Mod. Ziehl-Neelson Färbung

[mm4882]

Hallo,

bin etwas verzweifelt. Habe gestern die mod. Ziehl-Neelsen Färbung angewendet, und das Ergebnis war negativ, was war falsch?

Hier der Ablauf:

1. Habe von der gekauften Teaching Suspension die Kryptosporidienoozysten enthält (habe es kontrolliert indem ich die Suspension Mikroskopiert habe) ca 1 mm großen Tropfen genommen und mit ca gleicher Menge an aufgeschwemmten Kot einer Schlange vermischt und dünn ausgestrichen. D.h. die Probe hätte auf jeden Fall positiv sein müssen und rot gefärbte Oozysten auf blauem Hintergrund zeigen müssen.

2. Trocknen lassen

3. Mit 96%igem Ethanol ("Weingeist") 5 Min fixiert - ein Prof., der selber ein Labor leitet meinte, dass ist guter Ersatz für Methanol, dass ich in Österreich ohne Giftschein nicht bekomme.

Ich verwene aber keine Färbekästchen/troge, da ich für eine Probe zu viel an Flüssigkeiten brauchen würde. Habe das Ethanol auf den Objektträger/den Ausstrich flächendeckend ordentlich aufgebracht. Nach den 5 Min Einwirkzeit war es fast zur Gänze verdampft daher habe ich nicht nachgespühlt.

4. Karbolfuchsinlösung (nach Z.-N.) wie Ethanol aufgebracht und 5 Min einwirken lassen. Der Ausstrich hat sich gut gefärbt.

5. Das Karbolfuchsin ablaufen lassen, mit einer Tropfflasche mit Wasser nachgespühlt.

6. 3%ige Salzsäurealkohol wie Ethanol aufgebracht und ca 1 Minute einwirken lassen. Dannach von Objektträger ablaufen lassen und mit Wasser aus der Tropfflasche nachgespühlt.

7. Mit Methylblau nach Löffler gegengefärbt für ca 4 Minuten.

8. Mit Wasser aus der Tropfflasche nachgespühlt.

9. Trocknen lassen.

10. Mikroskopiert - Keine einzige rote Oozyste gefunden. Hintergrund war noch leicht bläulich bzw. Kotpartikel waren grün-bläulich.

Vorschläge was passiert sein kann? Da 1ml Suspension mit Kryptosporidienoozysten ca EUR 100,- kostet, ist da so einfach mal rumprobieren zu teuer.

LG

Martin

[Klaus Henkel]

Hallo Martin!
Eine solche Färbung macht man ja nicht nach einem anonymen Handzettel, sondern man hält sich strikt an veröffentlichte Prozeßbeschreibungen. Nach welcher haben Sie gearbeitet? Autor, Titel, Erscheinungsjahr, Verlag, Seite. Und geben Sie an, an genau welcher Stelle Sie vom veröffentlichten Prozeß evtl. abgewichen sind. Sonst ist das doch nicht nachvollziehbar.
Gruß KH

[Klaus Herrmann]

Hallo Martin,

wenn ich mich recht erinnere, dann wird bei Ziehl-Neelsen kräftig erwärmt im ersten Schritt mit der Karbolfuchsinlösung.

Und bei Bakterienfärbung macht man als ersten Schritt eine Hitzefixierung, damit nachher nicht alles abschwimmt.

Kann es sein, dass Du nach Deiner Prozedur Deine teuren Oocyten abgespült hast?

Habe die Beschreibung gerade gefunden Chroma hat eine Methodenbeschreibung als PDF veröffentlicht. Ich hab die alte Papierform von 1962 hier noch. Seite 35.

[mm4882]

Hallo,

Hitzefixierung ist ein Tabu bei modifizierter (daher auch "modifiziert") ZN Färbung, da die Oozysten deformiert werden - wenngleich auch noch gefärbt nachweisbar. Die Trophozoiten im Kern sind aber nicht mehr sichtbar. Sie ähnelt bzw. ist eine Abweichung der KINYOUN Färbung (Kaltfärbung).

Es gibt daher meines Wissens keine "strikte" Vorgangsweise - ich habe 2 der Labore gefragt, zu denen ich Konakt habe, und beide weichen etwas ab - und keine der beiden hält sich starr nach der beschriebenen Methode - zumal diese ja auch im Laufe der Zeit abgeändert wurde, man braucht sich nur die verschiedenen Literaturquellen ansehen...

Es gibt so zahlreiche Beschreibungen die etwas voneinander abweichen (zB Xiao, Cryptosporidien und Cryptosporidiose; Casemore 1991: Laboratorie methods for diagnosting Cryptosporidiosis uva.). Hier eine Internetanleitung:

http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html

Einzige Unterschiede in den diversen Arbeiten/Büchern: Einwirkzeiten und dass einmal Malachitgrün, das andere mal Methylenblau als Gegenfärbung genommen wird. Manchmal ist auch von 1%igem und dann von 3%igem Salzsäurealkohol zu lesen, bzw. im angloamerikanischen Bereich von 1%iger Schwefelsäure. Da es sich um eine säurefest-Färbung handelt müsste dies aber mE egal sein.

Da ich das Karbolfuchsin nur 5 Minuten einwirken hab lassen war das meine 1. Vermutung - dürfte es nicht sein, da bei der einfachen Ausschlussfärbung nach Heine (1982) ich das Pech hatte, dass der Ausstrich erst nach 2-3 Min getrocknet war, und dabei die Oozysten schon gefärbt waren. Die Oozysten nehmen also den roten Farbstoff sehr schnell auf.

Wie gesagt, die einzige größere Adaption war, dass ich Weingeist (96% Ethanol - unvergällt) auf Anraten des Profs genommen habe. Dies hat mir aber ein Prof. eines der größen Labore hier so gesagt, daher gehe ich davon aus, dass dies OK ist.

@Klaus: Ich vermute auch, dass ich mit den Salzsäurealkohol zu lange einwirken hab lassen!? Ich habe - wie in den Färbekits vorhanden - 3%igen Salzsäurealkohol verwendet und lt. Anleitung des Kits (1-2 Minuten!) einwirken lassen!? Habe extra für die Wasserspühlungen nur eine Tropfflasche verwendet, um eben nicht alles abzuspühlen.

Kann es sein, dass sich die Suspension mit den Oozysten nicht mit dem Kot verbunden hat, bzw. nicht fixieren hat lassen?

LG

Martin

[mm4882]

Hallo,

nach Rücksprache mit Prof. H. ist nun des Rätsels Lösung bekannt:

Er sieht keinen fehler in meinem Protokoll.

1. Durch die Vermischung von "sauberem" Kot mit der nur dünn "verseuchten" Emulsion sind/waren nur wenige Oozysten auf dem Objektträger (=Sensitivitätsproblem).

2. Die Aufbewahrungs/Inaktivierungslösung (Fixierung?) hat - da ich die Probe ca 3-4 Monate im Kühlschrank hatte - den Oozystenhülle beeinträchtigt, sodass sie eben nicht mehr den Farbstoff so halten kann, wie das frische aktive Oozysten eben machen.

3. C. parvum f. Rind (dürfte in diesem Fall gewesen sein, da von einem Vet. Labor) hat ein etwas anderes Färbeverhalten als C. serpentis/saurophylum...

LG

Martin