michael
Hallo,
nun eine Hühnerfeder.
Bild 1: Fundort
Bild 2: Hühnerfeder, UV-Anregung, Bildbreite 0,45 mm
Beste Grüße
Michael
Hallo,
nix Besonderes. Beim Zubereiten von Cole Slaw ist mir ein Körnchen vom Topping herunter gefallen. Das habe ich gleich mal unter UV angeschaut.
Beste Grüße
Michael
Bild 1: Selleriesaat, UV-Anregung, Bildbreite 1,75 mm