Autoflureszenz?

[kmueho]

Hallo zusammen,

nachdem mein Mikroskop nun mit UV-Licht (Nah-UV mit 395nm) ausgestattet ist, habe ich mal so Allerlei unter UV betrachtet. Einschränkend muss ich erwähnen, dass ich keinen speziellen "UV-anregenden" Auflichtspiegel habe, der UV reflektiert und sichtbares Licht durchlässt. Ich habe das daher mit "normalen" 50% Halbspiegeln gemacht. Da gelangt viel bläuliches Licht ins Okular und auch in die Kamera. Keine Sorge, ich "verblitze" mir schon nicht die Augen. Ich habe zuvor mit fluoreszierenden Farbstoffen getestet, ob UV-Licht aus den Okularen kommt. Das ist aber nicht der Fall. Ich erwähne das Blaue Licht nur deshalb, weil ich den Blaukanal aus allen Bildern entfernt habe, um die durch das UV-Licht angeregten Farben besser sichtbar zu machen. Eine eventuelle Blauanregung ist somit auch entfernt.

Die hier schon gezeigten Pollen sahen ziemlich unspektakulär aus. Was mich aber erstaunt hat, ist, dass (Kiesel-)Algen unter UV-Licht rötlich schimmern. Und das Auge einer Stubenfliege grün.
Daher die Frage: Ist das tatsächlich Autofluoreszenz oder habe ich da einen anderen Effekt?

Sorry für die mäßige Bildqualität, aber um die geht es mir gerade weniger

Viele Grüße,
Kai

[reblaus]

Hallo Kai -

Chlorophyll im lebenden Organismus fluoresziert rot und das eine Zeitlang besonders stark, wenn es vorher längere Zeit dunkel gelagert war. Für Details wäre eine gesonderter, sehr langer Zwirn notwendig ...

Viele Grüße

Rolf

[anne]

UV-Schutzbrille würde ich trotzdem empfehlen.....

[Peter V.]

Hallo Kai,

Siehe Bilder. Euglena-Kultur, angestrahlt mit mit einer 395 nm LED-Taschenlampe.

Meine ganz normale Korrektionsbrille mit Kunststoffgläsern hat übrigens eine extrem geringe UV-Transmission und kann im Prinzip schon als UV-Schutzbrille angesehen werden. Wer eine normale Korrektionsbrille hat, kann bei seinem Optiker in Erfahrung bringen, welchen UV-Transmissionsgrad seine Gläser haben.
Ich selbst mikroskopiere ja ohnehin nur einäugig und lege, wenn ich (seltenst) UV verwende, einen Baader kleinen IR/UV-Cut-Filter vor das Okular (der beim meinen Orthoplan-Okularen zufällig genau in die Augenmuscheln passt. Bin aber vemrutlich übervorsichtig...

Einschränkend muss ich erwähnen, dass ich keinen speziellen "UV-anregenden" Auflichtspiegel habe, der UV reflektiert und sichtbares Licht durchlässt. Ich habe das daher mit "normalen" 50% Halbspiegeln gemacht. Da gelangt viel bläuliches Licht ins Okular und auch in die Kamera.

Ich verstehe noch nicht ganz, wie Deine UV-Illuminationseinrichtung aussieht.

Herzliche Grüße
Peter

[kmueho]

Hallo Rolf,

Chlorophyll im lebenden Organismus fluoresziert rot

Ja, das hatte ich mit auch schon gedacht, aber war mir nicht sicher. Danke für die Bestätigung.

Viele Grüße,
Kai

[kmueho]

Hallo Peter,

Ich verstehe noch nicht ganz, wie Deine UV-Illuminationseinrichtung aussieht.

Das ist nichts Besonderes. Die 50W-Halogenbirne des Auflichts wurde gegen eine 5W Cree-LED mit besagten 395nm ausgetauscht. Für die Umlenkung des (horizontalen) Auflichts auf das Objekt kommt ein normaler (=nicht speziell für UV-Licht gemachter) Reflektorschieber zum Einsatz (vielen Dank nochmal an Rolf - alias reblaus). Um die direkte Reflexion am Deckglas zu unterdrücken, werden gekreuzte Polfilter eingesetzt. Da Fluoreszenz unpolarisiertes Licht aussendet, kann man das trotzdem gut sehen.
Der Nachteil der Methode bzw. eingesetzten Technik ist, dass jede Menge Licht geschluckt wird:
50% bleiben im ersten Polfilter hängen, davon 50% im Halbspiegel, davon erneut 50% des vom Objekt emmitierten Lichts im Halbspiegel und wieder 50% im zweiten Polfilter. D.h. ganze 6% des Lichts schaffen es bis in den Okulartubus, wo erneut 50:50 auf Kamera und Okulare verteilt wird. Das ist schon ziemlich finster
Dass man überhaupt etwas sieht, ist der "brutalen" Lichtleistung der gut gekühlten LED zu verdanken.

Viele Grüße,
Kai

[Gerd Schmahl]

Hallo Kai,
eigentlich verwendet man doch Sperrfilter, im Abbildungsstrahlengang, die den kurzwelligen Anteil im Strahlengang wegschneiden, der durch Reflexion an der Probe entsteht und die oft viel geringere Floureszenz überstrahlt, die ja immer in einener längeren Wellenlänge erfolgt. Die Notwendigkeit von Polfiltern bei der Floureszenzmikroskopie erschließt sich mir nicht. Ich glaube es ist für die Polfilterfolien auch nicht so toll sie mit dieser hochenergetischen Strahlung zu beschießen. Die meisten Polarisationsfolien arbeiten im UV-Bereich auch weit schlechter (geringeren Auslöschung) als im sichtbaren Bereich. Vielleicht spielt auch das bei Deinem Aufbau eine Rolle.
Beste GRüße
Gerd

[kmueho]

Hi Adi,

das Auge finde ich richtig toll!

Danke
Wegen der langen Belichtungszeit (5 Sek je Bild) war da nix mit Video-Stacking. Daher habe ich das so nach Gefühl von Hand durchgestackt. Rechts gibt es da ein paar unscharfe Bereiche (als ich endlich fertig werden wollte) wo ganz offensichtlich die Schrittweite zu groß war. Aber das stand hier ja nicht so im Vordergrund. Dass die Facetten unter UV grün fluoreszieren finde ich (als absoluter Fluoreszenzanfänger) erstaunlich. Auch dass es ein paar weißliche Facetten gibt. Ich denke, dass diese funktionsunfähig (eventuell beschädigt) sind.

Viele Grüße,
Kai