Epithelzellen Fluoreszenz mit Acridinorange

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
ich weiß, solche Bilder sind schon oft gezeigt worden, aber ich habe jetzt mal alle meine Filterkombinationen durchprobiert, vielleicht ist das Ergebnis ja für jemanden interessant.

Für die Präparate (ich habe sehr viele Farbstoffe ausprobiert) habe ich Dauerpräparate der Mundhöhl-Epithelzellen erstellt. Dazu wurde ein Tropfen Abstrich mit einem Tropfen dest. Wasser zwischen zwei Objektträgern "zerrieben". Objektträger trennen, fertig. Es wurde Hitze-Fixierung verwendet (10 Min. am Kaminofen). Die Färbelösung wurde mit eine Essigsäue/dest. Wasser Mischung (pH 4-5) so weit verdünnt, dass gerade noch eine Färbung visuell wahrnehmbar war. Färbung 1h. Nach dem Trocknen wurde in CE4000 Lightfix eingedeckt, einem UV-härtenden Flüssigkunststoff.

Interessanter Weise scheint der Brechungsindex des ausgehärteten CE4000 sehr nahe am Brechungsindex der Epitherzellen zu liegen: im Durchlicht ist absolut nix zu sehen, ich dachte schon, ich habe die Objektträger aus versehen "abgewischt".

Alle Bilder sind am Fluoval 2 mit dem Apochromaten 40/0,95 entstanden. Die Kamera wurde auf 1000 ASA eingestellt. Für die Beleuchtung wurden 3 Watt LEDs verwendet, die alle auf 750 mA eingestellt wurden.

Für Fluoreszenz stehen mir die CZJ Filterwürfel 410, 450, 510 und 570-7 zur Verfügung, dazu noch zwei Filztersätze als Sperrfilter.
Anregungsfilter wurden nicht explizit verwendet, es sei denn, im Filterwürfel sind welche verbaut. Und jetzt wird es bunt:

Bild 1: LED 365 nm, Filterwürfel 410, kein zusätzliches Sperrfilter, Belichtung 2.3 sec.



Bild 2: LED 390 nm, Filterwürfel 410, kein zusätzliches Sperrfilter, Belichtung 1/6 sec.



Bild 3: LED 430 nm, Filterwürfel 450, kein zusätzliches Sperrfilter, Belichtung 1 sec.



Bild 4: LED 450 nm, Filterwürfel 510, zusätzliches Sperrfilter O261, Belichtung 1 sec.



Bild 5: LED 470 nm, Filterwürfel 510, zusätzliches Sperrfilter O261, Belichtung 1 sec.



Bild 6: LED 480 nm, Filterwürfel 510, zusätzliches Sperrfilter O261, Belichtung 1 sec.



Bild 7: LED 505 nm, Filterwürfel 570-7, kein zusätzliches Sperrfilter, Belichtung 4 sec.


Ich habe noch Experimente mit 525 nm gemacht, da ist auch noch etwas zu sehen, da wird es aber schon sehr finster.

Einen schönen 3. Advent,
Carsten

[Aljoscha]

Hallo Carsten,

Das passt zu meinen eigenen Beobachtungen. Acridinorange ist zwar in einem weiten Frequenzbereich anregbar, bringt die besten Ergebnisse aber bei Anregung zwischen 390 und 440 nm. Im sauren Milieu sind meist nur die Zellkerne und Bakterien sichtbar. Bei höherem PH-Wert wird dann die gesamte Zelle besser sichtbar.

Viele Grüße

Alexander

[Spectrum]

Hallo Carsten,
Interessante Versuchsanordnung. Ich nutze ja auch verschiedene LED-Module und habe bis auf die 430nm auch die von dir verwendeten Wellenlängen.
Ich habe schon einen Abstrich vorbereitet. Wenn ich heute, bzw. in den nächsten Tagen Zeit finde, probiere ich auch mal verschiedene Wellenlängen/Filterkombinationen aus.
Grüße Holger

[Spectrum]

Hallo Carsten,
Ich habe deine Versuchsreihe soweit wie möglich nachgestellt. Also hitzefixierter Ausstrich, leicht angesäuertes stark verdünntes Acridinorange und lange Färbedauer.
Da ich kein Kunstharz zur Verfügung wurde mit Aqua bidest+ Deckglas abgedeckt.
Aufnahme bei Iso1000.
Das verwendete Objektiv war ein Nikon Fluor 40 Apertur 1.15.
Dieser Aufbau scheint im Vergleich sehr viel lichtstärkeres Anregungslicht auf die Probe zu lenken (allein schon durch die höhere Apertur).
Zusätzlichen Informationsgehalt haben die Aufnahmen aber leider nicht. Das Acridinorange hatte wieder einmal seinen eigenen Kopf. Womöglich weicht die endgültige Konzentration der Färbelösungen zu weit voneinander ab.
Wie dem auch sei, meine Bakterien waren grün angefärbt, Zellkern und Cytoplasma ebenso.
Interessanterweise konnte ich aber diesmal auch ein außergewöhnlich starkes Photobleaching der Färbung beobachten:

Die Aufnahme entstand mit einer 3Watt LED mit Maximum bei 444nm, betrieben mit 750mA. Als Anregungsfilter wurden zwei KP490 genutzt. Strahlteiler FT 510. Sperrfilter LP 530 (Farbglas). Das Video läuft in Echtzeit.
Grüße Holger

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
interessant, ich habe kein Bleaching beobachtet. Und die Präparate funktionieren immer noch.
Carsten