LED Fluoreszenz Acridinorange

[Jürgen H.]

Liebe Fluoreszenzerleuchteten,

Lt. Literatur hat Acridinorange für RNA einen Emissionspeak bei ca 460 nm und für DNA einen Emissionspeak bei ca. 500 nm. LEDs sind ja ziemlich schmalbandig. Welche LED würde sich am ehesten eignen: Royal Blue  455nm oder Light Blue 470nm oder eine andere?

Schöne Grüße

Jürgen

[Horst Wörmann]

Hallo Jürgen,

da hast Du Emission und Absorption verwechselt, die Emission liegt bei 520 nm bzw. 650 nm, die Anregung (= Absorption) bei 502 bzw. 460 nm (nach Rost). Zeiss gibt für die Reinsubstanz Ex 422 nm und Em 520 nm an.
Anregung geht mit 470 nm, vorausgesetzt der Filtersatz stimmt; hierfür einigermaßen geeignet wäre Zeiss Filtersatz 09. Für 455 nm ist Satz 09 ungünstig (siehe Zeiss Filter- und Farbstoffdatenbank, dort kann man sehr schön sehen, wie Anregungswellenlänge, Filter und Farbstoff zusammenwirken).
Die Anregungskurven sind sehr breitbandig, da kann die Wellenlänge ruhig ein wenig daneben liegen. Aber der Filtersatz muß stimmen.

Zu Acridinorange, dessen Anwendung und Floureszenzeigenschaften hat Thilo Bauer auf der MKB-Webseite (unter Downloads, Vorträge "flourescent life cell imaging") eine Menge geschrieben.

Viele Grüße
Horst Wörmann

[Jürgen H.]

Lieber Rolf,

ja Du hast, für mich peinlicherweise, Recht, ich habe oben Emission mit Anregung sprachlich verwechselt. Vielen Dank für Deine Einschätzung. Bei mir wäre der Filtersatz wohl H3 oder I3 von Leitz, wobei I3 in etwa mit Zeiss Nr. 9 übereinstimmen würde.

Übrigens hat mich gerade die von Dir angeführte Zeissseite auf meine Frage gebracht. https://www.micro-shop.zeiss.com/index.php?s=21324325225b9cf&l=en&p=de&f=f&a=i

Wenn ich mir die dort grün angezeigte Effizienz bei Acridinorange mit Filter 9 ansehe, scheint sie mir bei Anregung mit 455nm höher zu sein als mit 470nm. Das wundert mich, weil ich auch angesichts der Anregungspeaks 470 nm für geeigneter halte. Was sehe ich da falsch? 

Schöne Grüße

Jürgen

[Horst Wörmann]

Lieber Jürgen,

ich bin zwar nicht der Rolf, aber trotzdem 

Die Effizienz ist laut Grafik bei 455 nm höher als bei 470 nm, weil ein etwas größerer Anteil des langwelligen Endes der Anregungsbande mit erfaßt wird. Maßgebend ist aber meiner Meinung nach die Fläche unter der Kurve, also das Integral.
Außerdem bezieht sich die Grafik nur auf den Reinstoff in wässriger Lösung, ist also eher Theorie. In der Praxis verändern sich sowohl Emissions- als auch Absorptionsbanden mit der chemischen Umgebung des Farbstoffs: siehe Unterschied DNA/RNA! Das Optimum erreicht man sowieso nicht, dazu müßte man durchstimmbare Filter bzw. Monochromatoren haben. Schöne Bastelaufgabe übrigens.

Viele Grüße
Horst Wörmann

[Klaus Herrmann]

ich bin zwar nicht der Rolf, aber trotzdem  Zwinkernd

Sei froh, dass er dich nicht zum Horst gemacht hat!

Ich habe mit dem 09er-Filterblock und der Royalblue-LED eine schöne intensive Acridinorange-Fluoreszenz. Bild ist zwar nicht super (es lag noch was auf der Micrasterias, und schief liegt sie auch noch dazu), aber die Fluoreszenz schon:

[Jürgen H.]

Lieber Horst,

wie schön, dass Du Dich auch mit Rolf angesprochen gefühlt hast! Ich bitte um Entschuldigung, es ist offensichtlich heute nicht mein Tag....Und Danke für die Ergänzung!

Schöne Grüße

Jürgen

[Eckhard]

Hallo,

Vielen Dank, Thilo, für diese Informationen. Die Schwierigkeit, mit Acridinorange in-vivo gefärbte Strukturen zu interpretieren, kenne ich zu genüge. Die Abhängigkeit vom pH-Wert war mir neu.


Amöbe in-vivo mit Acridinorange gefärbt. Zellkern hellgrün, Dictyosomen um den Zellkern orange, Cytoplasma grün. Bei den Algen kommt die rote Farbe durch die Autofluoreszenz des Chlorophylls zustande und der helle Punkt in der Mitte ist der durch Acridinorange gefärbte Zellkern.

Damals habe ich noch nicht mit Mikromol arbeiten können - Feinwaage etc. fehlten. Ich habe einfach eine Stammlösung angesetzt und einen Tropfen der Stammlösung mit ca. 20 ml Aqua dest verdünnt, bis nur noch der Hauch eines leichten blassen Brauntons zu sehen war, denn Acridinorange wirkt in sehr geringer Konzentration und ist schnell toxisch. Ich befördere einen Tropfen Acridinorange auf einen Objektträger und gebe die Probe hinzu. Durch Bewegen des Objektträgers vermische ich die Flüssigkeiten. Gehen die Organsimen ein, muss die Lösung weiter verdünnt werden.

Beleuchtet wird mit einer Halogenlampe und für das Bild wird nur der Zeiss Filtersatz 9 gebraucht. Blauanregung und alles über Blau wird durchgelassen.

Thilo, hast Du mal ein paar Aufnahmen, die Acridinorange mit 470 nm Anregung zeigen? Vor allem auch die pH-Wert Abhängigkeit würde mich interessieren. Man könnte den Verdaungsprozess in Vakuolen nicht nur durch Hefe mit pH-Indikator nachweisen, sondern durch die Farbänderung des Acridinorange in der Fluoreszenz. Ich bin kein Abonent der Zeitschrift "Mikroskopie", kenne also die Details Deines bestimmt interessanten Artikels nicht.

Klaus, ich kenne das Bild ja schon aber es ist immer wieder beeindruckend! Mein FdM Kandidat 

Herzliche Grüsse,
Eckhard