Benzoesäuremethylester Methylbenzoat Niobeöl

[Jürgen H.]

Liebe Foristen,

In einigen Schriften wird bei der Paraffineinbettung Methylbenzoat als Intermedium geschildert. Zum Beispiel auch in dem lesenswerten Intermedienvergleich von Klaus Henkel:

http://www.mikroskopie-muenchen.de/paraffin-intermedien.pdf

Ich beschäftige mich ja nun mit diversen Insekten und bette sie in Paraffin ein. Dabei gehe ich über Iso 100 und ein Isoparaffingemisch ins Paraffin, ohne Verbesserung auch schon einmal über Butylalkohol. Die Schwierigkeit ist, dass die Objekte dabei oftmals ziemlich splitterig werden und schrumpfen. Chitin erweist sich - leider - eben immer wieder als extrem schwierig.

Methylbenzoat  als Intermedium wird nun oft als ein Mittel der Wahl beschrieben, wenn es gilt, schwer schneidbare Objekte besser schneidbar zu machen.  Deshalb wird wohl auch eine Einbettung über Celloidin/Methylbenzoat (nach Peterfi) gerade für chitinöse Insekten empfohlen.

Gilt dies eigentlich nur für eine Fortsetzung der Paraffineinbettung mit Benzol, das ich wegen seiner Giftigkeit nicht gerne verwenden würde, oder sollte man dieses Intermedium auch einmal in der Fortsetzung mit Iso oder Xylol ausprobieren? Die Frage kommt mir, weil kleinste Wasserreste vor der Einbettung in Paraffin als äußerst schädlich geschildert werden und Methylbenzoat geeignet ist, eben diese kleinen Wasserreste zuverlässig zu beseitigen. Gibt es Erfahrungen hierzu?

Oder kann man nach einer Behandlung mit dem Gemisch von Peterfi auch einfach über Celloidin weitergehen?

Mikrogrüße

Jürgen Harst

[Jürgen H.]

Hallo in die Runde,

eine Antwort auf die Frage habe ich mittlerweile selbst gefunden, vielleicht ist sie für den einen oder anderen von Interesse:

342 Peterfi: Eine beschleunigte Celloidin- Paraffin -Einbettung. 38,4.



Eine beschleunigte Celloidin -Paraffin -Einbettung
mit Nelkenöl- oder Methylbenzoatcelloidin.

Von
Tiberiiis Peterfi

in Jena.

Hier nachzulesen:

http://www.archive.org/stream/zeitschriftfrw38stut/zeitschriftfrw38stut_djvu.txt

Neben vielen anderen interessanten mikroskopischen Artikeln, anscheinend eine wahre Fundgrube im Netz:

Das komplette Archiv der Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und mikroskopische Technik

Was man alles so finden kann, wenn man nach Entlegenem sucht....


Mikrogrüße

Jürgen Harst

[rlu]

Hallo,


http://archive.org/stream/zeitschriftfrw38stut/zeitschriftfrw38stut_djvu.txt
Zu schade zum Verwerfen.


Sammlung der Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und mikroskopische Technik

Hier ist die korrigierte Fassung des Textes. Dabei wurden Rechtschreibung und Typografie korrigiert(Scanfehler), der Inhalt und die Grammatik blieben jedoch unverändert:



Eine beschleunigte Celloidin-Paraffin-Einbettung mit Nelkenöl- oder Methylbenzoatcelloidin

Von 
Tiberius Peterfi
in Jena.

Vor der Einbettung in Paraffin kommen die Objekte aus 95%igem oder absolutem Alkohol in eine 1%ige Nelkenöl- oder Methylbenzoatcelloidinlösung. Diese wird entweder so hergestellt, dass 1 g getrocknetes Celloidin in 100 ccm Nelkenöl oder in dem von P. Mayer empfohlenen Methylbenzoat aufgelöst wird, oder so, dass 2%iges ätheralkoholisches Celloidin mit dem einen oder dem anderen der genannten Öle zu gleichen Teilen vermengt wird. Welches Lösungsmittel verwendet werden soll, ob Nelkenöl oder Methylbenzoat, ist ohne prinzipielle Bedeutung. Wie dies schon P. Mayer feststellte, ist Celloidin in Methylbenzoat bedeutend leichter lösbar als in Nelkenöl; auch bleibt die so hergestellte Lösung dauernd hell, während das Nelkenöl mit der Zeit braun wird. Zugunsten der Methylbenzoatlösungen spricht auch meiner Erfahrung nach ihr rascheres Eindringen.

In der Ölcelloidinlösung verbleiben die Objekte je nach ihrer Größe 24 Stunden oder mehrere Tage lang, jedenfalls so lange, bis sie aufgehellt erscheinen, was als sichere Gewähr für die Durchdringung des Celloidins gelten kann. Sie werden dann einzeln in Xylol (Chloroform, Benzol) überführt und nach der üblichen Art in Paraffin eingebettet. Dem Härtegrad des verwendeten Paraffins entsprechend lassen sich aus dem so eingebetteten Material Serienschnitte, 3 bis 15 µm dick, auch in Bändern bequem schneiden. Das Schneiden und die Behandlung der Schnitte geschehen ebenso wie nach der einfachen Paraffineinbettung. Vor dieser hat das Verfahren die Vorteile, dass die Schnitte weniger zerreißlich sind und dass die bei der einfachen Paraffineinbettung fast unvermeidlichen Schrumpfungen vollkommen wegfallen.

Die Methode habe ich an einem sehr schwer schneidbaren Material, nämlich an den dotterreichen Eiern der Reptilien, an Totalquerschnitten von Eidechsenbecken sowie an den sonst in Paraffin stark schrumpfenden Hoden der Amphibien und Reptilien zu voller Zufriedenheit erprobt. In der hiesigen Anstalt für experimentelle Biologie hat sie Herrn Prof. Schaxel bei der Untersuchung experimentell erzeugter Teratome und der Amphibienaugen, den Herren H. Schneider und H. Vogel bei der Verarbeitung ihres stark chitinösen Materials ebenfalls gute Dienste geleistet.

Das Prinzip des Verfahrens besteht in der Durchtränkung der Objekte nur mit einer dünnen, und zwar mit einer öligen Celloidinlösung vor der Paraffineinbettung. Dieser Eingriff allein genügt, um die Vorteile des Celloidins mit denen des Paraffins zu vereinigen, d. h. dem Material eine tadellose Erhaltung und die für ganz dünne Schnitte nötige Schneidbarkeit zu sichern. Dass dies schon mit einer einfachen und von der üblichen Paraffintechnik kaum abweichenden Handhabung erreichbar ist, wird sofort klar, wenn man bedenkt, dass es bei der doppelten Einbettung nicht so sehr auf eine der Paraffineinbettung vorangehende regelrechte Celloidineinbettung, als vielmehr auf eine gleichmäßige Durchtränkung der Gewebsspalten mit einer gallertbildenden und im gallertigen Zustand vom geschmolzenen Paraffin leicht durchdringbaren Substanz ankommt.

Das Schwergewicht der Kombination des Celloidins mit dem Paraffin liegt meines Erachtens nicht in den dünneren Schnitten, die damit erzielt werden können; denn bei richtiger Vorbehandlung und mit einem guten Messer lassen sich auch aus Paraffin allein fast beliebig dünne Schnitte herstellen. Der große Vorteil der doppelten Einbettung besteht vielmehr darin, dass die mit einer Ölgallerte durchsetzten Gewebe auch beim Schmelzpunkt des Paraffins nicht schrumpfen, wogegen die Schrumpfung nur schwer zu verhindern ist, wenn die Gewebsspalten bloß mit stark flüchtigen Flüssigkeiten wie Chloroform, Xylol u. a. erfüllt sind. Diesem Erfordernis genügt aber schon eine ganz dünne, z. B. 1%ige Celloidinlösung, wenn sie in Ölen wie Nelkenöl oder Methylbenzoat gelöst ist. Solche dünnen Ölcelloidinlösungen dringen rasch und gut in die Gewebe ein, bilden dort mit Xylol oder Chloroform weiche Gallerten, die ihr Dispersionsmittel auch bei 60 °C festhalten und im ungeschrumpften Zustand das Paraffin leicht aufnehmen.

Dünne ätheralkoholische Lösungen sind dagegen zu diesem Zweck unbrauchbar. Die aus diesen gebildeten weichen Gallerten geben ihr Dispersionsmittel, den Ätheralkohol, im Thermostat rasch ab, und so schrumpfen sie beträchtlich zusammen, bevor sie noch mit Paraffin durchtränkt sind. Die Schrumpfung kann allerdings auch hier durch vorherige Durchtränkung mit Ölen, wie Terpineol, Chloroform, Zedernöl u. a., teilweise aufgehalten werden, ganz vermeiden lässt sie sich nie. Nur die aus konzentrierteren, z. B. 4-prozentigen ätheralkoholischen Lösungen gewonnenen Gallerten schrumpfen nach vorheriger Durchtränkung mit Ölen im Thermostat nicht mehr. Darauf beruht eben auch die Zweckmäßigkeit der Apathyschen Vorschrift, bei doppelten Einbettungen nur aus einer mindestens 4-prozentigen Celloidinlösung zu härten.

Das Eindringen der konzentrierteren Celloidinlösungen erfordert jedoch deutlich mehr Zeit und Sorgfalt bei der Behandlung, was das gesamte Verfahren in die Länge zieht. Der einzige Nachteil des ausgezeichneten Doppelteinbettungsverfahrens von Apathy ist seine lange Dauer. Sicherlich ist dies der Grund, weshalb diese so sichere und vielseitig einsetzbare Methode bisher nicht allgemeiner in Gebrauch gekommen ist. Ich arbeite seit Jahren mit ihr und die dabei gewonnenen Erfahrungen haben mich zu dieser Modifikation geführt.

Die Apathysche Einbettungstechnik ist an sich so präzise und logisch durchdacht, dass sie keiner Verbesserung bedarf. Für den alltäglichen Gebrauch, insbesondere bei einer Häufung des Untersuchungsmaterials, ist sie jedoch etwas umständlich. Der Umstand, dass die regelrechte Einbettung selbst bei Objekten von 5 mm Durchmesser mindestens 5 Tage, bei etwas größeren Objekten aber bereits über eine Woche dauert, ist für ihre Anwendbarkeit in der Histopathologie, der experimentellen Biologie und selbst in der Embryologie ein Hindernis, das nicht umgangen werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik, nämlich die Möglichkeit, ohne Schrumpfung in Paraffin einzubetten, lässt sich auch diesen Wissenschaften, die auf eine schnellere Technik angewiesen sind, zugänglich machen, wenn man in der hier beschriebenen Form nur eine dünne Ölcelloidinlösung verwendet. Die Doppelteinbettung in der klassischen Form von Apathy ist eher eine Celloidineinbettung mit nachträglicher Paraffindurchtränkung. In der Form dieser Modifikation ist es jedoch eher eine Paraffineinbettung mit vorangehender Celloidindurchtränkung.

Dasselbe Prinzip hat auch schon O. Schultze verfolgt, der ebenfalls ohne regelrechte Celloidineinbettung die Objekte nur mit einer dünnen Celloidinlösung durchtränkte und darauf über Chloroform und Zedernöl in Paraffin einbettete. Er hat jedoch eine ätheralkoholische Lösung verwendet, die als zu dünn trotz der nachträglichen Behandlung mit Zedernöl den Anforderungen nicht entsprechen konnte. Obwohl ich mit der Schultzeschen Methode auch 2 μm dicke Schnitte angefertigt habe, muss ich diese Technik als unzureichend bezeichnen, da die Schrumpfungen noch auffälliger sind als bei der üblichen Paraffineinbettung.

Das Nelkenölcelloidin wurde zu Einbettungszwecken und auch für die doppelte Einbettung bereits von Hofmann, Stepanow und Jordan benutzt. Diese Autoren gingen jedoch noch von dem Grundgedanken aus, der Paraffineinbettung eine möglichst harte Celloidineinbettung vorauszuschicken, wozu das Nelkenölcelloidin sicherlich weniger geeignet ist als die ätheralkoholische Lösung. Auch wird das eigentliche Ziel dieser Verfahren – das Celloidin durch Nelkenöl für das Paraffin durchgängig zu machen – durch die Apathysche Methode mit Härtung einer ätheralkoholischen Lösung und Überführung durch Terpineol oder ein Ölgemisch in Benzol (Xylol) in derselben Zeit, jedoch in einer viel vollkommeneren Form erreicht.

Das von P. Mayer eingeführte Methylbenzoatcelloidin ist meines Erachtens von mir zum ersten Mal methodisch angewendet worden, allerdings nur in dünner Form und nur zum Zwecke der doppelten Einbettung. Dazu hat es sich jedoch am besten bewährt.

Siehe auch:
Celloidin als Einbettungsmedium
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=15167.0