Reflexionskontrast mit Leitz NPL Fluotar Phaco2 RK Objektiv

[K. Koch]

Hallo Leitz-Spezialisten,

ich habe ein Objektiv Leitz NPL Fluotar 50/1,00 Oel Phaco 2 RK 160/0,17. Die Schrift ist rot statt grün bei Leitz Phaco-Objektiven. Auch erscheint mir der Phaco 2 Ring recht klein für diese Vergrößerung, d.h. der Kreis ist im Phaco-Fernrohr ziemlich klein -> geringe Apertur.
Hier ein ähnliches Objektiv, ein NPL Fluotar 100 X /1.32 Oil Phaco 2 RK:
Artikelnummer: 300295361197


Was hat es mit diesen Objektiven auf sich?

Viele Grüße
K. Koch

[HCLange]

Hallo Herr Koch,

das sind Objektive für "Reflexionskontrast und Phasenkontrast". Die rote Gravur deutet auf Spannungsfreiheit hin.
Liste 1984:
NPL  50   Leitz-Nr. 559 206  freier Arbeitsabstand 0,18 mm  TL 170
NPL 100  Leitz-Nr. 559 207  freier Arbeitsabstand 0,16 mm  TL 170

Mikrogrüsse
Christoph Lange

[K. Koch]

Hallo Herr Lange,

vielen Dank für den Hinweis!
Jetzt suche ich Informationen zum Reflexionskontrast, bzw. was man noch braucht, um ihn zu erhalten.
Hier
http://www.relief-phasenkontrast.de/index.html
und hier
http://www.prof-piper.com/Forschung/Zytologie/Zytometrie/zytometrie_0.html
steht, dass es sich um ein Auflicht-Interferenzverfahren handelt.
Wissen Sie, was man noch braucht, um den Reflexionskontrast zu sehen? Ein Auflicht-Mikroskop (allerdings von Zeiss) mit Polarisator und Analysator hätte ich...
Gibt es eine Leitz-Broschüre, in der das Verfahren näher erklärt wird?

Oh, habe gerade im Mikrokosmos-Register dies gefunden: Patzelt W J (1977): Reflexionskontrast. Eine neue lichtmikroskopische Technik. 66 78
Das werde ich mir mal durchlesen...

Viele Grüße
K. Koch

[Piper]

Hallo, Herr Koch,

ich habe zufällig am Wochenende das Mikroskopie-Forum besucht und Ihre Frage zum Reflexionskontrast bzw. den RK-Objektiven gelesen. Da ich über einen bestimmten Anwendungsaspekt dieser Methode in den 70iger Jahren meine Doktorarbeit geschrieben habe (meine Internetseiten hierzu hatten Sie ja schon gefunden), kann ich Ihnen gerne einige weitere Auskünfte geben, die vielleicht weiter helfen.

Die Apertur der Reflexionskontrast-Objektive liegt nicht niedriger als bei vergleichbaren sonstigen Ölimmersionen entsprechender Vergrößerung. Der Phasenring wurde bewusst mit kleinem Durchmesser ausgelegt, damit er im Gesamtquerschnitt der Optik nur eine möglichst geringe Fläche einnimmt. Auf diese Weise sollte sichergestellt werden, dass bei Anwendung des Reflexionskontrastes keine Beeinträchtigung der Bildqualität durch den in diesem Fall letztlich überflüssigen Phasenring entsteht.

Sämtliche Reflexionskontrast-Objektive sind als Ölimmersionen ausgelegt. Sie sind grundsätzlich auch geeignet für Fluoreszenzmikroskopie (Auflicht- oder Durchlicht-Fluoreszenz). Um Phasenkontrast zu realisieren, benötigt der Phasenkontrast-Kondensor selbstverständlich eine im Durchmesser abgestimmte Ringblende. Von Leitz wurde ein spezieller modifizierter Universal-Kondensor für Phasenkontrast nach Zernicke zu diesem Zweck angeboten.

Als weitere konstruktive Besonderheit ist der Frontlinse des Objektivs ein Lamda Viertel-Plättchen aufgelagert. Dieses wird zur Erzeugung von Reflexionskontrast benötigt und stört die Bildgebung bei anderen Beleuchtungsarten nicht.

Sie können die Objektive daher m. E. wahrscheinlich auch an Zeiss-Mikroskopen verwenden, und zwar im Hellfeld, Dunkelfeld und bei Fluoreszenz sowie für Phasenkontrast, falls ,,zufällig" eine im Durchmesser passende Lichtringblende vorhanden ist.

Wenngleich die RK-Objektive für eine Tubuslänge von 170 mm gerechnet wurden, lassen sie sich sehr wahrscheinlich auch mit gutem Erfolg an Mikroskopen mit abweichender Tubuslänge (z. B. 160 mm) einsetzen.

Wenn solche Endlich-Objektive an einem Unendlich-Mikroskop verwendet werden, erhöht sich die effektive Objektivvergrößerung um etwa 50 % und es verringert sich der Arbeitsabstand um etwa ein Drittel. Nach Maßgabe eigener Versuche ergibt sich nur bei sehr wenigen Endlich-Objektiven ein brauchbares Bild, wenn diese an Unendlich-Mikroskopen verwendet werden. Daher wäre es in diesem Fall sehr viel Glückssache, falls sich mit diesen Objektiven an einem Unendlich-Mikroskop brauchbare Bilder erreichen lassen sollten.

Um Reflexionskontrast zu erzeugen, bedarf es eines speziell konzipierten Auflicht-Illuminators, welcher meines Wissens nur vom Original-Hersteller (Leitz) in der erforderlichen Form angeboten wurde. Dieser Auflicht-Illuminator wurde speziell angeboten für das umgekehrte Mikroskop Leitz Diavert, alternativ existierte ein entsprechend konzeptionierter Auflicht-Illuminator auch für das analoge aufrechte Mikroskop Leitz Dialux.

Der Auflicht-Illuminator für Reflexionskontrast bestand neben der Lichtquelle und einer Leuchtfeldblende für Köhler'sche Beleuchtung zunächst aus einem ringförmigen Lichtdurchlass, welcher auf einem Schieber angeordnet war (sog. Stach'scher Beleuchtungsschieber). Diese ringförmige Lichtblende war so konzeptioniert, dass die beleuchtenden Strahlen konzentrisch in einem Winkel von 45 ° im Auflicht auf das Objekt trafen.

Zusätzlich beinhaltete der Auflicht-Illuminator einen Polarisator und einen teildurchlässigen Planglasreflektor. Das Mikroskopstativ verfügte weiterhin über einen Analysator in typischer Position. Polarisator und Analysator waren in gekreuzter Stellung zueinander angeordnet.

Bei Reflexionskontrast wurde das beleuchtende Licht zunächst linear polarisiert. Nach Durchtritt durch das Objektiv wurde es infolge der vorgelagerten Lamda Viertel-Platte zirkular polarisiert. Folglich wurde das Objektiv von zirkular polarisiertem Licht beleuchtet. Das vom Objekt reflektierte Licht war wiederum zunächst zirkular polarisiert. Es wurde nach Passieren des Landa Viertel-Plättchens erneut linear polarisiert, wobei die Schwingungsebene des bildgebenden Lichtes senkrecht zur Schwingungsebene des polarisierten Beleuchtungslichtanteiles war. Diejenigen Anteile des beleuchtenden Lichtes, welche an den Linsen des Objektivs störend reflektiert wurden, waren in gleicher Ebene linear polarisiert wie das ursprüngliche Beleuchtungslicht. Der Analysator war nun oberhalb des Objektivs bzw. unterhalb des Okulars so angeordnet, dass sämtliche Störreflexe geblockt wurden, wohingehend die senkrecht hierzu polarisierten bildgebenden Strahlenanteile den Analysator passieren konnten. Durch diese polarisationsoptischen Hilfsmittel war folglich sichergestellt, dass ausschließlich die vom Objekt reflektierten Lichtanteile selektiv zum Okular durchgelassen wurden.

Im Endeffekt resultierte aus dieser Beleuchtungsanordnung ein extrem sensitiver Dunkelfeld-Effekt. Interferenzerscheinungen wurden bei entsprechend dünnen und transparenten Objekten geringer Dichte erzeugt, ähnlich wie bei dem Ölfilm auf einer Pfütze, wenn dieser aus schrägem Winkel beleuchtet bzw. betrachtet wird. Durch die jeweiligen Interferenzmuster wurden Objektstrukturen identischer Schichtdicke markiert; die Interferenzlinien sprachen folglich Höhen- bzw. Schichtdickenlinien.

Dichtere oder dickere Objekte erzeugten keine Interferenzen, sondern wurden ausschließlich durch Reflexion und Absorption abgebildet.

Im Vergleich zu anderen Beleuchtungsmethoden lag die Besonderheit des Reflexionskontrastes darin, dass eine der Fluoreszenzmikroskopie in etwa vergleichbare Sensitivität in der Darstellung feinster Objektdetails erreicht wurde, ohne dass Fluorochrome einzusetzen waren. Auch minimale Gangunterschiede, welche bei herkömmlicher Phasenkontrast- oder Dunkelfeld-Beleuchtung nicht kontrastierbar waren, konnten im Reflexionskontrast extrem deutlich dargestellt werden.

Aus der optischen Wirkungsweise folgt, dass es sich beim Reflexionskontrast um eine extrem lichtschluckende Methode gehandelt hat. Brauchbare Ergebnisse erforderten seinerzeit ein Lampenhaus 250 mit Quecksilber-Höchstdrucklampe 200 Watt.

Letztlich hat sich die Methode allerdings nicht durchgesetzt. Meines Wissens existieren weltweit etwa 10 – 15 funktionsfähige Reflexionskontrast-Mikroskope. Nach meiner persönlichen Meinung wurde die Methode im Lauf der weiteren Entwicklung durch die zunehmend fortschreitende Fluoreszenzmikroskopie und später auch durch andere hochauflösende Spezialverfahren ,,überholt".

Zur Zeit seiner Entwicklung dürfte es sich andererseits beim Reflexionskontrast um das sensitivste Verfahren zur Sichtbarmachung feinster Objektstrukturen gehandelt haben, welche lichtmikroskopisch realisierbar war.

Bei Interesse kann ich Ihnen gerne einige Seiten aus meiner alten Doktorarbeit ablichten und zuschicken. Diese enthält auch eine schematische Strahlengangskizze, welche die vorbeschriebenen beleuchtungstechnischen Besonderheiten des Reflexionskontrastes veranschaulicht.

Natürlich existierte in den 70iger Jahren auch eine von Leitz herausgebrachte Broschüre, in welcher die Methode recht genau beschrieben wurde. Möglicherweise könnte man hiervon noch eine Ablichtung bei Leica in Wetzlar bekommen, wenn ein hilfreicher Mitarbeiter ein entsprechendes Exemplar noch im Archiv finden sollte.

Soweit mir bekannt, befindet sich immer noch ein funktionierendes Leitz Diavert mit Reflexionskontrast am Anatomischen Institut der Universität Münster. Ein späterer Mitarbeiter meines Doktorvaters hat meines Wissens mit diesem Mikroskop über viele Jahre sehr intensiv wissenschaftlich gearbeitet. Dieser Kollege wäre im Falle eines Interesses auf Ihrer Seite wahrscheinlich auch bereit und aufgeschlossen, Ihre RK-Objektive einmal am passenden Mikroskop auszuprobieren, wenn Sie mit ihm einen Termin für ein Treffen in seinem Institut vereinbaren würden.
Die Kenndaten wären:
Prof. Dr. med. Timm J. Filler, Telefon: 0251/8355226, Fax: 0251/8352369, Email:
filler@uni-muenster.de.     

Wenn Sie die mir zur Verfügung stehende Beschreibung und Strahlengangskizze gerne haben möchten, würde ich Sie bitten, mir am praktischsten Ihre Postadresse oder Email-Adresse mitzuteilen, damit ich Ihnen die Materialien zuschicken kann.

Mit freundlichen ,,Mikro-Grüßen"

Jörg Piper
(Mail: webmaster@prof-piper.de) 

[K. Koch]

Hallo Herr Piper,

vielen Dank für die ausführlichen Informationen. Dadurch angespornt habe ich mein inverses Zeiss Mikroskop umgebaut: Die Polarisator- und Analysatorschieber waren, da es sich um ein ehemaliges Auflicht-Mikroskop handelt, schon vorhanden, ebenso die Auflichtbeleuchtung. Die Zeiss-Birne hatte ich am Freitag durch eine lichtstarke Seoul P7 LED ersetzt (900 Lumen).
Den Anschluss der Auflichtbeleuchtung konnte ich ausbauen, und an der Stelle, wo die Aperturblende eingebaut ist, habe ich mit Tesafilm auf die Linse ein ca. 2 mm großes ausgestanztes rundes Stück schwarzen Schnellhefter geklebt (zentriert mit Hilfe des Phaco-Fernrohrs).
Damit hatte ich dann den von Ihnen beschriebenen Strahlengang. Im Mikrokosmos-Artikel von 1977 war noch beschrieben, dass das Objektiv im Leitz-Mikrokop drehbar ist, für optimalen Kontrast. Also habe ich das Objektiv nicht ganz eingeschraubt und konnte die Stelle maximaler Helligkeit finden.
Jetzt konnte ich eine etwa 3 Wochen alte Probe von ausgepresstem Moos untersuchen. Amöben gab es leider nicht, aber einige Wasser-Organismen, die an der Deckglasscheibe auflagen. Ach ja, Deckglas: Die Petrischale hat ein im Boden eingeklebtes 50mm Deckglas.
Damit konnte ich dann auf die Schnelle diese Aufnahmen machen, ich denke es handelt sich bei den steifenförmigen Strukturen um die beschriebenen Interferenzen?

Objektiv: Leitz NPL Fluotar 50/1,00 Oel Phaco 2 RK 160/0,17
Belichtungszeit 2 bis 4 Sekunden

Ein Tierchen (keine Ahnung was, ob Rädertier oder Einzeller, ich war auf andere Dinge fokussiert ) mit dem Bauch am Deckglas anliegend:




Etwas Anderes... :


Auf jeden Fall eine interessante Technik, jetzt muss ich nur noch die richtigen Objekte dafür finden.
Wie ich gelesen habe sind z.B. dünne Pseudopodien von Amöben ein lohnenswertes Objekt...

Viele Grüße
K. Koch

[K. Koch]

Habe den Titel des Threads geändert...

[Piper]

Hallo, Herr Koch,

Gratulation! Die Bilder sehen schon sehr authentisch aus. Falls sie noch gerne eine Strahlengangsskizze der Original-Version hätten, um die Anordnungen zu vergleichen,, könnte ich Ihnen diese als jpg-Bildchen (ca. 250 kB gerne mailen. Wollte das Bild zuerst im Forum einstellen, habe dann aber festgestellt, dass ein Upload auf direktem Wege nicht mehr funktioniert (und der Umweg über ein separaten Upload-Server war mir auf die Schnelle zu umständlich...). Vielleicht haben Sie aber das Bild auch schon aus anderer Quelle beschafft; es war in vergleichbarer Weise z.B. in Beiträgen von Herrn Patzelt veröffentlicht.

Die Interferenzen auf Ihren Bildern entstehen, so wie sie aussehen, mit größter Wahrscheinlichleit nicht im Objekt selbst, sondern in der dünnen Flüssigkeitsschicht zwischen Objekt und bodenseitiger Glasfläche des Präparates. Sie können dies verifizieren, wenn Sie das Objekt längere Zeit beobachten und nach unten sinken lassen. Je mehr sich das Objekt der Glasfläche nähert, desto deutlicher werden die Interferenzmuster sichtbar.

Geeignete Objekte sind m.E. am ehesten extrem dünne und filigrane Strukturen, welche sich mit anderen Methoden nicht in befriedigendem Kontrast abbilden lassen. Die Schichtdicke sollte in etwa rotem Blutkörperchen oder Blutplättchen entsprechen. Wahrscheinlich lassen sich auch Bakterien gut darstellen, welche ja noch dünner sind. Auch Chromosomen konnte man sehr detailreich darstellen. Damit Interfrenzen im Objekt selbst entstehen, sollte das Objekt nicht frei in einem flüssigen Medium flottieren (sonst entstehen nämlich Interferenzen in der Flüssigkeits-Grenzschicht), sondern es sollte der nach unten gerichteten Glasfläche des Präparates innig anliegen (wie bei Ausstrichpräparaten der Fall).

Viel,Vergrügen beim weiteren Experimentieren...

Jörg Piper

[TPL]

Auf diese Weise sollte sichergestellt werden, dass bei Anwendung des Reflexionskontrastes keine Beeinträchtigung der Bildqualität durch den in diesem Fall letztlich überflüssigen Phasenring entsteht.

Hallo Herr Piper,
schön, hier im Forum einen der Anwender dieses Verfahrens zu treffen. Da gab es doch auch Beiträge in den Leitz-Mitteilungen...

Ich interessiere mich ebenfalls für dieses Verfahren und versuche herauszufinden, ob die Wahl des Namens "Reflektionskontrast" einfach eine Marketing-Frage war, schutzrechtliche Gründe hatte oder ob sich das Leitz-Verfahren tatsächlich technisch von den extrem ähnlichen Verfahren anderer Hersteller unterschied. Ihr Hinweis, der Phasenring sei für den Reflektionskontrast überflüssig deutet darauf hin, dass sich der Leitz'sche Reflektionskontrast nicht von der Zeiss'schen Antiflex-Methode unterschied.

Nur hat Zeiss seine Antiflex-Methode in den 1950ern nicht für mikrobiologisch-medizinische Fragestellungen angeboten, sondern für die Erz- und Kohle-Auflichtmikroskopie. Da gab es sowohl Trocken- als auch Immersions-Objektive (für gewöhnliches Immersionsöl und Methylenjodid!) in drehbarer Fassung und mit dem Lambda/4-Plättchen. Erst in den 1980ern bot Zeiss dann neu berechnete, starke Objektive in Antiflex-Ausführung an (Plan-Neofluar 63/1,2). Aber auch Zeiss hatte das Verfahren nicht selbst erfunden, sondern es ging wohl auf M. Francon zurück (der damals die Mikroskopie mit einem gewissen Herrn Nomarski um eine ganze Reihe interessanter Verfahren bereichert hat ;-)

Als weitere konstruktive Besonderheit ist der Frontlinse des Objektivs ein Lamda Viertel-Plättchen aufgelagert. Dieses wird zur Erzeugung von Reflexionskontrast benötigt und stört die Bildgebung bei anderen Beleuchtungsarten nicht.

Nicht ganz: Für die Polarisationsmikroskopie sind diese Objektive natürlich nicht zu gebrauchen, es sei denn, man möchte dauernd den zusätzlichen Gangunterschied des Lambda/4-Plättchens.

Ansonsten lohnt es sich sicher, die Objektive einmal an einem Epifluoreszenz-Kondensor (z.B. Ploemopak) auszuprobieren, auch wenn der nicht die originalen Reflektionskontrast-Einrichtungen besitzt. Mit einem Polarisator vor dem Strahlenteiler und einem Analysator im Tubus müsste sich der Reflektionskontrast ja realisieren lassen...

[Piper]

Hallo, Thomas P.,

soweit ich weiß (mit dieser Einschränkung!) hat Leitz die Methode als Reflexionskontrast bezeichnet, um sich von dem Immersionskontrast des Mitbewerbers Zeiss (Zeiss West) abzugrenzen. Auch beim Immersionskontrast bestand eine Anordnung in Analogie zum Reflexionskontrast, d.h. Polarisator in der Lichtquelle, teildurchlässiger Umlenk-Spiegel im Illuminator, Lambda-Viertel-Kompensator vor der Objektivfrontlinse, Analysator hinter dem Objektiv, Polarisator und Analysator in Kreuzstellung). Der wesentliche Unterschied bestand darin, dass beim Immersionskontrast das beleuchtende Licht rechtwinklig / axial, d.h. in Parallelverlauf zur optischen Achse, somit senkrecht auf das Objekt traf, während Leitz zusätzlich eine Ringblende im Bereich der Lichtquelle eingebaut hatte (letztere ein- und ausschiebbar auf dem sog. Stachschen Beleuchtungsschieber gelagert). Daher fiel das Beleuchtungslicht in einem schrägen Winkel von 45 Grad auf das Objekt. Hieraus resultierte eine Objektbeleuchtung via Lichthohlkegel. Aus wellenoptischen Gründen werden Interferenzphänomene gefördert bzw. deutlicher erkennbar, wenn der Lichteinfall nicht senkrecht, sondern aus schrägem Winkel erfolgt. Auch kann bei einer Schrägbeleuchtung die sichtbare Auflösung ggf. verbessert werden. Unter diesen Asoekten könnte man den Reflexionskontrast gewissermaßen als eine Weiterentwicklung des Immersionskontrastes auffassen.

Der Grund für die Namensgebung dürfte daher mehrdeutig sein: Marketing zwecks Abgrenzung von Alternativverfahren und technisch wegen des "kleinen Unterschiedes" im Lichteinfallswinkel.

Wahrscheinlich galt der Reflexionskontrast im formal-patentrechtlichen Sinnen schon als etwas Neues, da dessen Evaluierung seinerzeit seitens Deutscher Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert wurde. Ob, und wenn ja, welche Patente Leitz seinerzeit eingereicht hatte, ist mir nicht bekannt.

Die noch ältere Zeiss-Auflichtmethode (Antiflex) kenne ich ehrlich gesagt nicht, so dass ich vermeiden möchte, hier über etwas zu schreiben, von dem ich nichts verstehe...

Beste Grüße

Jörg Piper

PS: Mit Ihrem Hinweis auf die Polarisationsmikroskopie haben Sie natürlich Recht. Ich wollte mich nur auf Hellfeld, Dunkelfeld und Floureszenz beziehen.