Giemsa Niederschlag

[piu58]

Die erste Seite ...
https://www.researchgate.net/publication/8480974_Editorial_100_Years_ago_-_Giemsa's_solution_for_staining_of_plasmodia/figures

oder hier

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/j.1365-3156.2004.01278.x

[RainerTeubner]

Hallo,

die Originalveröffentlichung von 1904 ist leider nicht digitalisiert zugänglich, aber über subito kannst Du Dir sie für kleines Geld bestellen. Achtung: 1905 schreibt sich die Zeitschrift mit "Z".

Viele Grüße

Rainer

[spectator]

Hallo,

zur Auswertung von Jochens Literaturstellen:
- H.-Ch. Burck: Histologische Technik. Thieme. Stuttgart 1966:  negativ
- H. Adam, G. Czihak: Arbeitsmethoden der makroskopischen und mikroskopischen Anatomie. G. Fischer Verlag, Stuttgart 1964
   S.228 Farblösung 15Tr. der Stammlösung auf 20ml Aqua dest.
             Färbung: Trockene Ausstriche werden... mit Methanol 5min.vorfixiert, im feuchten Zustand mit frischer GIEMSA-Färbelösung bedeckt, Färbedauer bis 30min, danach mit dest. Wasser abspülen und trocknen.... Zum Spülen bei Mißlingen der Färbung Pufferlösung(ph 6,4-6,8) verwenden.

Eine weitere ergibigere Quelle ist:
- L.Hallmann, Klinische Chemie und Mikroskopie, bei mir: Thieme, Leipzig, 6.Aufl. 1950, S.356 f.
  "Zur Herstellung derGiemsa- Gebrauchslösung wird die Stammlösung im Verhältnis 1Tr. Farblösung auf 1ccm Wasser verdünnt.... Das Farbgemisch im Mischgefäß soll nicht länger und stärker geschwenkt werden, als zur Erzielung einer homogenen Mischung erforderlich ist, da anderenfalls leicht Ausscheidungen von Farbstoff auftreten und das Farbgemisch unbrauchbar werden kann... Zur Erzielung richtiger Farbwirkung ist unbedingt erforderlich, daß das zur Verdünnung verwandte Wasser keinerlei freie Säuren... enthält. Das zur Verdünnung benötigte Wasser muß daher durch vorheriges 10 Minuten langes Kochen kohlensäurefrei gemacht werden. ...
Technik: 2. ...färben der waagerecht auf Färbebrücke liegenden Objektträger mit verdünnter Giemsa-Lösung
3. Farblösung mit Wasserstrahl von der Seite her abspülen ( nicht abkippen! ) Um besonders schön differenzierte Färbungen zuerhalten, läßt man die Präparate  mit klarem unabgekochten Wasser bedeckt ca. 1 Minute stehen"
Der Hallmann war lange Zeit das "Kochbuch" der Ärzte und brachte erprobte Methoden, zusammen mit den kleinen Tricks, die das Gelingen fördern: Hier das abgekochte, kohlensäurefreie dest.Wasser. Auch das waagerechte Färben und Abspülen statt abkippen scheint erprobt und wichtig zu sein.
Ausprobiert habe ich die Methode jedoch nicht aus Mangel an Giemsa- Stammlösung.
Viele Grüße
Helmut

[jochen53]

Hallo Helmut,

das ist sehr interessant. Immer wieder wird auf die Qualität des verwendeten Wassers Bezug genommen: Auskochen zur Entfernung von CO₂ (und O₂), Verwendung von bidest. Wasser, nicht stark rühren, nur leicht umschwenken. Zur Differenzierung nimmt man wieder nicht ausgekochtes Wasser.
Der pH-Wert von Wasser, das im Gleichgewicht mit dem CO₂ aus der Luft steht, ist etwa 5,6. also ganz leicht sauer.

Viele Grüße, Jochen

[mlippert]

Bei OT Färbungen ist das ganze viel weniger problematisch. Dann kann man die grüne Schicht abspülen. In der Küvette hat man den Luxus leider nicht... Da zieht man den OT zwangsläufig durch.
Ich vermute langsam, dass der Niederschlag das Salz aus Eosin und Azur ist...
Kochen ist ja nett, aber bis das kalt ist, ist es wieder mit CO2 gesättigt...

[jochen53]

Hallo Micha,
das wieder Auflösen von CO₂ in Wasser geht relativ langsam, da es ein diffusionskontrollierter Prozeß durch die Phasengrenzfläche gasförmig/flüssig ist und diese Diffusionsprozesse sind langsam. WEnn man das wasser in einer fast vollen Flasche oder einer fast vollen Sritzflasche aufbewahrt, ist oberhalb kaum noch Luft und CO₂ .

Viele Grüße, Jochen

[momotaro]

Hi Michael, Jochen, et al.,

falls noch nicht bekannt:
http://thomas-rh-binder.de/Downloads/pappenheimfaerbung.pdf

"Lösungen
1.  May-Grünwald (Merck - Nr. 1424). Angebrochene Flasche binnen max. 4 Wochen aufbrauchen oder
kleinere Flasche verwenden.
2.  Giemsa (Merck - Nr. 9204). Angebrochenes Gebinde max. drei Monate haltbar.
3.  Methanol  (Merck  -  Nr.  6009).  Achtung!  Methanol  ist  hygroskopisch: sofort wieder
verschließen; große Flaschen evtl. in mehrere kleine Flaschen aufteilen.
4.  Puffer
a)  aqua demineralisata 10 l
b)  NaOH (Merck Nr. 9140)  0.2 mol : 125 ml
c)  KH₂PO₄ 0.2 mol: 290 ml
d) Puffer auf pH 6.8 einstellen; etwa 2 Wochen haltbar

Färbung
Dieses  Rezept  berücksichtigt  die  1992  von  der  Firma  Merck  vorgenommene Änderung
Zusammensetzung der Giemsa-Stammlösung.
1.  10 min   Methanol (länger ist unschädlich, nicht kürzer!)
2.  7 min   1 ( bis 2) Teile May-Grünwald + 1 Teil Puffer, dann filtrieren (eher mehr May-Grünwald als
weniger!): (,,alkoholische" Färbung)
3.  keine Zwischenwässerung, nur abtropfen lassen
4.  20 min  1 Teil Giemsa + 6 Teile Puffer, dann filtrieren und dann eventuell mit KH₂PO₄  auf pH
6.8 einstellen: (,,wässrige" Färbung)
5.  kurz (10 sec)   eintauchen in Puffer
6.  4 min   in Puffer (,,Differenzierung")
7.  3 min   in Puffer
Grundsätzlich und wegen der 1992 geänderten Zusammensetzung derGiemsa- Stammlösung muss in jedem
Labor gelegentlich geprüft werden, ob bei einem pH  des  Puffers  von  6.8  die  fertig  verdünnte 
Giemsa-Lösung  noch  diesen  pH hat. Sonst den pH des Puffers verändern (zumeist Korrektur zum
sauren hin erforderlich).
Angesetzte Färbelösung (z. B. 400 ml) verwendbar für 5 Durchgänge mit je 30 Präparaten. Lösungen
täglich neu ansetzen. Präparate brauchen im Bad nicht bewegt  zu  werden.  Methanol-  und 
Färbekuvetten  stets  abdecken.  Methanol täglich frisch!
Das  Färbegeschirr  nicht  mit  Spülmitteln  reinigen,  sondern  nur  mit  dem Methanolabfall, denn
Detergenzienreste in dem meist porösen Glas der Kuvetten und der Färbegestelle können fatale
Artefakte verursachen! Leichte Blaufärbung des Färbegeschirrs  nach  Reinigung  ist  ohne  Bedeutung,  da  die 
verbliebenen Farbreste keine Färbepotenz mehr besitzen."

Vielleicht kann man auch Dr. Binder noch kontaktieren.
LG Helmut

[mlippert]

Herr Dr. Binder war so nett sich Zeit zu nehmen mit mir zu telefonieren. Ich werde seine Tipps jetzt mal umsetzen und dann berichten wie es läuft...

[mlippert]

Ein kleines Update: ich habe es mit der Hilfe von Dr. Binder geschafft, die Färbung wiederholbar zu machen und die Artefakte loszuwerden. Ich kann allerdings nicht so lang differenzieren wie in seiner Vorschrift, da dann die Neutros entfärbt sind. Daher differenziere ich nur 2 x 1 min.
Was den Niederschlag angeht, so vermute ich mittlerweile, dass das direkt das Azur-Eosinat ist, was ja auch direkt der Giemsa-Farbstoff ist. Bei neutralem pH MUSS das ausfallen, da kaum löslich. Interessanterweise ist der Niederschlag resistent gegen basische Lösung, verschwindet aber im sauren. Eigentlich müsste er doch in beiden Fällen verschwinden. Naja.
Ich habe jetzt basierend auf den Wittekind-Arbeiten noch einige Versuche mit DMSO gemacht, was auch sehr vielversprechend aussieht. Wenn ich mit den Versuchen fertig bin, schreibe ich nochmal was umfangreicheres. Ich will jetzt nur nichts Falsches schreiben...

[momotaro]

Hi Michael,

がんばって - ganbatte! (do your best, good luck, keep going).

LG Helmut