Meine ersten versuche mit versilberungstechniken.
Die Schnittdicke sollte, Protokolweise, nicht zu dünn sein. Warum begreife ich jetzt auch: in ein dünnen Schnitt ist die Chance um ein langen Dendrit zu Treffen sehr gering.
Meine Bilder zeigen Schnitte von 8µm dick. Tip: Rechne ein ganzen Sonntag um die Färbung aus zu fuhren aber das ist für Histologie normal.
Dank an Klaus Herrmann für die Chemikaliën.
Farbprotokol:
A: Silbernitrat in AD 20%;
B: Reduktionsflussigkeit: 5ml Formol 37%, 20ml Isopropanol 100% und 75ml AD;
C: Ammoniakalischer Silberlösung:
- 20ml Silbernitrat 20%;
- 20ml Ethanol 95% zufügen;
- Ammoniak tropfenweise zugeben bis die entstandene Niederschläge gerade verschwunden sind.
D: Natriumthiosulfat 5% AD;
E: Glodchloridlösung 1% AD.
Lösung C sofort nach gebrauch verdunnen und entsorgen. Getrocknete Feststoff is Explosiv
- Coupes entparaffinieren und in Wasser bringen;
- Lösung A, 3 Stunden;
- Auswaschen in Lösung B, 2-5 min;
- Auswaschen in Ethanol 10%, 2 min;
- Ammoniakalischer Silberlösung C, 2 min;
- Auswaschen in Lösung B, 3-5 min;
- Spulen mit AD;
- Tönen mit E, 2 min;
- Spulen mit AD;
- Fixiren in D, 2 min;
- Spulen in Leitungswasser;
- Dehydriren und eindecken.
Grüße Ronald
Bild 1: Kleinhirn Rind, Leitz Fluotar 25x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_14908310.jpg)
Bild 2: Kleinhirn Rind, Leitz PL apo 40x
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_66894185.jpg)
Bild 3: Kleinhirn Rind, Leitz PL apo 40x, Körnerschicht
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_57448320.jpg)
Bild 4: Kleinhirn Rind, Leitz PL apo 40x, Körnerschicht
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_35037611.jpg)
Bild 5: Kleinhirn Rind, Leitz PL apo 40x, Körnerschicht
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_33188650.jpg)
Bild 6: Kleinhirn Rind, Leitz PL apo 40x, Körnerschicht und Purkinje Zellen
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_17094261.jpg)
Bild 7: Rückenmark Rind, Leitz PL apo 63x, Motorische Nerv mit Nissl Substanz
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_31044272.jpg)
Bild 8: Rückenmark Rind, Leitz PL apo 63x, Motorische Nerv mit Axon und Dendriten
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43786_54814989.jpg)
Hallo Ronald,
bin immer wieder von deinen Arbeiten begeistert. Toll!!!
Viele Grüße
Erik
Hallo Ronald,
super, dass es so geklappt hat! Sehr schön scharfe Darstellung der Denditen. Die Holländer sind offensichtlich nicht nur im Fußball gut!
Gratuliere zu beidem: Endspiel und Versilberung - es ist ja auch ein Hauch Gold dabei. ;)
Am Sonntag wissen wir mehr! Hier wissen wir jetzt schon, dass es gut ist!
Lieber Ronald,
die Versilberungen sind Dir ganz hervorragend gelungen.
Ich kenne viele ZNS Silberpraeparate, die viel zu stark impraegniert sind,
Deine jedoch sind wunderbar leicht und fein differenziert.
Tolle Leistung- weiter so !
Herzliche Gruesse
Holger
Hallo Ronald
Das sind ganz wunderbare Präparate, herzlichen Glückwunsch!
Woher stammt das Färbeprotokoll? Ich kannte bisher nur Protokolle mit Kaliumdichromat (Golgi) oder Protargol.
Worin hast Du fixiert?
Mikrogrüße
Jürgen
Lieber Ronald,
danke für die interessante Dokumentation und die tollen Bilder!
Herzliche Grüße
Jörg
Hallo Ronald,
Fijn dat je weer terug bent in het forum.
Schöne Bilder und eine interessante Sache.
Herzlichen Gruss
Jan
@ Jürgen,
Das Protokoll stammt von die Uni of Nottingham (Histology Lab) http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/biels.html
Ich habe nur das Absolute Alkohol ergänzt mit Isopropanol 100% und das geht gut.
Auch habe ich nicht das extra Ammonia zugefügt nachdem die niederschlage weg waren. Im Romeis ist zu lesen das ein zu viel Ammonia sehr schädlich ist für eine gute Färbung.
@ Holger,
Ich begreife nicht warum z.b. den großen Axon aus die Purkinje Zellen nicht Färben und die feinen Dendriten daneben wohl.
Warum sehe ich nicht ein Dendriten-Baum?
Grüße Ronald
Hallo Ronald,
zu Deiner Frage (eigentlich 2 Fragen):
- "Warum sehe ich keinen Dendritenbaum ?": Ich denke, Bild 4, 6 und 8 zeigen sehr schoene Dendritenbaeume !
- "Warum sind die Axone der Purkinje-Zellen nicht gefaerbt ?": Ich denke, die mittlere der 3 Purkinjezellen in Bild 6 zeigt doch sehr gut sein Axon. Ingesamt ist zu beruecksichtigen, dass das Silber wohl an bestimmte "argentophile" Strukturen angelagert wird - ich denke es sind z.B. die Zell-Membranen. Da diese bei den duenneren Dendriten dann insgesamt eine lokal hoehere relative Silberkonzentration binden erscheinen sie moeglicherweise dunkler als das Axon, wo Zell-Membran zu Zell-Inhalt in einem anderen lokalen Verhaeltnis stehen.
Das ist meine Interpretation, ich weiss nicht ob sie den Tasachen entspricht. Fakt jedenfalls ist, dass ich dieses Phaenomen von allen Versilberungen her kenne die ich bisher sah. Wahrscheinlich erscheint auch der Zell-Leib aus genau diesem Grund ebenfalls schwaecher geschwaerzt.
Sorry fuer die fehlenden Umlaute - ich arbeite im Moment mit einer Englischen Tastatur ;D
Herzliche Gruesse
Holger
Lieber Ronald,
danke für die Auskunft! Darf ich noch ein paar Fragen stellen?
Hast Du nur in Formol fixiert? Wielange? Wie groß war der Block?
Mikrogrüße
Jürgen
Jürgen,
Habe ich vergessen zu antworten;
Das Block ist in die Linker/unten ecke zu sehen. Es ist ungefähr 15x8mm und war 6/7mm dick.
Als Fixatif ist 'Alkohol-Formol-Eisessig nach Scheuring' gebraucht wie beschrieben auf die Website von Armin Eisner http://www.aeisner.de/index.html
('Rezepte' und dann der dritte Mischung). Fixierdauer war eine Woche. Ich nehme immer lange fixirzeiten weil ich es schade finde wenn alle Arbeit um sonst war nur weil es nicht genügend fixiert war.
Grüße Ronald
(https://www.mikroskopie-forum.de/pictures002/43838_14018701.jpg)
Ganz herzlichen Dank, Ronald, für die Ergänzungen. Deine Präparate sind wirklich ganz hervorragend gelungen.
o.t. Auf den ersten Blick erinnerte mich besonders Dein erstes Bild an Bilder Jackson Pollocks.
Mikrogrüße
Jürgen