Paramecium bursaria Doppelfärbung mit Acridinorange und Hoechst33342

[Spectrum]

Liebes Forum,
Siegfried war so nett und hat mir neulich einen Impfansatz mit Paramecium bursaria zugeschickt. Nachdem sich diese solide und problemlos vermehren ließen, konnte ich nun einen kleinen Teil der Kultur in einer Petrischale mit Acridinorange und Hoechst33342 versetzt für 2 Tage im dunklen Kühlschrank "marinieren".
Die Färbelösung wurde nach der Anleitung von Thilo Bauer angesetzt.

https://www.researchgate.net/publication/331803213_Fluoreszenz-Doppelfarbung_mit_Hoechst_33342_und_Acridinorange_zur_Bestimmung_der_Arten_von_Ciliaten_Phylum_Ciliophora

Abweichungen von der dort präzise angegebenen Konzentration der Farbstoffe kann ich nicht ausschließen. Allerdings war diese ausreichend gering und die Paramecien erfreuten sich auch unter Anwesenheit der Farbstoffe noch augenscheinlich bester Gesundheit.
Die Aufnahmen wurden mit einem Nikon Fluor 40er mit Apertur 1.15 (Wasserimmersion) bei UV-Anregung (365nm) mittels 3Watt LED bei 1000mA angefertigt.
Anregungsfilter KP490 um unerwünschte Grünanteile zu eliminieren. Sperrfilter sind im ersten Teil des Videos ein Langpass 440nm, später sieht man wie ich die Filterkassette mit anderen Langpassfiltern (410nm, 470nm, 500nm, 530nm) einmal durchschalte.
Strahlteiler war ein TK400 von Zeiss, den ich freundlicherweise Hr.Gerlach (Mikropit) abschwatzen durfte.
Die Ergebnisse haben mich so dermaßen positiv überrascht, daß ich sie hier zeigen möchte. Zunächst die Ergebnisse ohne weitere Nachbearbeitung:
Iso4000, 1/3sec
Hier das unbearbeitete Video:

Hier nach meiner Bearbeitung mittels Luma Fusion:

Und hier bearbeitete Fotos:
Das tapfere Individuum das hier zu sehen ist hat insgesamt ca 15min unter der Höhensonne ausgehalten bis sein Cytoskelett zerfiel:


Meine Interpretation der Ergebnisse ist folgende:
Blau angefärbt dürften der Macro und Micronucleus sein,
Rot dürften die Zoochlorellen sein, wobei es hier auch bei genauem Hinsehen zwei veschiedene "Tönungen" der Zellkompartimente gibt.
Die grünen Zellbestandteile die vor allem im Bereich des Zellmundes versammelt sind kann ich nicht zuordnen.
Über Ergänzungen meiner Erläuterungen würde ich mich wie immer freuen.
Auch steht es jedem frei die Aufnahmen nach Lust und Laune zu bearbeiten und hier einzustellen.
Grüße Holger

[Spectrum]

Nachdem ich nochmals im Forum zu dem Thema gestöbert habe, fand ich einen Artikel von Thilo Bauer selbst:

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25818.msg193699#msg193699

Dort werden viele meiner Fragen auch gleich ausführlich beantwortet.
Holger

[anne]

Lieber Holger,
ich hatte beim letzten Dörnbergtreffen die Möglichkeit Sumpfwürmer mit Triplefärbung in Fluoreszenz zu beobachten. Für mich war das wie Science Fiction. Absolut faszinierend!! Daher finde ich Deine Aufnahmen absolut genial!
lG
Anne

[Spectrum]

Hallo Anne,
Ich war auch absolut begeistert als ich das heute beobachten durfte. Mit welchen Fluorophoren waren die Spirostomum denn gefärbt?
LG Holger

[Siegfried]

Hallo Holger,
schöne Aufnahmen von Paramecium bursaria und prima, daß du den Beitrag von Thilo gefunden hast.  Ich kann ja auch am Ergaval am Auflichttubus mit Fluoreszenz arbeiten. Vielleicht im neuen Jahr mal ausprobieren. Jetzt an den Feiertagen komme ich sowieso nicht dazu.
Kinder, Enkel usw., da gehts immer rund. 
  Gruß von Siegfried

[Spectrum]

Ja Siegfried,
Machst'de richtig,
leuchtende Kinderaugen gehen vor leuchtende Pantoffeltierchen...
Ich mach jetzt auch erstmal Urlaub vom Mikroskopieren.
Bis denn
Holger

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Holger,

Wie immer sehr interessante und Wertvolle Beiträge von dir 👍🏻🙂.

Liebe Grüße Daniel

[anne]

Lieber Holger,
ich kann Dir leider die Zusammensetzung der Farbstoffe nicht sagen. Das besondere daran war, dass über die Kolibri Beleuchtung von Zeiss auch dreifach angeregt wurde.
lG
anen