Nacvicula praetexta 3D negativer Phasenkontrast

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
und noch einmal. Diesmal im negativen Phasenkontrast.

Ich hatte sie bestimmt als Nacvicula praetexta.

Aufgenommen mit dem Planachromaten 100x/1,30 FL. Videostacking mit Picolay. Vorab wurde eine Stelle ohne Algen für die Flat-Field Korrektur aufgenommen. Stack von 400 Bildern.

Interessant, was Picolay daraus macht.

Schönen Abend,
Carsten



Bild 1: Stack mit Picolay4




Bild 2 : füe die Ror/Cyan Brille

[Michael K.]

Hallo Carsten,


Das ist im Grunde ein recht flache Alge, 400 Bilder sind da definitiv zu viel. 
Bei dem Anaglyphenbild scheint auch "Length of Z-Axis" viel zu hoch zu sein. Bei flachen reicht oft
schon 20 oder 30. Das fertige Bild vergleiche ich im Nachhinein mit einem Blick durchs Mikroskop.


LG
Michael

[wejo]

Hallo Carsten,

ich finde die Bilder, trotz der von Michael geäußerten Kritikpunkte, eindrucksvoll!

Gruß
Werner

[anne]

Lieber Carsten,
ich denke hier wird selbst Heribert Cypionka der Meinung sein, dass 400 Bilder doch recht viel sind. Ich hätte hier auch mit Max. 50 Bildern gerechnet und das ist schon viel. Wer diese Diatomee schon gehandelt hat, also unter dem Stereomikroskop bewegt hat mit der Legeborste, weiß, dass diese zu den flacheren gehört. Ich schätze die Ausdehnung nach oben und unten ist max. 5 my, evtl. an ,,extremen" Stellen etwas mehr. Es ist trotzdem eine meiner absoluten Lieblingsdiatomeen❤️
lG
Anne

[mikropit]

also mir gefallen Deine Bilder sehr gut. Wie hast Du die Zustellung bei so vielen Bildern gemacht? Hast Du einen Schrittmotor?
vG Peter Mikropit

[Heribert Cypionka]

Liebe Diskutanten,

zu viele Schichten im Stack kann man eigentlich nicht haben. Es gibt sogar Experten (z.B. Kurt Wirz im Stacking-Forum), die an jeder Postion zwei Fotos machen, um das Rauschen zu verringern. (Oft gibt es hier im Forum aber mehr Pixel in Höhe und Breite als hochauflösende Objektive an Strukturen liefern können...)

Nun bekommt man ja durch Videostacking bei langsamem Fokussieren leicht hunderte Frames. Ob die alle erforderlich sind, lässt sich mit der neuesten PICOLAY-Version leicht ermitteln. Mit der kann man nämlich - wie hier beschrieben - auch nur jeden zweiten, dritten, fünften oder gar zehnten Frame stacken, was entsprechend schneller geht.

Viele zeigen hier im Forum ja korrekterweise Maßstabsbalken für die Länge und Breite. Was aber ist nun mit der nicht unerheblichen Tiefe, die unseren Objekten eigen ist? Die zu ermitteln ist nicht schwer, wenn man den Dreisatz kennt und am Feintrieb Striche hat:

Man nehme ein oben und unten verschmutztes Deckglas von 170 µm Dicke, fixiere mit einem beliebigen Objektiv auf den oberen Schmutz und zähle beim Fokussieren die Striche, bis der untere scharf wird. 170 µm geteilt durch die Anzahl der Striche ergibt nun die Tiefe/Höhe pro Strich am Feintrieb - für das benutzte Mikroskop unabhängig vom benutzten Objektiv.

Mit dem ermittelten Faktor kann man leicht auch die Tiefe/Höhe einer Diatomee etc. ausmessen. Und wenn man nun die Höhe des Stacks ins Verhältnis zur Höhe des gezeigten Bildes setzt, kann man mit PICOLAY eine korrekte Tiefendarstellung - sogar in Stereo! - erhalten.

In Englisch heißt das : Length of Z axis (% of image height):




Viel Spaß beim Dreisatz-Rechnen!

Heribert

[rlu]

Hallo Heribert,

Länge der Z-Achse // Length of Z axis
d.h. umso größer der Wert, um so größer der 3D-Effekt.

Bin bei der Anleitung ins Stolpern geraten, weil man Tiefe und Höhe synonym verwendet. Finde Höhe und Breite klarer. Vermutlich egal, wenn man weiß um was es geht.

Manual:
[==>] Länge der Z-Achse // Length of Z axis - Die Z-Achse (Objekttiefe/Objekthöhe) wird im Vergleich zur Höhe(Breite) des Bildes (Y-Achse) definiert. Wenn die unterste und die oberste Schicht Ihres Z-Stapels einen Abstand von 100 µm haben und die Höhe(besser wäre Breite des Objekts) ihres Bildes 200 µm beträgt, wäre der richtige Wert 50 (%). Ein Wert von 0 ergibt keinen 3D-Effekt. Ein zu großer Wert führt zu einer Trennung der Schichten des Objekts.

Striche sind die Anzahl der Striche vom Feintrieb für den Weg vom unteren zur oberen Seite des Deckglases oder des Objekts/Diatomeen.
X ist die Dicke vom Objekt in µm. Die Dicke vom Deckglas kann auch variieren. Dazu wäre ein Mikrometer/Bügelmeßschraube notwendig, um die wahre Dicke zu ermitteln.

Dicke_Deckglas / Striche_Deckglas= Dicke_Diatomeen/ Striche_Diatomeen
Dicke_Deckglas / Striche_Deckglas=      X    / Striche_Diatomeen
X =  {  Dicke_Deckglas *  Striche_Diatomeen } / Striche_Deckglas

Liebe Grüße
Rudolf

Einfach mal ein paar Deckgläser gemessen. Diese weiche max um 24µm ab.
0,166
0,182
0,184
0,190
0,185

[jcs]

Viele zeigen hier im Forum ja korrekterweise Maßstabsbalken für die Länge und Breite. Was aber ist nun mit der nicht unerheblichen Tiefe, die unseren Objekten eigen ist? Die zu ermitteln ist nicht schwer, wenn man den Dreisatz kennt und am Feintrieb Striche hat:

Hallo Heribert,

die Methode mit dem Deckglas funktioniert allerdings nur unter zwei Bedingungen:

(1) Die angegebene Dicke des Deckglases stimmt mit der echten Dicke überein. Wie man aus Rudolfs Messung erkennt, ist das meistens nicht der Fall.
(2) Der Brechungsindex des Deckglases ist identisch mit dem Brechungsindex des Einbettungsmediums. Falls das nicht der Fall ist, muss man auch die Differenz der Brechungsindices berücksichtigen

LG
Jürgen

[Heribert Cypionka]

Hallo Jürgen,

du hast es jetzt aber wieder ganz genau genommen

Man kann auch ein Objektmikrometer schräg mit bekanntem Winkel unter das Objektiv legen. Dann schaut man nur durch Luft, muss aber neben dem Dreisatz auch noch den Satz des Pythagoras zur Anwendung bringen - und wer kann das schon!?

LG
H.

[Gerd Schmahl]

Hallo,
muss ich nicht auch noch die Temperatur berücksichtigen, die Einfluss auf den Brechungsindex hat, also den Satz des Prometheus?
Duck und weg
Gerd

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
ich komme erst jetzt dazu, auch noch etwas zu sagen.
Ich mache ja wenig Video-Stacking. Als ich hiermit angefangen habe, hat mein Video-Schnittprogramm seinen Dienst versagt. Nichts geht mehr. Ich habe jetzt Shutter Encoder OpenGL. Läßt sich erstaunlich intuitiv bedienen. Man kann da sogar die fps einstellen. Stehen standardmäßig aber auf 60 (und ich habe es nicht bemerkt). Meine Sony kann aber bei MP4 maximal 30. Bei 60 fps werden also viele Bilder interpoliert (oder einfach kopiert) und das erklärt auch die 400 Bilder. Ich werde einen neuen Versuch in einem neuen Thread starten, bei dem ich die fps auf 10 eingestellt habe. Damit komme ich bei meinem Schärfebreich auf 75 bis 85 Bilder.

Grüße
Carsten

[Heribert Cypionka]

@ Gerd

den Satz des Prometheus musste ich jetzt doch tatsächlich nachschlagen. Das sagt die KI dazu:

Der ,,Satz des Prometheus" bezieht sich meist auf Goethes gleichnamige Hymne (1774), die den absoluten Bruch mit göttlicher Autorität und die Selbstermächtigung des Menschen feiert.

Also, die Selbstermächtigung des Menschen möchte ich jetzt doch kritisch bewerten.


@ Carsten

Für's Videostacking braucht man kein Schnittprogramm. Und 30 fps sind voll ok. Du solltest nur manuell die Belichtungszeit auf 1/400 oder 1/500 sec pro Frame einstellen. Dazu viel Licht geben, damit nichts verwackelt. Nötigenfalls den ASA-Wert an der Kamera erhöhen, 400 oder 800 ist auf jeden Fall ok. Man übt das Fokussieren ohne Aufnahme, startet sie dann und fährt für 5-10 sec ruhig von oben nach unten durch alle Strukturen. Anschließend Aufnahme beenden. Für den nächsten Stack dann das nächste Video. Jetzt kann man mit FreeVideoToJPG Converter mit einem Klick alle Frames aus den Videos extrahieren. Das Programm legt für jedes Video ein neues Verzeichnis an. Von den extrahierten Frames die komplett unscharfen am Anfang und Ende löschen (das mache ich mit Irfanview oder FSViewer). Nun an einem typischen Stapel die Stackingparameter optimieren, 'Save depth map' aktivieren. Am Schluss mit 'Stack multiple subfolders' die Frames aus allen Videos stacken lassen...

Viel Erfolg!

Heribert

[Carsten Wieczorrek]

Moin,
@Heribert
Das stimmt so nicht. Ich muss die ersten 2 Sekunden immer abschneiden, da sie Schreibtisch bedingt verwackelt sind.
Grüße
Carsten

[Heribert Cypionka]

Hallo Carsten,

Das stimmt so nicht. Ich muss die ersten 2 Sekunden immer abschneiden, da sie Schreibtisch bedingt verwackelt sind.

Bitte nochmal lesen (war um 5:42 Uhr vielleicht noch schwierig ):

Von den extrahierten Frames die komplett unscharfen am Anfang und Ende löschen

LG
H.

[Carsten Wieczorrek]

Genau das macht doch der Filmschnitt. Geht schneller.
Carsten