Aufkleben von PEG-Schnitten

Michael Müller · April 16, 2021, 12:02:49 NACHMITTAGS

Hallo in die Runde,

im Buch "Histotechnik" von Gudrun Lang haben ich einen Hinweis zum Strecken und Aufkleben von PEG-Schnitten gefunden:

Zitat
Die 5 μm dicken Schnitte werden auf Agarose Blöcke gestreckt und auf die Objektträger aufgeklebt. In einem nachfolgenden Pufferbad wird das PEG herausgelöst und der Agaroseblock entfernt.

Leider wurde die Methode nicht weiter ausgeführt.

Kennt jemand diese Methode und weiß genauer, wie das funktioniert?

Danke,

Michael

Bernd Miggel · April 16, 2021, 15:12:25 NACHMITTAGS

Hallo zusammen,

das würde mich auch interessieren. Vor allem, wir bekommt man mit PEG derart dünne Schnitte hin?

L.G. - Bernd

Michael Müller · April 18, 2021, 12:14:12 NACHMITTAGS

Hallo Bernd,

da diesmal erstaunlicherweise die Schwarmintelligenz des Forums versagt hat

, habe ich inzwischen die entsprechende Originalarbeit gefunden:

Gao K, Godkin JD (1991). A new method for transfer of polyethylene glycol-embedded tissue sections to silanated slides for immunocytochemistry. J Histochem Cytochem 39:537-540.

Darin wird folgende Methode beschrieben:
Man legt den PEG-Schnitt auf einen Agarose-Block (ca. 10mm x 10mm x 2mm). Diese Blöcke werden zur Elektrophorese verwendet. Auf diesen Blöcken befindet sich immer eine hauchdünne, praktisch zweidimensionale Flüssigkeitsschicht, in der sich die Schnitte ideal strecken. Diese Blöcke werden dann mit dem Schnitt nach unten aus einen silianisierten Objektträger gelegt und das ganze in Flüssigkeit gestellt. Der Block löst sich vom Objektträger und der Schnitt haftet am Objektträger.

Soweit die Theorie - für die Praxis musste ich etwas improvisieren, da ich weder Agarose-Blöcke noch silanisierte Objektträger habe. Agarose ist ein Hauptbestandteil von Agar-Agar, das man sich leicht in jedem Supermarkt besorgen kann. 30ml Wasser und ein Gramm Agar-Agar in zwei 9cm Petrischalen gegossen ergeben dann einen Film von ca. 2mm Dicke, aus dem man sich Blöcke schneiden kann. Legt man die Schnitte auf einen solchen Block, strecken sie sich sofort und ideal; PEG wird dabei entfernt.

Das Problem, diese Schnitte dann auf den Objektträger zu bekommen, habe ich (noch?) nicht gelöst, da ich mir für die Versuche keine 72 Adhäsions-Objektträger kaufen wollte. Wenn es der Schnitt zulässt ist aber ein händischer Transfer möglich. Für das Strecken der Schnitte ist die Methode zumindest ideal - ich bleibe mal dran...

Kann man eigentlich selbst eine Adhäsionsschicht auf Objektträger auftragen?

PEG erlebt bei den Profis eine Art Renaissance, da die Schnitte durch das Einbetten nicht so belastet werden. Mit "normalen" Möglichkeiten ist dann wohl ein Schnitt bis etwa 3µm möglich. Ich habe schon 5µm Schnitte gemacht, aber alles unter 15µm wird in der Nachbearbeitung / Handling schon sehr lästig und so dünne Schnitte sind meist unnötig. Wenn man härteres PEG (z. B. PEG 4000) verwendet, schaffen die Profis 0,5µm Schnitte (mit Glasmessern), die für TEM verwendet werden.

Viele Grüße

Michael

Bernd Miggel · April 19, 2021, 09:42:53 VORMITTAG

Hallo Michael,

bitte bleib an der Sache dran!

Viele Grüße

Bernd

rlu · April 20, 2021, 16:30:17 NACHMITTAGS

ZitatPEG erlebt bei den Profis eine Art Renaissance, da die Schnitte durch das Einbetten nicht so belastet werden. Mit "normalen" Möglichkeiten ist dann wohl ein Schnitt bis etwa 3µm möglich. Ich habe schon 5µm Schnitte gemacht, aber alles unter 15µm wird in der Nachbearbeitung / Handling schon sehr lästig und so dünne Schnitte sind meist unnötig. Wenn man härteres PEG (z. B. PEG 4000) verwendet, schaffen die Profis 0,5µm Schnitte (mit Glasmessern), die für TEM verwendet werden.

Hallo Michael,

habe schon etwas mit PEG herum experimentiert.
Durch die Mischung von PEG 1500 und PEG 2000 habe ich klare Blöcke gießen können.
Gießen von PEG-Blöcke
Ein Vereinskollege verwendet PEG 1500 von Roth, das soll auch gut funktionieren.
Für das Strecken und Aufkleben der Schnitte hatte ich keine Lösung.

Kennst du Profis von denen du dir diesen Prozess abschauen kannst. Vielleicht gibt es ja sogar welche hier im Forum.
Das Problem harrt schon seit längerem auf eine Lösung.
Ja, bleib dran.

Liebe Grüße
Rudolf

JoachimHLD · April 20, 2021, 18:07:35 NACHMITTAGS

Hallo,

schaut euch mal den Artikel von S.Türler Mikrokosmos, Band 61, S. 91, (1972) Ein ideales Einbettungsmittel Erfolge und Schwierigkeiten mit Polyäthylenglykol
an auf S94 steht auch etwas zu Aufkleben.

Viele Grüße
Joachim

Bob · April 20, 2021, 22:02:29 NACHMITTAGS

Hallo Michael,
als Klebemittel wäre Chromalaungelatine denkbar. Einmal geklebt ist das ziemlich beständig gegen allerlei Lösungsmittel. Die Klebeschicht soll auch von vielen Farbstoffen nicht angefärbt werden.
Rezept Chromalaungelatine:
5 g Gelatine
0,5g Chromalaun
1l Wasser

Ich habe das mal angerührt aber nicht systematisch getestet.

Viele Grüße,

Bob

Michael Müller · April 21, 2021, 08:42:47 VORMITTAG

Hallo,

es freut mich, das das Thema auf breites Interesse trifft!

Das Problem bei PEG ist nicht so sehr das Aufkleben der Schnitte, nachdem das PEG gelöst wurde. Dafür gibt es eine Menge Rezepte, von denen ich einige probiert habe und die alle mehr oder weniger gut funktionieren. Leider klappt das aber nur bei Objekten, die einen zusammenhängenden Schnitt geben. Unzusammenhängende Schnitte schwimmen beim Strecken mit Wasser unvermeidlich auf, da sich dabei die PEG-Matrix auflöst, und die Einzelteile verschieben sich bzw. überlagern sich im schlimmsten Fall. Da hilft dann das nachträgliche Aufkleben nichts mehr.
Hier erweist sich der Hauptvorteil von PEG - seine Wasserlöslichkeit - als sein Hauptnachteil, da das Strecken auf die hohe Oberflächenspannung des Wassers angewiesen ist. Diesen Widerspruch kann man nur lösen, wenn man auf das Strecken verzichten kann (wie bei der Tesafilm-Methode) oder man eine Methode findet, die beim Strecken das Aufschwimmen der Schnittbestandteile vermeidet. Da ist Paraffin klar im Vorteil, weil hier das Strecken und das Auflösen der Matrix voneinander getrennt sind.
Wegen dieses Nachteils von PEG konnte sich PEG gegenüber Paraffin nie so richtig durchsetzen. Einzig bei den typischerweise zusammenhängenden Schnitten von Pflanzen macht das nicht so viel aus und man kann die Schnitte zur Not auch freischwimmend weiterverarbeiten.
Diese Problematik machte für mich die oben erwähnte "Agarose-Methode" interessant. Hier strecken sich die Schnitte ohne zu verrutschen in der "zweidimensionalen" Wasserschicht auf dem Agarose- (oder beim Amateur Agar-) Block. Legt man einen Schnitt auf den Agar-Block, streckt er sich augenblicklich und das PEG löst sich auf. Eine mikroskopische Kontrolle ergibt dann, dass das Ergebnis nahezu perfekt ist: Einwandfrei gestreckt (es kann sich ja nichts aus der Wasserfilm heraus wölben) und gute Haftung am Block, so dass (fast) nichts verrutscht. Das Problem ist jetzt, wie man den Schnitt auf den Objektträger bekommt.
Gao und Godkin verwendeten dazu Adhäsions-Objetträger (silanisiert), auf die sie die Blöcke mit dem Schnitt nach unten legten. Diese stellten sie dann in ein Wasserbad mit einem Detergenz (irgendein Spülmittel reicht - habe ich ausprobiert). Dadurch wurde die Oberflächenspannung soweit abgesenkt, dass sich der Agarose-Block vom Objektträger nach einigen Minuten löst. Der Schnitt blieb am OT haften. Durch diese Methode konnten die Autoren das Strecken und das Aufziehen des Schnittes auf den Objektträger - ähnlich wie bei Paraffin - trennen und so den Hauptnachteil von PEG vermeiden.

Ein netter Forumskollege hat mir Adhässions-Objektträger überlassen (nochmals Danke, Helmut) und ich werde die Methode demnächst austesten und dann berichten.

Viele Grüße

Michael

Michael Müller · Mai 14, 2021, 12:39:54 NACHMITTAGS

Hallo,

ich hatte versprochen, Euch noch abschließende von meinen Klebeversuchen bei PEG-Schnitten zu berichten.
Leider muss ich sagen, dass es mir nicht gelungen ist, meine Flechtenschnitte sicher auf den Objektträgern zu befestigen. Die Schnitte halten weder auf Polysine-Objektträger noch auf silanisierten. Das scheint aber ein spezielles Problem von Flechtenschnitten zu sein, da der Schnitt hier eine eher schwammartige Strukur hat und wohl keine für die Adhäsion notwendige ebene Oberfläche besitzt. Beim Einstellen der Objektträger mit den Agar-Blöcken in das Bad mit Spülmittel-Wasser schwamm der Schnitt immer vom Objektträger ab, sobald sich der Agar-Block löste. Zumindest für Flechten ist diese Methode also nicht geeignet.
Zum Strecken der Schnitte hat es sich bewährt, die Schnitte direkt auf einen Objektträger zu legen, der mit einer dünnen Schicht Wasser mit Spülmittel bedeckt ist. Dadurch bildet das Wasser eine sehr dünne - praktisch zweidimensionale - Wasserschicht, in der sich der Schnitt nahezu ideal streckte.

Viele Grüße

Michael