3D - Paraffinschnitte - Malinol

[rlu]

Hallo,

ich experimentiere gerade mit Paraffinschnitten. Was mir so aufgefallen ist....

Dabei wurde mit Xylol entparaffiniert. Es war naheliegend Malinol(säureneutrales Kunstharz) zum Eindecken zu testen, da man dieses nicht wie Euparal direket über Isopropanol verwenden kann.
Nach dem Färben: 3xIsopropanol, abtupfen mit Papier, 2xXylol, dann Malinol, Deckglas.
Mit Schraube oder Mutter beschwert. Der Wärmeschrank sollte im Wasser stehen, sonst rutscht das Deckglas ab.
Man riecht das Xylol im Wärmeschrank, am nächsten Tag ist der Geruch weg. Ganz anders ist das bei Euparal, der Geruch ist nach Wochen noch da.

Leider waren Luftblasen unter dem Deckglas sichtbar. Schade.
Ab in den Wärmeschrank bei 60°. Nach ein paar Stunden war das Malinol fest und konnte mit der Rasierklinge geschabt/gesäubert werden. Dabei splittert es ab, das ist nicht schön. Das Malinol unter dem Deckglas scheint weiterhin noch flüssig zu sein.
Aber die Luftblasen sind alle weg und man hat das Gefühl das Bild wird klarer und die HE-Färbung hat nachgefärbt. Dachte eigentlich, dass nur Euparal diese Selbstheilungskräfte hat.

Vielleicht macht es Sinn, dass man das Deckglas, kurz vorher in das Xylol taucht, bevor man es auflegt.

Die Hämatoxylin-Lösungen war zu alt, nach 18min unter dem Wasserstrahl war es nur braun und nicht blau.
Bei Thorns gibt es HE-Lösung zu kaufen. Die werde ich noch testen.

Mit den Paraffinblöcken und einer optimalen Einbettung in Paraffin kämpfe ich noch.
Am liebsten wäre mir die ISO-Methode vom Klaus Henkel.
Denke über einen Einbettautomaten nach. Damit könnte man den Prozeß nachvollziehbarer machen.
Die Blöcke sind nicht von mir, sondern von einem Vereinskollegen.

Das Xylol scheint sich relativ schnell zu verbrauchen. 15ml für ein Deckglas. Dann nochmal mit einer frischen Xylol-Lösung. Das frische wird dann zur Erstentparaffinierung verwendet. Das erste wird in den Sammelbehälter gegossen.

Was nehmt ihr zum Fixieren für tierisches Gewebe oder Insekten?

Wasserbad(43°C): Nicht vergessen die Luftblasen am Boden vom Topf mit einem Pinsel zu entfernen. Die Schnitte nicht zu lange schwimmen lassen(aufsteigende Luftblasen). Beim ersten Mal haben die Schnitte Pickel(Luftblasen) bekommen. Ich tue jetzt noch einen Tropfen Spüli und 40ml Spiritus dazu, auf ungefähr 1,5 Liter. Als Wasserbad wird eine temperaturgeregelte Induktionsplatte verwendet, die die Temperatur ziemlich genau hält.

Thermometer für 15€ mit Fühler und Kabel, schnell, günstig und wiederholbare Messungen

Noch ein Tipp. Das Handling mit der Spritzflasche ist eine Sauerei.
Nehme jetzt so eine kleine Dosierflasche(Nadelflasche,Quetschflasche) 10ml mit einer stumpfen Stahlspitze, damit lässt sich dosierter arbeiten.

https://www.glas-shop.com/mehrinteressanteartikel/trinkalkohol-weingeist/alkoholrechner.php
ungefähre Angaben, genau
30% Alkohol: 5.0 ml(96%): 10 ml Wasser; 1:2 ;32%
50% Alkohol: 7.5 ml(96%): 7.5ml Wasser; 1:1 ;48%
70% Alkohol: 10  ml(96%): 5.0ml Wasser; 2:1 ;64%; 11ml/4ml wäre näher dran

Das ist auch noch ein heißer Tip:
Alkoholmischungsrechner
https://www.ptaheute.de/rechner#/ethanolmischungsrechner
Damit füllt man nicht auf auf das Endvolumen auf, sondern man die Menge abwiegen.
Dazu muss natürlich, die genaue Anfangskonzentration bekannt sein
Muss das mit meinen Pyknometer testen.

Der Paraffinblock wird vorher gekühlt und kommt dann auf Eis.
Gefärbt mit HE(Hämatoxylin und Eosin) und Etzold(Pflanzenschnitt).

Die Schnitte sind nicht abgeschwommen. Was habe ich mir davor alles überlegt.
Die Objektträger wurden nicht mal abgewischt. Einfach eine neue Packung aufgemacht.
1h trocknen bei 37°, dann in den Wärmeschrank auch bei 37° über Nacht.


Die Schnitte sind mit 10µm relativ dünn. Eigentlich kein Objekt für Stacking oder 3D?
Doch!
Wer den Kreuzblick kann, wird erkennen, dass die Schärfe maximal zunimmt und auch die Lage im Raum erkennbar wird, obwohl die Schnitte so dünn sind. Dass das kein Standard ist, ist mir immer noch ein Rätsel.
Wie immer mit PICOLAY.

Liebe Grüße
Rudolf

Die 3D-Bilder sind eine andere Welt und liefern eine Schärfe, die das ursprünglich Bild nicht zeigt, obwohl es gestacked ist.
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Ösophagus













Türkenbund
das Bild ist nur aus 3-Bildern entstanden

[Gerd Schmahl]

Hallo Rudolf,
ich arbeite sehr oft mit Malinol. Wie bei allen Eindeckmitteln auf Lösungsmittelbasis möchte man zum Eindecken so wenig Lösungsmittel wie möglich unter dem Deckglas haben, damit der Schwund und damit die Gefahr von Luftblasen nicht zu groß ist. Andererseits braucht man es, damit sich das Harz gut "anlegt" (gilt auch für das Deckglas). Schnitte dürfen ja auch nie austrocknen vor dem Eindecken. Ich behelfe mir beim Malinol, indem ich es erst noch ein wenig antrocknen lasse, nachdem ich es auf das Objekt gegeben habe. Es bildet ohnehin sehr schnell eine Haut aus, die das blasenfreie Abdecken mit dem Deckglas erschwert. Deshalb feuchte ich die Seite des Deckglases mit Xylol an, die dann auf das Harz kommt. Dazu nutze ich die Trennblätter, die zwischen den Objektträgern sind. Die saugen sehr gut, aber nicht zu viel, weil sie so dünn sind. Danach muss man dann aber schnell sein, weil das Xylol auch schnell wieder verdampft. Deckglas mit Xylol zu betropfen fand ich nicht so gut. Man hat dann schnell wieder zu viel davon drauf.

Meine Objektträger mit Malinol trockne ich innerhalb von 4 bis 6 Wochen auf der Heizung. Ich mag es, wenn sich das überflüssige Harz splitternd vom Deckglasrand löst, wenn ich mit der Lanzettnadel darum herum fahre. Das kann man mit wenig (!) Xylol und Wattetupfer glätten. Ich lasse das i.d.R. weil ich ohnehin einen Deckglasring aufziehe, auch wenn der bei Malinol nur ästhetische Wirkung hat.

Die farbauffrischende Wirkung haben die meisten Eindeckmittel, die die Objekte durchdringen und somit durchsichtiger machen. Das liegt wohl vor allem daran, dass das ganze Objekt gleichmäßiger wird, was den Brechungsindex angeht. Deshalb darf bei gefärbten Objekten der Brechungsindex des Eindeckmittels gerne möglichst ähnlich sein. Es ist ja die Farbe, die den Kontrast macht. Bei ungefärbten Objekten ist das umgekehrt (Stichwort Diatomeen).

LG Gerd

[Alf]

Ich verwende gerne Malinol oder Histokitt. Nehme die OT aus dem Xylol lasse kurz das Xylol abtropfen, dann 1 Tropfen Malinol auf das Objekt, Deckglas drauf, vorsichtig etwas andrücken, um das Deckglas herum mit etwas Küchenpapier aufsaugen, trocknen lassen mind. 4 Wochen und dann überschüssiges Malinol wegkratzen.

Lg

[rlu]

Hallo,

habe jetzt ein Balsamglas, Bezugsquelle Thorns
https://www.biologie-bedarf.de/products/382411/

Letzte Vorgehensweise:
Als letzten Schritt Xylol, dann Malinol auftropfen, auf den Tropfen noch mal 50µl Xylol, Deckglas auflegen.
Wieder war eine Luftblase zu sehen, die dann aber im Wärmeschrank bei 60°C und beschwert mit einer M8 Mutter nach kurzer Zeit verschwand.

Das Xylol gibt keine homogene Schicht auf dem Deckglas, deshalb habe ich das Xylol auf das Malinol aufgeträufelt.

Das Schöne, es ist im Wärmeschrank nach 3-4h hart(stimmt nicht ganz, es ist außen hart und innen flüssig). Das Saubermachen gefällt mir weniger, weil es eben fein splittert.

Geruchssperre für das Balsamglas; unten befindet sich einer ausgeschnittener Schaumstoff




Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo,

das Hämatoxylin vom Thorns hat funktioniert.
Die Kerne werden nach wässern mit Leitungswasser(18min) blau.
Ösophagus vom Kaninchen









Hintergrundwissen:
Histologie Ösophagus - Mikroskopische Anatomie - AMBOSS Video


Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo,

hier noch ein 3D-Bild





Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo,

noch ein Bild in 3D, räumlich...
Am besten mit StereoPhoto Maker aufmachen
V = Vollbild
L = nach oben füllen

[rlu]

Hallo,

und jetzt etwas Kunst...

[Dr. Jekyll]

Moin,
Spricht eigentlich etwas dagegen histologische Schnitte mit Euparal einzudecken?

[rlu]

Hallo Harald,

ich bin von dem Geruch der persistent über Wochen bei Euparal bleibt, nicht so begeistert.
Und da ich ja Xylol zum Paraffinieren verwende hat sich Malinol angeboten.

Werde bei Gelegenheit Mountex testen. Das scheint es wieder bei Medite zu geben.
Glaube, dass das Säubern vom Objektträger leichter von statten geht.

Habe jetzt gesehen, dass obwohl der äußere Rand absolut trocken ist, im Inneren noch Schwebe-Teilchen rumschwimmen.
Das passiert vor allem dann, wenn ein Objektiv (mit Federmechanik) auf das Deckglas aufsitzt.


Aber stimmt, eigentlich ist Euparal hauptsächlich bei botanischen Schnitten angesagt, also das Mittel der Wahl?
Vielleicht können die Histologen einfach nicht so lange warten.......

Liebe Grüße
Rudolf

Übersicht, erstellt mit Affinity Photo, Panoramafunktion.
Erstaunlich wie gut das Programm mit den Helligkeitsunterschieden/Vingette zum Rand bei so vielen Bilder(20) umgeht. Es gleicht die vollständig aus. Erstaunlich...


Anpassung Magenta und Weiß

[Dr. Jekyll]

Moin Rudolf,
Nach dem Färben ist doch kein Xylol mehr im Präparat. Man geht über die Alkoholreihe zum wasserfreien Zustand und gibt erst dann wieder Xylol darauf. Stattdessen kann man doch auch Isopropanol verwenden und in Euparal einbetten, wenn man wie ich den Geruch mag. Die Frage ist nur ob sich das Euparal mit der HE-Färbung verträgt?
Früher habe ich Entellan und Xylol verwendet, aber hierbei haben sich nach einiger Zeit öfter mal die Deckgläser abgelöst.

[rlu]

Moin Harald,

ich mache da keine aufsteigende Alkoholreihe mehr, sondern gebe 3x Iso und 2x Xylol darauf, dann Malinol.

Klaus Henkel, war ja ein Fan von Depex, Malinol und Euparal. Wobei Malinol scheinbar neutraler war, als Euparal im Bezug auf der Erhalt der Farben.
Einschlußharze für die Mikroskopie von Klaus Henkel

Positiv ist, dass auch große Luftblasen verschwinden. Bin mir noch nicht sicher, ob das an den Gewichten(Mutter auf Deckglas) liegt oder weil das Lösungsmittel verdampft?
Und es soll weniger schrumpfen, was bei größeren Objekten von Vorteil sein kann. Euparal, da soll man manchmal nachtropfen müssen.


Liebe Grüße
Rudolf

[rlu]

Hallo,
hier zeige ich wie eine Blase im Malinol, vermutlich eine Luftblase verschwindet. Es könnte natürlich auch eine Xylolblase sein.
Am Vortag eingededeckt, hat sich ein riesige Blase gebildet, die praktisch den ganzen Bildausschnitt ausgefüllt hat. Ungeduldig wie ich war, habe ich mit dem Objektiv Druck ausgeübt, um die Blasen zu verschieben, was natürlich dazu geführt hat, dass der Schnitt gerissen ist.
Ich bin davon ausgegangen, dass eine Blase in dieser Größe nicht verschwindet.
Am nächsten Tag waren die kleineren Blasen weg. Die größere Blase war noch da. Sah eigentlich so aus, als hätte sich hier nichts verändert. Um Mitternacht, hat sich die Blase sichtlich verkleinert.
Das Gif zeigt einen Ausschnitt von 0:20-1:30(verschwunden), also 36h später.
Der Objektträger war die Nacht zuvor bei 60°C im Ofen. Das reicht, dass die Ränder fest werden und kein Geruch mehr wahrnehmbar ist.
Und es beweist, dass Malinol Luftblasen ausheilen kann.

12:00 eindecken
in den Ofen bei 60°C
10:00 nächster Tag aus dem Ofen Luftblasen
24:00 nur noch die große Blase ist vorhanden, aber viel kleiner
1:30  auch die letzte Blase hat sich aufgelöst
Eindeckmedium Malinol 3xIso mit 2x Xylol als Zwischenmedium.


Liebe Grüße
Rudolf

Die HE-Färbung konnte mit mit zwei Tricks verbessert werden.
Das Eosin hat zu schwach gefärbt. dann wurde Essigessenz 20% zu Eosin im Verhältnis 1:9 gemischt.
Man hätte noch filtern müssen, was ich nicht getan habe.
Komischerweise, war der Effekt nicht so stark, aber mit Zugabe von wasserverdünntem Eosin, erfolgte dann eine stärke Färbung. Immer wieder kontrolliert unter dem Mikroskop.
Dabei war dann am Ende zuviel Rot da. Dann den Objektträger wieder ins Wasser in der Hoffnung die Blau-Töne kommen wieder und das ist dann auch passiert.
Also das ist jetzt noch kein Protokoll für die Färbung, sondern ein Hinweis.




Aufnahme 0:20, die Anfangsblase hat das ganze Bild ausgefüllt.

[rlu]

Hallo,

Deckglas auflegen:

habe mich wieder erinnert, ein Tipp vom Meister.
Den Stab aus dem Harz ziehen, warten bis Tropfen entstehen.
Dreimal Tropfen lassen(dann ist es leichter auszurechnen, wann man den Stab aus dem Glas ziehen kann, ohne zu kleckern).
Dann zwei Tropfen auf den Schnitt vom Objektträger.
Dann ein sauberes Deckglas(die sind nie sauber) auf eine erhöhte Fläche legen, die kleiner ist als das Deckglas, z.B. ein Fläschchen. Objektträger umdrehen. Es bildet sich ein großer flacher Tropfen, mit diesem das Deckglas berühren. Das Deckglas saugt sich an.
Ergebnis: Wesentlich weniger Blasen.

Liebe Grüße
Rudolf

HE-Färbung mit etwas angesäuert mit Essig, damit das Eosin besser färbt.
Noch in der Erprobung:




etwas heller

[rlu]

Hallo,

was ist denn das jetzt?
Nerv, Haar oder verschluckte Alge?



Liebe Grüße
Rudolf