Paraffinschneiden Probleme

[Jürgen H.]

Liebe Mitmikroskopiker,

heute morgen habe ich mit meinem kleinen Schlittenmikrotom ein paar Serienschnitte von meinen Mücken erstellt. Immer wieder gibt es hierbei Probleme, die ich anhand eines bereits gestreckten Schnittes einmal zeigen möchte:




Das 5 µ starke Schnittchen liegt also noch im Paraffin . Bei allen mit Ziffern gezeigten Stellen sieht man Löcher im Schnitt. Ich vermute, dass es bei Ziffern 1 3 und 5um Verschiebungen und Abrisse geht weil etwas Hartes das Paraffin mitzieht und aufreißt. Bei 1 dürfte es das harte Chitin sein Bei 3 ist ein schwarzer Knubbel erkennbar, den ich nicht einordnen kannund bei 5 ein kleines Knübbelchen. Bei 4 könnte die harte Chitinwand gezogen haben, ebenso bei 6?. Bei 2 findet sich jedoch rund um das Komplexauge eine Lücke. Abriss durch das Strecken? Ich habe sehr vorsichtig nur mit 30 Grad und ganz wenig Wasser gestreckt. Gibt es eine Abhilfe?

Die Schnitte sind über 100 % Iso in N-Butanol  und dann ins mehrfach gewechselte Paraffinbad überführt worden.

Was mich eigentlich auch wundert, ist die Inhomogenität des Paraffins.

Einen schönen sonnigen Sonntag wünscht

Jürgen

[Ronald Schulte]

Jürgen,

Natürlich wird es schwierig wenn hartes und weiches Material steif neben einander liegen. Das passiert bei mir auch manchmal.
Was mir auffällt ist die Inhomogenität des Paraffins aber ehrlich gesagt habe ich es auch noch nie Fotografiert.
Ich habe noch welche Schnitte liegen und werde mal sehen wie es aussieht aber bin fast sicher das es bei mir mehr Homogen ist.
Was nimmst du für Paraffin? Ich habe immer Paraplast Plus.
Es könnte sein das Dieter dir die lösung besorgen wird nachdem er deine Mücken in Technovit eingebettet hat.
Dann musst du auch dran 

Grüße Ronald

[Dieter Stoffels]

Hallo Jürgen,

die von Dir gezeigten "Fehstellen" würde ich wie folgt interpretieren:

Die Fehlstellen 1 und 2 sind auf eine Schwindung des Paraffines während der Einbettung Deiner Mücke zurückzuführen. Um die Schwindung auszugleichen löst sich das Paraffin gerne an Stellen ab, an denen kein fester Verbund zwischen Paraffin und Oberflächenstruktur (hier: Chitin) aufgebaut werden konnte. Erkennen kannst Du das am Relief des Paraffinrandes, das, wie in Punkt 2 zu sehen, den Abdruck des Facettenauges widerspiegelt. Diese Ablösung ist somit nicht erst während des Streckens, sondern bereits beim Einbetten im Rahmen der paraffinischen Schwindung entstanden. Somit müsste diese Ablösung schon am angeschnittenen Paraffinblock zu erkennen sein.

Bei dem "braunen" Knubel (Punkt 3) handelt es sich sehr wahrscheinlich um eine angeschnittene Extremität, die bei der Mücke zu allen Ebenen abstehen können.

An der Fehlstellen unterhalb des braunen Knubels (Punkt 3) und der Fehlstelle unter Punkt 5 ist etwas während des Schnittes ausgebrochen oder ausgebrochen und beim Strecken ausgewaschen worden.

Bei den Punkten 4 und 6 kann ich nicht erkennen, was dort vor sich gegangen sein soll. Ich vermute, dass sich auch hier das schwindende Paraffin während des Abkühlens von der chitinösen Oberfläche abgelöst hat.

Zum Paraffin selbst: Während des Abkühlens kristallisiert das Paraffin aus. Wird die Abkühlung unter Zimmertemperaturen durchgeführt, hat das Paraffin viel Zeit große Kristallstrukturen auszubilden. Diese wachsen, von Zentren ausgehend, aufeinander zu. Hierbei entstehen große, kleine und mittlere Kristalle (Kristallfronten). Dein inhomogenes "Wachsbild" spiegelt dieses gemischte Gefüge wider und lässt vermuten, dass Du bei Zimmertemperaturen abkühlen lässt. Je inhomogener das Gefüge ist, desto schlechter sind die Schnitteigenschaften. Aus diesem Grunde enthalten Profi-Einbettstationen eine Kühlplatte, die auf -5 Grad Celsius temperierbar ist. Bei dieser Temperatur kühlt das Paraffin schnell ab, so dass keine irregulären Gefüge ausgebildet werden können und ein Paraffin resultiert, das sich im Schnitt gut verarbeiten lässt. Für die Zukunft würde ich Dir empfehlen eine Schale im Eisfach zu lagern, in der eine ca. 1 bis 2 cm dicke Eischicht eingefroren ist. Du solltest diese Schale vor der Einbettung aus dem Eisfach nehmen und solange warten, bis sich auf der Eisoberfläche ein dünner Wasserfilm gebildet hat. Auf diesen Wasserfilm stellst Du Deine mit flüssigem Paraffin (und dem Objekt) gefüllten Einbettformen (aus dünnem Kunststoff, da so die Wandungen der Schwindung folgen können; z. B. dünnwandige Wägeschälchen). Die resultierenden Blöcke lassen sich gut  entnehmen und verarbeiten.

Viel Erfolg!

Dieter

Ps:  Die Mücken befinden sich in einem volltrunkenem Zustand!

[Ronald Schulte]

Jürgen,

So wie Dieter beschreibt kühle ich mein Paraffin auch ab. Ich gebrauche keine dünne Schalchen sonder die steife Rostfesten Typen aber das kühlt auch sehr rasch und gibt später keine schneide Probleme. Noch ein vorteil ist das sich die Blocke sehr rasch und einfach ausnehmen lassen.
Bin schon sehr neugierig wie deine Mücken sich in Technovit schneiden lasst und wie es dann nach das Farben aussieht.

Grüße Ronald

[Jürgen H.]

Lieber Dieter und lieber Ronald,

ganz herzlichen Dank für eure Beiträge zu meinen Paraffinproblemen. Ich lerne nicht aus. :-)

Bisher habe ich meine Tierchen immer in kleine selbstgefaltete Stanniolkästchen eingegossen. Das mit dem Abkühlen war mir durchaus bekannt, ich habe die gefüllten Stanniolkästchen in ein Porzellanschälchen transportiert und mit kaltem Wasser gekühlt (ohne dass auf die Oberfläche des Paraffins Wasser kam). Ich glaube, Gerlach beschreibt diese Methode. Möglicherweise kühlt das aber noch nicht rasch und energisch genug. Ich werde es einmal nach der "DieterStoffelsMethode" versuchen. Vielleicht könnte man auch ein Kühlelement mit einer Metallplatte verwenden.

Es kann allerdings vielleicht auch sein, dass die Inhomogenität von einem kleinen Zusatz von Bienenwachs herrührt. Ich fand die Empfehlung; es soll die Klebefähigkeit des Paraffins am Chitin verbessern.

Ps:  Die Mücken befinden sich in einem volltrunkenem Zustand!

Möge es ihnen gut bekommen! Ich bin sehr gespannt!!

Herzlichen Gruß

Jürgen

[Ralf Feller]

Hallo Jürgen,
ich hatte auch in der letzten Zeit enorme Probleme mit dem Schneiden. Die Paraffinblöckchen habe ich immer schon im Kühlfach aushärten lassen. Bei mir lag es an der Temperatur der Blöcke beim Schneiden, ich hatte auch noch einige Lampen um das Mikrotom herum orientiert. Nun lege ich die Blöckchen in Eiswasser vor dem Schneiden und bekomme viel bessere Ergebnisse, auch bessere Ergebnisse als mit Kältespray.
Ich denke auch oft an Semidünnschnitte und möchte ein neues Mikrotom kaufen. Mit welchem Mikrotom schneidet Ihr?

Gruß Ralf

[Ronald Schulte]

Ralf,

Ich schneide meine ParaffinBlöcke mit ein A&O 820 und das gefällt sehr gut.
Das Kühlen unmittelbar für das schneiden erfahre ich auch als absolut notwendig. Wenn ich z.B. im Sommer Schneide und warte zu lange (Kaffee Trinken) dann wird das überhaupt nichts mehr. Mein Fazit: Abkühlen und unmittelbar schneiden.
Für das Kunststoff habe ich mich gerade ein LKB Historange Motorisiertes mit Retraktion dazugelegt.

Grüße Ronald

[Jürgen H.]

Hallo Ralf,

mein Mikrotom bisher ist das 1210 von Leitz.

Ein Alterthümchen, dass es jedenfalls schon in den Roaring Twenties gab. Wie alt meines ist, weiß ich nicht. Hier ist es auf Seite 16 zu sehen.

http://www.science-info.net/docs/leitz/Leitz-Microtome-I.pdf

Der große Vorteil dieses kleinen Schlittenmikrotoms ist es, dass man mit ihm bereits die Schnittebenen in alle Richtungen auswählen kann und die Schneidegeschwindigkeit bestimmen kann. Ersteres können selbst manche neuen Rotationsmikrotome nicht.

Der Nachteil: Die Spindel erlaubt nur Schritte von 5 µ. Also kannst Du sinnvoll nur Schnittstärken von 5 µ oder 10 µ wählen. Für die von mir fürs Paraffinschneiden meist bevorzugten 7,5 µ musst Du die Ratsche, die mit dem Drehrad verbunden ist, ausstellen und musst händisch einstellen. Retraktion? Kein Problem: Wie bei der Springprozession. Zwei Schritt vor. Ein Schritt zurück. Das ist ein beschauliches Schneiden. Kannst Du viel bei Nachdenken. Und kannst schön langsam schneiden. Ein weiterer Nachteil des Schlittenmikrotoms aus meiner Sicht: Man schiebt das Paraffinband nach oben auf das Messer hinauf. Das führt schneller zu Stauchungen. Beim Rotationsmikrotom bildet sich hingegen ein nach unten hängendes Band. Das ist bei den dünnen Schnittchen nicht ohne Vorteil.

Die Kühlschrankmethode ist übrigens wunderbar und von mir bereits geübt. Ich ahne aber, dass ich meine Blöcke mit dem ganz abrupt schnellen Herunterkühlen unmittelbar nach dem Einbetten noch wesentlich verbessern kann.

Mikrogrüße

Jürgen

[Ralf Feller]

Hallo Ronald,
ich habe sehr viel von Dir und von Dieter gelernt, besonders was Temperatur anlangt, danke. Ein Historange habe ich auch einmal angesehen, hat mir auch gefallen, aber da ist viel Elektronik dran und ich hatte Angst das mir dieser Steuerkasten kaputt geht. Aber Semis sind eine tolle Sache, obwohl das sehr teuer wird, Motormikrotom, Kulzer Klingen und Messerhalter, nun ja das Technovit kostet nur 80 E, aber trotzdem viel Geld. Dafür geht das Einbetten vielleicht einfacher und man muß nicht entparafinieren. Ich habe auch einmal mit Technovit gearbeitet und das wichtigste war, das man die Präparate über Nacht in Bewegung hält.

Gruß nach Holland