Dapi-Färbung v. Paraffin-Hoden-Schnitten

[Alexander Sobczak]

Hallöchen,
diese Anfrage richtet sich erstmal an alle, die schon mal generell Dapi-Färbungen von Gewebe-Schnitten gemacht haben.
Ich habe vor solche von Hoden-Schnitten zu machen, die Bouin-fixiert und in Paraffin eingebettet wurden. Beim Paraffin kam hauptsächlich Paraplast (Roth) aber auch Seraplex (Roth) zum Einsatz. Als Zwischenmedium nach einer Ethanol-Entwässerungs-Reihe kam Chloroform (Trichlormethan) zur Anwendung. Als kleinste Schnittdicke hat sich 3 µm als machbar erwiesen.

Die eigentliche Frage: Ist es grundsätzlich möglich mit solchen Schnitten Dapi-Färbungen zu machen, die dann auch noch eine halbwegs gute Qualität versprechen? An gefärbten Kunststoffschnitten werden diese wohl nicht rankommen oder?
Reicht für die Herstellung der Dapi-Färbung eine einfache Entparaffinierung und Isopropanol-Reihe aus? Oder muss etwa noch für eine Permeabilisierung gesorgt werden, damit Dapi effektiv in den Kern eindringen kann?
Was ist mit dem anderen Fluoreszenz-Kernfarbstoff Hoechst? Kann ich den auch für die Zwecke einer Zell-Differenzierung anwenden? Welche Unterschiede ergeben sich dadurch? Die Schnitte mit Hoechst sind sicher nicht so lange haltbar wie die mit Dapi und bleichen schnell aus, oder?

Hat jemand gar ein Protokoll zur Dapi-Färbung, was er mir empfehlen könnte, mit Nennung des konkreten Dapi-Farbstoffs, der verwendet wird (oder auch mit Hoechst)?

Hat jemand eventuell auch damit Erfahrungen gemacht, bei Dapi-gefärbten Schnitten (ganz besonders mit Hoden-Schnitten) eine Zelltyp-Bestimmung zu machen (Keimzellen und somatische Zellen)? Hat jemand diesbezüglich eine Meinung , ob sich Dapi-Färbungen besser als HE-Färbungen für eine Zell-Differenzierung eignen (gerade in Hinblick auf die Chromatin-Struktur)? Ist da das Dapi besser, als das Hämatoxylin/Hämalaun?
(siehe dazu auch meine Anfrage in der Rubrik "Bestimmungshilfe" mit dem Thema "Spermatogenese..." mit einigen Abbildungen)

Danke schon mal allen, die zu diesem Thema etwas beizutragen haben! :-)

Gruß, Alex

[bbb]

Hallo Alex,
ich habe 2 Jahre in der neurologischen Forschung gearbeitet und wir haben alle Organe entweder in Bouin oder Paraformaldehyd fixiert.
Bei Bouin ist eine DAPI-Färbung ohne Probleme möglich.
Auch eine Färbung mit Hoechst ist kein Problem.
Wenn du das nächste mal einbettest verwende als Intermedium bei Hoden am besten Decalin oder Methylbenzoat, daduch schrumpft der Hoden weniger, es ist besser schneidbar (ich scheide dadurch immer auf 1µm) und die Strukturen sehen fast aus wie bei Kunststoff da es kaum bis gar nicht schrumpft.
Hier eine kleine Orientierung für das Schrumpfen von Gewebe durch verschiedene Intermedia:
Chloroform - bis zu 30% Schrumpfung
Xylol und Toluol - bis zu 25%
Isopropanol - bis zu 13%
Methylbenzoat - bis zu 3%
Decalin - bis zu 3%

Also alles in allem bekommt an an Bouin fixierten Paraplast-Schnitten gute Resultate mit DAPI.
Ob allerdings die Struktur gut erhalten ist da du Chloroform verwendet hast kann ich nicht versprechen.

DAPI ist besser geeignet.
Zum einen ist die Floureszenz des DAPI (blau) besser als bei Hoechst (auch blau) und es hält sich länger.
Würdest du Hoechst H33342 oder H33258 verwenden?
Ausserdem ist die Färbung mit Hoechst aufwendiger.
Ich habe noch DAPI gefärbte Schnitte die von 2009 und 2010 sind und immer noch gut floureszieren.
Dafür habe ich sie mit einem wasserlösligen Eindeckmedium eingedeckt und nach 2 Tagen verfestigen des Mediums (in einer DUNKLEN Mappe!) habe ich sie eingefroren (in einem normalen Präparatekasten).

Bei der DAPI-Färbung kommt es auf die Konzentration des DAPI an.
Wie ich es mache:
DAPI-Stammlösung:
20mg DAPI in 100ml aqua Dest. lösen.
Gebrauchslösung:
10µl Stammlösung auf 10ml aqua Dest.
Die Stammlösung in 50µl portionieren und in Tubes einfrieren dann hält sie sich Jahre lang.
Die Paraffinschnitte entparaffinieren und mit Ethanol oder Isopropanol bis hin zum Wasser rehydrieren.
In aqua Dest gut spülen.
Färben mit DAPI für 15 Minuten.
Abspülen mit aqua Dest.
Eindecken mit einem wässrigen Eindeckmittel (zum Beispiel Aquatex oder Mowiol).
Dunkel lagern!
Es ist keine Vorbehandlung der Schnitte notwendig.

Also zur Differenzierung eignet sich DAPI am besten da der Hintergrund dunkel ist und keine anderen Strukturen stören.
Allerdings ist auch eine Eisenhämatoxylin-Färbung nach Heidenhain  zu empfehlen.
Ich mache aber auch oft ein DNA-Nachweiß mit der Feulgen-Reaktion, damit habe ich auch sehr gute Ergebnisse gehabt.

Wenn du noch Fragen hast helfe ich gern.
Ich hoffe das hilft dir schonmal.

[Alexander Sobczak]

He Max,
erst mal n fetten Dank an dich für die wirklich hilfreichen Tipps in der Dapi-Sache! Haben mit Hoechst das jetzt schon ganz gut hinbekommen, aber gerade im Hinblick auf die Langlebigkeit werden wir es garantiert mit den "wichtigen" Schnitten zukünftig mit Dapi machen! :-)
Hast du da eigentlich n ganz bestimmtes Dapi (von nem bestimmten Hersteller), welches du gerne nimmst?
Die Verdünnungsweise und das Protokoll werd ich auf jeden Fall dann mal ausprobieren. :-)

Was das Zwischenmedium anbelangt werden wir wohl erst mal nichts unternehmen. Dafür haben wir schon zu viele Hoden in der Art eingebettet und hoffen auch damit erfolgreich zu sein, auch wenn natürlich der Hinweis mit der Schrumpfung schon nicht zu vernachlässigen ist. Ich werds mir auf jeden Fall merken. :-)

Danke noch mal fürs erste,
Grüße, Alex

[bbb]

Hey Alex,
ja ich verwende ausschließlich DAPI von Carl Roth.
Es hat eine sehr hohe Reinheit und ist auch preislich sehr gut.
Gern geschehen!