Azanfärbungen

[Jürgen H.]

Liebe Mitmikroskopiker,

Im Folgenden stelle ich zwei verschiedene Azanfärbungen nebeneinander: Oben die Azanfärbung in der Variante Geidies und unten die Variante Heidenhain. Die Schnitte zeigen einen Ausschnitt aus dem Auge der eristalis. Die Fixierung erfolgte in beiden Fällen über alk. Bouin. Die Schnitte sind aus demselben Paraffinblock.





Das Färbeprotokoll von  Azan Heidenhain

Schnitte kurz in Anilinalkohol einstellen
Färben 10-15 min in vorgewärmter Azokarminlösung im Wärmeschrank bei 56°C    
Spülen in aqua dest
Differenzieren in Anilinalkohol bis nur noch die Zellkerne gefärbt sind
auswaschen in essigsaurem Alkohol
Abspülen in Aqua dest.
5%ige Wolframatophosphorsäure ca. 2 Std.
Abspülen in Aqua dest.
Anilinblau-Orange-Gemisch 1 - 2 Std.
Abspülen in Aqua dest.
Differenzieren mit 96%igem Ethanol

Hiergegen das Färbeprotokoll der Geidies Variante:

Färben in Kernechtrotlösung    30 Min. und länger.
Abspülen in Aqua dest.
Beizen in 5%iger wäßriger Wolframatophosphorsäure    10 Min. und länger.
Abspülen in Aqua dest.
1 Teil Anilinblau-Orange-Gemisch  5 Min evtl. länger.
Abspülen in Aqua dest.
Differenzieren und Entwässern mit abs. Isopropanol

Der Unterschied liegt ersichtlich in dem Farbstoff für die Kerne (Azokarmin/Kernechtrot) und den enorm abweichenden Färbezeiten.

Im Moment pröbele ich noch so ein wenig herum ohne die Theorie recht verstanden zu haben. Ich gehe davon aus, dass die Kernfärbung als elektrostatische Färbung über unterschiedliche Ladung vom Zellkern und Farbstoff funktioniert, während die Anilinblau/Orange G Färbung auf unterschiedlicher Größe der Farbstoffpartikel beruht (Siebeffekt)

Auffällig ist, dass Schnitte, die zulang im Anilinblau/Orange G liegen, bei der Geidies Variante fast nur noch blau werden. In der Heidenhain Variante liegen die Schnitte jedoch Stunden in Anilinblau/Orange. Also muss ein Zusammenhang zu den bei Heidenhain auch verlängerten Beizzeiten mit der Wolframatophosphorsäure bestehen. Richtig? Die Kernfärbung dürfte doch hier kaum den Unterschied machen.

Auffällig ist aber auch der farbliche Unterschied der Färbungen: Man möchte beim Blick aufs Färbeprotokoll meinen, dass sich Unterschiede vor allem bei der Färbung der Kerne ergeben. Aber die Unterschiede zwischen den Färbungen sind auch sonst gravierend: Die Geidies Variante ist farblich weicher, die Unterschiede  sind bei Heidenhain klarer und härter dargestellt.

Ich würde gerne mehr über die funktionalen Unterschiede der Färbungen wissen: Über den Einfluss der Wolframatophosphorsäure z.B. Was bewirkt die in der Färbung? Was geschieht, wenn ich die Zeiten variiere? Kann mir jemand helfen? Literatur?

Schöne Grüße

Jürgen

[Klaus Henkel]

Guten Morgen Jürgen H.!

Wer sich mit den Azanfärbungen beschäftigen möchte, dem empfehle ich immer zuerst die drei folgenden Artikel:

Mikrokosmos
Autor   Titel   Jahr   Bd   Seite
Geidies H   Abgeänderte Azan-Methoden. 1953/54    43  239
Zbären J   Eine Azan-ähnliche Färbung mit Kernechtrubin als Kernfarbstoff. 1966  55  286
Krauter D   Azan und Pseudo-Azan- Die "bunten" Färbungen in der Histologie.  1978    67  146

Gruß
KH

[Oecoprotonucli]

Lieber Jürgen,

aha, "jetzt geht es los" (die Schnitte sind angekommen, vielen Dank)!

Hast Du eigentlich den Romeis? Ich leider noch nicht. Ich werde wohl mal eine Ausleihe starten. Ich besitze jedoch einen alten Frédéric Roulet (Methoden der pathologischen Histologie).

Dort steht zum Beispiel, dass

Anilinblau ein saurer Farbstoff ist und zur Gruppe der Triphenylmethanfarbstoffe gehört

und

Orange G (Goldorange) ein saurer Farbstoff aus der Gruppe der Oxiazofarbstoffe ist (diese enthalten Hydroxylgruppen, außerdem saure Gruppen wie Carboxylgruppen oder Sulfonsäuregruppen).

Ich weiß nicht, was Du mit "Siebeffekt" meinst, ich denke, insgesamt spielt hier immer Salzbildung eine Rolle, also das Zusammenspiel zwischen sauren und basischen Gruppen, gegensätzlich bei Farbstoff und (behandeltem) Gewebe. Saure Strukturen haben negative Ladungen. Ich sehe hier bei allen Färbeschritten saure Lösungen(?). Manchmal spielt auch die Lipophilie/Hydrophilie eine Rolle, jedoch weiß ich nicht, ob das hier der Fall sein soll.

Als "Beizen" werden folgende Schritte eingeordnet:

1) Die Behandlung mit Anilinalkohol vor der Kernfärbung
2) Die Behandlung mit Phosphorwolframsäure vor der (essigsauren) Anilinblau-Orange-G-Färbung

Was in diesem Zusammenhang "Beizen" bedeuten soll, müsste mir auch jemand erklären...

Noch etwas:

1) Könntest Du die Fotos etwas größer machen, bitte?

2) Wäre nicht die beste Rubrik hiefür die Rubrik "Technik/Mikro-Rezepte" http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?board=15.0 ?

Viele Grüße

Sebastian

[Oecoprotonucli]

Mikrokosmos
Autor   Titel   Jahr   Bd   Seite
Geidies H   Abgeänderte Azan-Methoden. 1953/54    43  239
Zbären J   Eine Azan-ähnliche Färbung mit Kernechtrubin als Kernfarbstoff. 1966  55  286
Krauter D   Azan und Pseudo-Azan- Die "bunten" Färbungen in der Histologie.  1978    67  146

Lieber Herr Henkel und Mikrokosmos-Leser,

über Kopien der Artikel per Mail würde ich mich freuen...

Viele Grüße

Sebastian

[Jürgen H.]

Lieber Herr Henkel,

ganz herzlichen Dank für Ihre Literaturhinweise. Als ich Ihren Namen sah, klingelte bei mir etwas und siehe da, ein alter Thread: http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?1,2236,2236#msg-2236
Im Netz geht nichts verloren! Nur die Mikrokosmosartikel: So weit geht mein Mikrokosmosbestand nicht zurück. Vielleicht hat sie einer meiner Kollegen? Sonst werde ich wohl die Fernleihe bemühen müssen.

Lieber Sebastian, ja den Romeis habe ich. Zur Funktion der Färbung speziell von Azan sagt er jedoch nichts. Die Farbstoffe der Azan sind alle sauer. Die Siebfunktion bezog sich auf das Hängenbleiben von Farbstoffen nach unterschiedlicher Molekülgröße in unterschiedlich dichten Geweben. Ich meine mich zu erinnern, so etwas zur Azanfärbung einmal in der Literatur gelesen zu haben, mag mich da aber täuschen.

Mir kommt es weiterhin nicht auf die konkrete Färbung in den Schnitten an, sondern nur auf die technischen Verfahrensweisen und die Funktion der einzelnen Schritte im Färbeprotokoll. Die Bilder dienen nur der Veranschaulichung der unterschiedlichen Farbwirkungen und der Tatsache, dass sich die Unterschiede ersichtlich nicht nur auf die Kernfärbung rot beziehen.

Schöne Grüße

Jürgen

[Oecoprotonucli]

Lieber Jürgen,

Die Siebfunktion bezog sich auf das Hängenbleiben von Farbstoffen nach unterschiedlicher Molekülgröße in unterschiedlich dichten Geweben. Ich meine mich zu erinnern, so etwas zur Azanfärbung einmal in der Literatur gelesen zu haben, mag mich da aber täuschen.

Das könnte ja vielleicht auf das Anilinblau-Molekül zutreffen - wenn man es sich so anschaut (z.B. bei Wikipedia), ist es ja ziemlich groß, eher ungeladen und eher schwer wasserlöslich bzw. nur in bestimmten Formen. Außerdem könnte das angefärbte Bindegewebe die entsprechende Netzstruktur aufweisen. Chemisch gesehen gibt es da aber wohl auch relevante Gruppen (OH- COOH- und SO4-Gruppen).

Die Bilder dienen nur der Veranschaulichung der unterschiedlichen Farbwirkungen und der Tatsache, dass sich die Unterschiede ersichtlich nicht nur auf die Kernfärbung rot beziehen.

Naja, die Geschmäcker sind verschieden, ich finde halt, dass ein größeres Bild auch besser veranschaulicht - hier sind ja z.B. die Zellkerne wirklich nur sehr klein zu sehen - aber gut, es geht Dir um Anderes.

Viele Grüße

Sebastian

[Oecoprotonucli]

...Übrigens scheint mir der stärkste Unterschied der beiden Methoden ja wirklich in der Orangefärbung zu liegen. Nach Geidies ist sie deutlicher, und dort wurde kürzer gebeizt und kürzer gefärbt in diesem Schritt. Das Blau ist dagegen etwas schwächer (gleiche Färbe- und Beiz-Zeiten).

In dem Link zum Beitrag von Klaus Henkel wird ja auch darauf hingewiesen, dass das Differenzieren ausschlaggebend sein kann, und dort findet sich "10) Diff. in Iso (geht langsamer als in Ethanol 96%)" bei der Geidies-Methode. Vielleicht ist daher mehr Orange übriggeblieben?

Viele Grüße

Sebastian

[Jürgen H.]

Lieber Sebastian,

es könnte aber auch sein, dass die langen Zeiten der Wolframatophosphorsäure im Heidenhainschen Rezept zu einer vollständigeren Entfärbung der vorangegangenen  Rotfärbung des Gewebes führt oder die lange Beizung in der Säure die nachfolgende Färbung besser aufziehen lässt.

Danke fürs Mitdenken!

Jürgen

[Oecoprotonucli]

Hallo Jürgen,

es könnte aber auch sein, dass die langen Zeiten der Wolframatophosphorsäure im Heidenhainschen Rezept zu einer vollständigeren Entfärbung der vorangegangenen  Rotfärbung des Gewebes führt oder die lange Beizung in der Säure die nachfolgende Färbung besser aufziehen lässt.

Das mit der vorangegangenen Rotfärbung halte ich für eher unwahrscheinlich, weil das ja die Zellkernfärbung ist und ich hier eher die zweite Färbung der bindegewebigen Strukturen, die ich als gefärbt zu erkennen meine (auch bei der Bildgröße   ) für verantwortlich halte. Deine zweite Vermutung halte ich dagegen für plausibler. Allerdings ist das Theorie ohne Erfahrung: Färbt denn die erste Färbung auch Nicht-Zellkern-Strukturen so stark an?

Ich denke doch gerne mit, wir haben ja noch was vor mit ähnlicher oder gleicher Färbung   !

Viele Grüße

Sebastian

[Jürgen H.]

Liebe Färbeinteressierte,

nach etwas weiterer Lektüre, vor allem von Mikrokosmosartikeln, die mir ein Forumsmitglied liebenswürdigerweise  zur Lektüre zur Verfügung gestellt hat, gibt es von mir folgende die Literatur durchaus paraphrasierende Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse zur Heidenhainschen Azanfärbung:

Zu beginnen ist mit Krauters (1) Feststellung:

"Eine korrekt ausgeführte Azanfärbung  dauert mehrere Stunden, benötigt eine Vielzahl von Lösungen und gelingt nur, wenn der Ausführende über einige Erfahrungen (das bedeutet: vorangegangene Misserfolge) verfügt." (gemeint ist das Heidenhainsche Rezept) Nun dauert ja Pröbeln ziemlich lange, weshalb ich die Prinzipen dieser Färbung kennenlernen will, um das Pröbeln sinnvoll gestalten zu können und abzukürzen.

Fixierung:

Die Azanfärbung soll am besten nach einer sublimathaltigen Fixierung aber auch nach Bouin, Carnoy oder sogar nach Formalinlösungen funktionieren, Romeis (2) S. 501. Eine Sondermodifikation von Pareto wendet für Nervengewebe von Insekten  Formol Alkohol nach Tellyesniczky-Lillie an. Pareto (4) S. 165

Kernfärbung:

Gefärbt wird mit dem sauren Farbstoff Azokarmin. Damit scheidet eine Bindung des Farbstoffs an die sauren Gruppen der Nukleinsäuren des Kerns aus (im Gegensatz zur Färbung mit basischen Stoffen, die sich an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNS anlagern können.) Nach Burck (3) S. 113 f. findet vielmehr eine Niederschlagsfärbung an die im Kern ebenfalls vorkommenden basischen Proteine des Kerns durch "echte Adsorption" statt. Es handelt sich auch nach Dettner (5) S. 320 nicht um eine Diffusionsfärbung, sondern um eine Bindung des Azokarmins an das Substrat,  da sich der Farbstoff mit einer alkalischen Differenzierungsflüssigkeit innerhalb weniger Minuten entfernen lasse.

Der Farbstoff kristallisiert unterhalb von 60 Grad aus und hinterlässt dann nicht mehr zu entfernende Kristalle im Schnitt. Daher wird empfohlen, den Farbstoff zunächst zur vollständigen Lösung bei über 80 Grad zu bringen und ihn dann auf 60 Grad abzukühlen, die Schnitte einzustellen und nach der Färbung sofort ohne Abkühlung weiter zu behandeln (Krauter (1) S. 147

Differenzierung:

Die Färbung ergreift zunächst mehr oder weniger stark das gesamte Gewebe. Daher muss differenziert werden.  Durch den im Rezept angegebenen Anilinalkohol ist das Gewebe soweit zu entfärben, dass die Kerne deutlich hervortreten.  Diese Differenzierung ist also nicht vollständig durchzuführen, sondern vor der Entfärbung des gesamten Schnittes durch das Eintauchen in den essigsauren Alkohol abzubrechen. Die vollständige Differenzierung findet vielmehr durch den späteren Schritt der Beizung in der Phosphorwolframsäure statt. Dieser Schritt soll nämlich die Kernfärbung nicht mehr angreifen, während die anderen Gewebeteile weiterhin entfärbt werden (Krauter (1) S. 149. Nach Burck (3) S. 114 gelingt diese Differenzierung, weil die Beize aus einem hochkollodialem Stoff mit großer Hydrathülle bestehe, die das Azokarmin aus den groben Strukturmaschen verdränge.

Unbedingt zwischen den Schritten essigsaurer Alkohol und Phosphorwolframsäure sei jedoch ein kurzer Abspülvorgang einzuschalten, da sich sonst ein trüber Niederschlag auf dem Objektträger bilde, der kaum noch zu entfernen sei. Krauter (1), S. 149, vergessen bei Romeis (2) S. 501!!

Weitere Färbung:

Die anschließende Anilinblau/Orange G Färbung soll auf der unterschiedlichen Dispersität beider Farbstoffe beruhen.  Orange G als feindispers vorliegender Stoff durchdringe schnell in alle auch feinmaschigen Strukturen, Anilinblau als grobdispers vorliegender Stoff durchdringe zunächst nur grobe Strukturmaschen. Burck (3) S. 112. Es komme daher darauf an, die Färbung  rechtzeitig zu unterbrechen, bevor die grobdiperse Farbe die feinen Maschen erreicht habe.

Damit ist allerdings nicht erklärt, warum die Geidies Variante das Anilinblau/Orange G wesentlich kürzer anbietet (5-10 min nach Geidies novum Geidies (6) S. 239 gegenüber Heidenhain 1-3 Stunden Romeis (2) S. 501 Mölglicherweise steht die proportional im Heindenhainrezept verlängerte Zeit der Phosphorwolframsäure hiermit im Zusammenhang?

Lit:
(1) Krauter Mikrokosmos 1978, 146ff
(2) Romeis Mikroskopische Technik 17. Aufl. 1989
(3) Burck Histologische Technik 6. Aufl. 1988
(4) Pareto Mikrokosmos 1964, 165
(5) Dettmer, N und Schmidt-Rohde, J.M. nach Mitteilung von Dietrich Mebs in Mikrokosmos 1964, 329
(6) Geidies Mikrokosmos 1954, 239

Schöne Grüße

Jürgen

[Oecoprotonucli]

Hallo Jürgen,

Danke für die Zusammenfassung, sehr fleißig warst Du!

"Beizen" scheint also zunächst tatsächlich nur "Bleichen" des Gewebes zu bedeuten. Wobei doch auch, wie ich zuerst von Dir angezweifelt hatte, eine Differenzierung der vorangegangenen Färbung vorkommen kann.

Um die offenen Fragen zu beantworten, könnte man das Ganze ja systematisch untersuchen, z.B. indem man unterschiedliche Kombinationen ausprobiert, Farbstoffe einzeln weglässt etc. - das wäre eine Geduldsarbeit und es müsste für ausreichend Material gesorgt sein (Schnitte). Geht schon in Richtung Diplomarbeit, aber die gibt es ja wohl kaum noch und außerdem wäre das Thema wohl nicht ganz "forschungsaktuell".

Viele Grüße

Sebastian