Einfache Methode zur Fluoreszenzmikroskopie mit 3x verbesserter Auflösung

[Amiga]

 
Einfache Methode zur Fluoreszenzmikroskopie mit verbesserter Auflösung in allen drei Raumrichtungen. Fortschritt bei der bildgebenden Beobachtung von Zellen und Gewebe.

Die Arbeitsgruppe Angewandte Laserphysik & Laserspektroskopie unter der Leitung von Professor Dr. Markus Sauer (Fakultät für Physik der Universität Bielefeld) hat ein neues sehr einfaches Verfahren entwickelt, mit dem es möglich ist, biologische Strukturen in Zellen mit circa zweifach besserer Auflösung in allen drei Raumrichtungen abzubilden. Unter Verwendung eines Standard Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskops (LSM), wie es in den Lebenswissenschaften weit verbreitet ist, kann so erstmals für Jedermann zugänglich auf einfache Art und Weise eine Auflösung von circa 130 Nanometer (nm) in zweidimensionaler ("lateraler") und 350 nm in räumlicher ("axialer") Richtung erreicht werden.
Optische Verfahren wie die Fluoreszenzmikroskopie sind ideal zur bildgebenden Beobachtung von Zellen und Gewebe geeignet, da sie es ermöglichen nicht-invasiv dreidimensionale Bilder aufzunehmen. Leider ist der optischen Mikroskopie aufgrund des Wellencharakters des Lichts und der damit verbundenen Beugung eine Auflösungsgrenze von circa der halben Wellen-länge gesetzt. Das heißt, es ist mit gewöhnlichen lichtmikroskopischen Verfahren nicht möglich, Strukturinformation unterhalb von circa 250 nm in lateraler und circa 600-700 nm in axialer Richtung zu erhalten. Zur Verbesserung der beugungsbedingten Auflösungsgrenze wurden kürzlich neue Methoden wie die STED-Mikroskopie und die Lokalisationsmikroskopie auf Einzelmolekülebene (STORM, dSTORM, PALM) entwickelt, die routinemäßig eine Auflösung von besser als 50 nm in lateraler Richtung versprechen. Andererseits muss hierfür ein erheb-licher technischer Aufwand durch Überlagerung von verschiedenen Laserlinien oder einzelmolekülempfindliche Detektionsverfahren eingesetzt werden, die zusätzlich aufgrund der Strahlungsbelastung nur beschränkt für die Lebendzellmikroskopie eingesetzt werden können.

Es gab aber auch schon früh die Idee, Mehrphotonenanregungsprozesse zur Auflösungserhöhung zu verwenden. Während die Mehrphotonenanregungs-Mikroskopie wesentliche Vorteile beim "Sectioning", der Aufteilung in verschiedene Bildebenen, in axialer Richtung besitzt, wird die Auflösungserhöhung in lateraler Richtung aber durch die längere Anregungswellenlänge kompensiert. Den Forschern um Professor Markus Sauer ist es nun gelungen, Mehrphotonenprozesse in "lumineszierenden" (= leuchtenden) Halbleiterkügelchen, so genannten Quantenpunkten, zur Auflösungserhöhung in allen drei Raumrichtungen in einem Standardmikroskop einzusetzen und damit eine circa zweifach bessere optische Auflösung selbst in lebenden Zellen zu demonstrieren. Hierzu benutzen die Forscher ein Standard Laser-Scanning-Mikroskop. Zur Anregung wird ein einfacher Ar-Ionen-Laser benutzt. Der Trick liegt darin, dass in manchen Quantenpunkten in Abhängigkeit von ihrem Material und der Größe drei Excitonen (strahlende Elektronen-Loch-Paare), ein so genanntes Triexciton, durch die Absorption von drei Photonen entstehen kann, das bei einer kürzeren Wellenlänge als die herkömmliche Lumineszenz der Quantenpunkte (Mono- und Biexciton) Licht emittiert. Das heißt, die Forscher detektierten die Emission der Probe einfach bei einer kürzeren Wellen-länge und erzielten so eine Auflösungserhöhung um den Faktor 3 entsprechend einem Drei-Photonen-Prozess in allen drei Raumrichtungen. Die hier zusammengefassten Ergebnisse wurden im Fachjournal "Nano Letters" (Hennig et al., Nano Lett. 2009, 9, 2466-2470) veröffentlicht.

Der Charme des Verfahrens liegt darin, dass es jedem Forscher mit handelsüblichem Fluoreszenzmikroskop möglich ist, nun eine bessere Auflösung in allen drei Raumrichtungen auch in lebenden Zellen und Gewebe zu realisieren und - das nur durch die Verwendung von Quantenpunkten als effiziente Marker und der Detektion des Signals bei einer kürzeren Wellenlänge.

Mehr hier
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl9012387

[Amiga]

Hat das jemand von Euch schon mal probiert?

Das klingt so einfach, dass mir doch Zweifel kommen....
...so dass es evtl. doch zu kompliziert wird.

Es würde mich also interessieren was für Resultate Ihr dabei bekommt.


Gruß Amiga

Hier noch ein Link

http://m.youtube.com/index?desktop_uri=%2F&gl=US#/watch?xl=xl_blazer&v=Kzfe-mCSMOo

[beamish]

Hallo Amiga,

ich mußte grad ein wenig schmunzeln. Grad ging es noch um Schülermikroskope und jetzt um LSM. Was für eine Bandbreite dieses Forum doch hat!
Die von Dir gezeigte Neuerung hat sicher für den Profi im Labor Bedeutung, aber wohl kaum für den Amateur. Wer hat denn ein LSM zuhause rumstehen (der möge jetzt die Hand heben  ). Ich nehme jedenfalls an, daß mit den "handelsüblichem Fluoreszenzmikroskopen" eben jene Laser Scanning Mikroskope gemeint sind. Und die gibts noch nicht mal so eben im Zeiss-shop.
Schön wärs ja, wenn die Auflösungsgrenze für "jedermann" erschwinglich unterschritten werden könnte.

Herzlich

Martin

[Alfons Renz]

Hallo "Amiga",

Zum Originalartikel habe ich keinen Zugang und aus Ihrer Erklärung werde ich nicht so recht schlau: Sie schreiben von einer 'Auflösungserhöhung um den Faktor 3', dann von einer circa 2fach besserer Auflösung, während die Autoren gerade mal den Fakter 1,7 gelten lassen.

Der Trick scheint wohl darin zu bestehen dass bei einer 3-Photonenanregung eine kürzere Emmissionswellenlänge ausgestrahlt wird, welche aufgrund ihrer höheren Frequenz eine höhere Ortsauflösung bietet. Bei der 1-Photonen-Fluoreszenz ist die emittierte Welle ja immer länger als die Anregende.

Insofern wäre es interessant zu erfahren, worin dieser 3-Photonenanregungsprozess besteht und mit welcher Wellenlänge die angeregte Lumineszenz strahlt. Offenbar braucht man dazu 'Quantenpunkte': Was muss man sich darunter vorstellen? Sind dies physikalische Partikel (wie z.B. die fluoreszierenden Moleküle der entsprechenden Farbstoffe), und wie werden diese an die zu untersuchenden Strukturen (Strukturmoleküle der Zelle) angebunden? Auch das schön bunte, aber sehr schematische Bild des Originalartikels hilft hier nicht viel weiter.

Für eine etwas anschaulichere Beschreibung des Effekts und Erklärung der Methode wären wir Ihnen, lieber Herr Amiga, sehr dankbar!

Mit herzlichen Mikroskopikergrüßen,

Alfons

[Amiga]

Nun, Du musst nicht schmunzeln!

Ich finde es toll, das in diesem Forum die ganze Breite der Einsatzmöglichkeiten vertreten sind.

Nun aber zurück zum Thema:
Ich werde mit Sicherheit zu meinem Motic BA410 einen Fluoreszenz-Erweiterung kaufen!
Dachte mir doch, dass ich damit noch etwas zu warte....
....aber die Aussicht 3x mehr Auflösung zu erhalten, würde mich bei der Bakterienuntersuchung entscheidend schneller voran bringen.

Es geht mir also nun darum, ob schon jemand von Euch (mögen es auch nicht viele sein) einen solchen Versuch schon unternommen haben, oder aufgrund des Tipps es probieren wollen!

Sollten sich dadurch meine Zweifel legen, so werde ich sehr bald auf Fluoreszenz umsteigen.

Gruß Amiga

[Amiga]

Hier noch eine andere Erläuterung zum Thema.

http://de.wikipedia.org/wiki/STED-Mikroskop


Und hier ein Artikel zum Deutschen Forschungspreis
http://www.deutscher-zukunftspreis.de/nominierter/lichtmikroskopie-ungekannter-schärfe?sec=2

Und gleich noch einer...
http://www.laborundmore.de/research/2237,937621/Dr.-Mike-Heilemann/Biophotonic-Fluoreszenzmikroskopie.html

Gruß Amiga

[Eckhard F. H.]

Schön wärs ja, wenn die Auflösungsgrenze für "jedermann" erschwinglich unterschritten werden könnte.

Schön wär´s für viele schon, sich ihr erschwinglich zu nähern.

Gruß - EFH

[wilfried48]

Hallo,

zunächst wünsche mal allen ein gutes neues Jahr.

Ob es mit den quantum dots als Ersatz für die konventionellen Fluorphore in lebenden Zellen etwas wird wage ich zu bezweifeln. Die ersten Veröffentlichungen zur Einphotonenanregung von quantum dots und deren Einsatz in der Fluoreszenzmikroskopie liegen schon ein halbes Jahrzehnt zurück und man findet z.B. bei Zeiss noch keinen Applikationsbericht für das LSM. Einfach mal bei Zeiss.de den Suchbegriff quantum dot eingeben.
Das Problem ist offensichtlich, dass die quantum dots offensichtlich nicht so einfach in lebende Zellen eindringen können und die hohe Anregungsintensität die sich ja beim Dreiphotonenprozess wegen des wahrscheinlich schlechteren Anregungswirkungsgrads noch verschärft.

Im Institut denken wir darüber nach wenn Zeiss die ersten Applikationsberichte herausbringt.
Und im Hobbybereich ?  Mit einer Fluoreszenzausrüstung am Motic wird es nichts werden und ein Zeiss LSM kostet im Moment mehrere einhunderttausend Euro 

viele Grüsse
Wilfried

[Alfons Renz]

Hallo,

Nach Überfliegen des Originalartikels (herzlichen Dank an 'Amiga'!) lüftet sich der Schleier, zumindest für mich! Die 'Quantumdots' sind kleine Kristalle in Nanometer-Größe, die bei Anregung mit einem Laser sowohl 1-, 2- und 3 Photonen gleichzeitig absorbieren und dann, im hier beschriebenen Fall bei einer Anregung mit 445 nm, sowohl Licht mit einer Wellenlänge von 650 bis 750 nm (bei 1-Photonen und zwei Photonen-Anregung) sowie 550 und 600 nm (bei 3-Photonenanregung) emittiert. Dieses unterschiedliche Fluoreszenzlicht wird über zwei jeweils auf die spezifische Wellenlänge abgestimmte Detektoren registriert. Und da eine kürzere Wellenlänge (550) ein detaillierteres Bild liefert als eine Längere (650-750), ergibt die 3-Photonenanregung logischerweise ein schärferes Bild.

Soweit kann ich als Biologe dies auch nachvollziehen, wäre jedoch für eine fachkundigere Erklärung durch einen Physiker sehr dankbar.

Die Quantumdot-Kristalle - hier im Versuch war es ein 'QDot655', was immer das sein mag - werden 'eingehüllt' und an einen sekundären Antikörper gekoppelt. Dieser bindet am primären Antikörper, welcher seinerseits wiederum spezifisch an einer biologischen Struktur, den Mikrotubulinfasern im vorliegenden Versuch, bindet. Eine 'Sandwichtechnik', wie sie in der Immun-Fluoreszenz-Mikroskopie gebräuchlich ist. Auch dies ist gut nachvollziehbar und resultiert in höher auflösenden Bildern.

Allerdings, und darauf hat Wilfried schon hingewiesen:  Die 3-Photonenanregung ist recht energieintensiv und, na sagen wir mal: 'umweltschädlich'! Eine Anregungsenergie von 0,1 bis 1 kiloWatt pro cm2 hält keine lebende Zelle lange aus! Bei der 1-Photonenanregung reichen 0,01 bis 0,1 kW, also gerade ein Zehntel. Allerdings leuchtet der Laserstrahl nur eine winzige Fläche aus und bewegt sich sehr schnell, so dass die thermische Belastung nicht ganz so schlimm ist.

Jedenfalls werden sich unsere Diatomeenschalen-Auflösungs-Spezialisten noch keine Gedanken hinsichtlich der Anschaffung eines solchen Geräts machen: Bei ihrer Beobachtungswellenlänge von unter 300 nm haben sie noch lange die Nase vorn!

Aber in den Life-Sciences hat jeder Gewinn an Schärfe seinen sichtbaren Vorteil! Speziell bei Kongressen, wenn an stolz seine Bilder zeigen kann.

Mit neuen Kräften also immer wieder über die alte Abbesche Hürde!

Und einen schönen Abend noch!

Alfons

[Amiga]

Hallo zusammen...

....nun der Mikroskop-Himmel über Zürich ist nun zunehmend dunkler geworden.

Die Hoffnung auf den Durchbruch mittels "einfacher" Fluoreszenz ist schon fast verflogen.
Da flackert nur noch eine kleine letzte Hoffnung, dass an dem Schlussberichts-Zitat wenigstens eine kleine Wahrheit, eine geringe Vergrösserung ab zu gewinnen wäre.

Der Charme des Verfahrens liegt darin, dass es jedem Forscher mit handelsüblichem Fluoreszenzmikroskop möglich ist, nun eine bessere Auflösung in allen drei Raumrichtungen auch in lebenden Zellen und Gewebe zu realisieren und - das nur durch die Verwendung von Quantenpunkten als effiziente Marker und der Detektion des Signals bei einer kürzeren Wellenlänge.

Stimmt nun dieser Schluss nicht, habe ich mich dadurch täuschen lassen?

Amiga

[wilfried48]

Hallo Amiga,

also ein spezielles Laser Scanning Mikroskop mit entsprechendem Detektor und starkem Anregungslaser
braucht man offensichtlich schon noch.
Aber es muss wenigstens kein Picosekundenlaser mehr sein wie bei der früheren Multiphotonenmikroskopie,
der allein 150 Tausend Euro kosten würde.

Am besten du fragst beim Herrn Juniorprofessor in der Nachwuchsforschungsgruppe in Bielefeld mal
an, ob so etwas auch an deinem Motic realisierbar wäre 

http://www.physik.uni-bielefeld.de/mh/Research.htm

viele Grüsse
Wilfried