Probleme beim Einbetten

[Eckhard]

Hallo in die Runde,

mein Isopropanol kaufe ich immer im 2,5l Gebinde (99,9%ig), und das ist ein Kunststoffbehälter, dann fülle ich es für den Gebrauch in eine 25ml Pipettenflasche. Ich vermute hier keinen nennenswerten Konzentrationsverlust durch Verdunstung.

Verdunstung ist nicht das Problem. Isopropanol ist hygroskopisch. Du verdünnst Dein Isopropanol und schleppst dadurch Wasser in die Probe. Ich würde einen Test machen:

Etwas Isopropanol mit Kupfersulfat oder Zeolith entwässern. Einen Tropfen davon auf einen Objektträger geben und Euparal drauf geben. Die selbe Prozedur mit einem Tropfen Wasser wiederholen. Deckgläser drauf und unter das Mikroskop legen.

Herzliche Grüsse
Eckhard  

[Bernhard Lebeda]

Hallo Winfried,

Deine Beobachtung

Hallo Wolfgang,
bei mir bilden sich kurz nach dem Eindecken mikroskopisch kleine Bläschen, die das Präparat mit einem Schleier einhüllen. Nach ca. 1-2 Wochen verschwinden sie dann meistens vollständig. Ich habe die Präparate auch schon direkt nach dem Eindecken für ca. 1 Stunde im Exsikkator unter Vakuum gesetzt, aber die mikroskopischen Bläschen sind trotzdem entstanden.

spricht meiner Meinung nach dafür, daß der Schnitt noch nicht vollständig entwässert gewesen sein könnte, mit zuviel Wasser trübt sich Euparal.

Mit der Zeit verdunstet das Wasser und die Tübung verschwindet.

Viele Grüße

Rainer

...aber dieses Zitat war die Antwort auf Wolfgangs Hinweis auf Magnacol als wasserlösliches Einschlussmittel! Das hat also mit dem einreißen nichts zu tun. Die Erfahrung mit den (sehr vielen!) Bläschen habe ich beim Einschluß von Kleininsekten in Magnacol auch gerade gemacht. Hier wird man wohl vakuumieren müssen.

Viele Mikrogrüße

Bernhard

Tante Edit: oh sorry, Winfried hatte ja vakuunmiert. Dann muss es am Magnacol liegen. Um aber vom Hauptanliegen des Threads nicht abzukommen, müssen wir das hier nicht weiter diskutieren. Ich mache weitere Versuche.

[Rolf-Dieter Müller]

Hallo Winfried,

zuerst, Deine Färbung ist sehr gut ausgefallen. Die Farben sind schön differenziert aufgezogen.

Für mich stellt sich jetzt aber bei dem von Dir geschilderten Problem die Frage, wie die Vorbehandlung war.

Wenn Du frisches Material geschnitten hast, war die Fixierung ausreichend lang, wurde die Fixierlösung auch mehrmals gewechselt? Wenn Du nur mit 70% Ethanol fixiert hast, würde ich es mit AFE (90 Teile 70% Ethanol + 5 Teile 37% Formalin + 5 Teile 100% Essigsäure) versuchen. Wenn Du kein AFE nehmen möchtest, belass die Schnitte über Stunden in 70%igem Ethanol und wechsele es mindestens 3x.

Die Trübung in Deinem Schnitt kommt mir etwas ungewöhnlich vor, was auf nicht vollständig mit Alkohol und/oder Wasser vorhandene Inhaltsstoffe verweist oder der Schnitt war noch nicht vollständig entwässert.

Euparal ist nämlich wasserverträglich. Ich selbst habe es noch nicht versucht, aber eine Einbettung sollte auch mit wasserverdünntem Alkohol (70%- bis 80%igem Ethanol) gelingen.

Bei einer Stückfixierung (ca. 5 mm lange Stücke 24 Stunden fixieren und dann schneiden) dürfte das Material genügend gehärtet sein und die Schnitte nicht mehr einreißen. Sollte es immer noch der Fall sein, dann könntest Du zwischen Entwässerung mit 100% Isopropylalkohol und Einschluss in Euparal noch eine Zwischenstufe mit einer Lösung aus 2/3 Isopropylalkohol und 1/3 Euparal einschieben.

Das von Dir gezeigte Einreißen der Schnitte passiert mir auch schon, aber nur bei schnittfixierten Proben.

Noch zu ungewöhnlichen und unerklärlichen Lufteinschlüssen: Wenn ich im Sommer abends auf dem Balkon Dauerpräparate mache, sind sie in der Regel verdorben, weil voller Lufteinschlüsse (Nein, es regnet nicht. Schönster Sonnenuntergang bei wolkenfreiem Himmel). Mit gleichem Prozess, gleichen Reagenzien und am selben Abend gelingen sie in der Wohnung einwandfrei.

Viele Grüße
Rolf-Dieter

[Fahrenheit]

Lieber Rolf-Dieter,

ich würde vermuten, dass draussen auf dem Balkon z.B. durch den immer vorhandenen leichten Luftzug das isopropanol schneller verdunstet und Du so weniger Zeit zum Auftropfen des Euparals hast. Hier könnte Deine eigene Medizin helfen: eine Zwischenstufe aus Isopropanol und Euparal. Damit dürfte das Übertragen auf den OT und das anschließende Auftropfen des Euparals unkritisch werden.

Das von Dir geschilderte Phänomen kenne ich auch von "Drinnen": ich hatte es auch, als ich mir einmal zu viel Zeit gelassen hatte. 

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Lieber Freunde,

hier kurz nachgelegt: Bilder von dem von mir feucht eingedeckten Präparat und einem Vergleichspräparat aus der selben Serie. Es handelt sich um einen Lavendel-Spross in Wacker-Färbung, die Schnitte stammten seinerzeit von Rolf-Dieter und haben eine Dicke von 30 µm. Die Präparation habe ich im September 2009 gemacht und das Eindeckmittel ist Euparal.

Bild 1: So sah ein "gutes" Präparat 2009 aus:


Bild 2: Hier das feucht eingedeckte Präparat einige Tage nach dem Eindecken, Anfang Oktober 2009:

Die Wassertropfen sind gut zu erkennen, sie liegen auf dem OT auf. Ob die deutlich andere Farbwirkung etwas mit dem Wassergehalt zu tun hat, oder auf einer anderen Belichtung beruht, kann ich heute leider nicht mehr nach vollziehen.

Bild 3: So sieht das feucht eingedeckte Präparat heute aus (sorry, schnelles Bild ...):

Das Wasser ist weg und ein Großteil des Acridinrots auch.

Bild 4: Und hier ebenso auf die Schnelle das Vergleichspräparat nach 4 Jahren:


Herzliche Grüße
Jörg

[Klaus Herrmann]

Lieber Jörg,

schöne Dokumentation!

Kleine Anmerkung zur Farbveränderung der wasser-feucht eingedeckten Probe: das ist sicher der Effekt, dass die Rotkomponente (Acridinrot) von wässrigen Alkoholen leicht ausgezogen wird.

[Fahrenheit]

Lieber Klaus,

Du hast natürlich Recht, eine Dauerdifferenzierung unter dem Deckglas.


Herzliche Grüße
Jörg

[Winfried Todt]

Hallo in die Runde,

ich denke, dass ich den ersten Ansatzpunkt gefunden habe, nachdem Jörg uns seine Bilder vom Lavendel gezeigt hat. Bild Nr. 2 (feucht eingedecktes Präparat) zeigt in etwa die Bläschenbildung wie sie bei meinen Präparaten auch zu sehen ist. Die Bläschen- oder Tropfenbildung verschwindet zwar bei mir wieder, zeigt mir jetzt aber, dass die Probe wohl nicht richtig entwässert wurde. Hier werde ich zuerst den Prozess verbessern und Euch von den Ergebnissen berichten. Danke für die vielen Hinweise.

Herzliche Grüße
Winfried

[Winfried Todt]

Verehrtes Forum,

ich habe den Prozess des Färbens und Einbettens penibel genau, gemäß der Anleitung des MBK ausgeführt { http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Faerbeanleitung_Etzold_gruen_100624.pdf }.
Da ich ein "Beute-Lipper" bin, also ein Zugereister, und die sind noch sparsamer als die echten Lipper, habe ich für die Entwässerung der Schnitte, die Färbung mit Etzold-grün und die anschließenden Alkoholphasen meine Tüpfelplatte benutzt. Die Ergebnisse besserten sich zwar ein wenig, waren aber für mich nicht überzeugend genug, erst als die Dosis erhöhte, wurden die Ergebnisse besser. Es kam jetzt mehr Alkohol zum Einsatz.


Schnittdicke ca. 15-20µm mit dem Handzylindermikrotom

Die beschriebene Bläschenbildung direkt nach dem Einbetten, war nach den Alkoholschritten mit mehr Alkohol nach dem Färben vorbei. Ich würde jetzt nach vielen Versuchen behaupten: "Wer beim Einbetten mit Euparal eine Bläschenbildung hat, der hat zu wenig Alkohol benutzt."
Danke für Eure vielen Anregungen und Hinweise.

Herzliche Grüße
Winfried

[Fahrenheit]

Lieber Winfried,

ja, das schaut doch schon mal ganz gut aus und wenn das Euparal erst mal wirklich trocken ist (das kann gut 6 Monate dauern ...  ), dann wird der Schnitt auch noch klarer.

Herzliche Grüße
Jörg

[Rolf-Dieter Müller]

Hallo Winfried,

wie Jörg schon angemerkt hat, es sieht besser aus.

Trotzdem, auch nach dem Einbetten sollte der Schnitt klarer wirken. Versuch es doch einmal nach dieser Anleitung: http://www.mikroskopie-bonn.de/_downloads/Arbeitsplan_Etzold_FCA.pdf .

Wenn Du mehr über die Färbung wissen möchtest, kann ich nur auf die Mikrofibel verweisen. Klaus Henkel hat darin die Etzold-Färbung aufgrund einer persönlichen Korrespondenz mit Prof. Etzold beschrieben. Den Verweis findest Du im Arbeitsplan.

Wenn die Färbung nicht deutlich besser wird, dann misstraue Deinem Isopropylalkohol und besorg Dir eine neue Charge. Der muss wirklich 100%ig sein.

Ein Tipp zur Beschaffung. Isopropylalkohol bekommt man üblicherweise in einer Apotheke. Es könnte sein, das ggf. nur 70%iger vorrätig ist, deshalb ausdrücklich 100% Isopropylakohol verlangen.

Viele Grüße
Rolf-Dieter

[Wutsdorff Peter]

Ein Gruß in die Runde der Schippelexperten,

Ich habe das Problem der zerrisenen Schnitte.
Hier ein Foto mit einem Datum meines Euparal.
das symbolische Gläschen kann ich nicht interpretieren.
Ich vermute, daß es das Haltb.-Datum ist.
das Abfülldatum kann es m.E. nicht sein, denn dieses EU habe ich schon wesentlich länger
Gruß Peter

[Wutsdorff Peter]

Addwndum: ich bitte um eine Adresse, wo ich Eup. erwerben kann
Gruß Peter

[Peter Reil]

Hallo Peter,

ich habe noch kein unbrauchbares Euparal gehabt. Ist es etwas zu zäh, dann mit wenig Isopropanol mischen.

Euparal bekommst du z. B. hier: https://www.bioform.de/shop.php?action=tree&wg=1&pid=707&treeid=141

Gruß
Peter

[Peter V.]

Hallo Peter,

das Symbol der Sanduhr, die unten gefüllt ist, spricht sehr dafür, dass es sich um das Ablaufdatum handelt.

Ich bin kein Schnippler, aber das Euparal dürfte wohl kaum die Ursache eines zerrissenen Schnittes zu sein.

Herzliche Grüße
Peter