Sterile Umgebung Improvisieren

[crabtack]

Ach so, sogar Klonieren geht neben dem Brenner?

Jedenfalls habe ich gerade die Platten gegossen.
Du hattest Recht, nach dem Autoklavieren waren Flocken sichtbar, die haben sich beim Schwenken aber schön aufgelöst.
Ich habe festgestellt, dass 100 ml Nährmedium für 4 bis 5 Petrischalen ausreicht
Bei einer Petrischale habe ich zu viel Agar genommen so, dass sich beim Bewegen Agar am Rand abgesetzt hat.
Die Schale werde ich 10 Minuten auf der Fensterbank stehen lassen.
Hoffentlich wächst da was.

Gepriesen sei die Rechtschreibprüfung, sosnt hätte ich 2 mal Agar falsch geschrieben...

Gruß
Olaf

[Hyperion]

Gut, hauptsache sie werden jetzt fest.

25 ml Agar sind eine gute Menge für die standarf Petrischalen, also4-5 mm hoch. Wenn du etwas größere hast dann 30 ml.

20 sind fast ein wenig wenig (es sei denn nur ÜN) , denn gerade wenn man die länger als 1-2 TAge berühten will (und vor allem bei 37 °C trocknen die oft sehr schnell aus.) Da hilft dann Parafilm oder die in einen Beutel einpacken.

Ok hab jetzt mal nen Abstrich genommen, Fotos gemacht und ausserdem 20 ml LB von der Reinkultur angeimpft, mal sehen.

[crabtack]

Gut, dann bin ich mal auf die Ergebnisse gespannt.

Das "Beimpfen" nach der Fensterbank Methode verlief zu meiner Zufriedenheit.
Nur in der Petrischale in die ich zu viel Agar gekippt habe ist der Agar nach unten gefallen.
Habe jetzt nur 10 Sekunden, 1 Minute und 5 Minuten.
Das ganze Steht jetzt auf Butterbrotbrettern mit Frischhaltefolie bedeckt auf der Heizung, bei 27°C.
Hoffentlich bilden sich ein paar Einzelkulturen, dann kann ich mich mal an der Analyse versuchen.

Gruß
Olaf

[Hyperion]

Das ganze Steht jetzt auf Butterbrotbrettern mit Frischhaltefolie bedeckt auf der Heizung, bei 27°C.
Hoffentlich bilden sich ein paar Einzelkulturen, dann kann ich mich mal an der Analyse versuchen.

Gut, nur aufpassen das es nicht höher als 39 wird, die Heizungne sind ja oft viel heißer.

Und kopf über inkubiert oder?

[crabtack]

Ja, kopfüber, hat zum Glück gehalten.

Blöderweise hat sich auf dem Boden der Petrischalen (also eigentlich der Deckel) Flüssigkeit abgesetzt.
Müsste das Kondenswasser sein.
Wie kann ich das Verhindern?
Also nach dem Aushärten des Agars waren schon Tropfen am Deckel zu sehen.
Ich konnte sie aber nicht entfernen, weil es sonst ja nicht mehr steril wäre.

Momentan liegt die Temperatur bei 32°C.


Wann glaubst du, werde ich erste Kolonien sehen?

Gruß
Olaf

[Hyperion]

Wie kann ich das Verhindern?
Also nach dem Aushärten des Agars waren schon Tropfen am Deckel zu sehen.

Indem man die Schalen nicht gleich nach dem gießen in den Kühlschrank stellt, sondern erst 1-2 Tage bei Raumtemperatur stehen lässt.

Ich nehme man an dass deine Glaspetrischalen nicht Bündig abschließen, sondern an einer STeller der Rand irgendeinen Hugel usw. hat, sodass immer ein kleinr Spalt dazwischen ist. Wenn nicht hast du leidere die flaschen gekauft.

[crabtack]

Dann habe ich die falschen gekauft
Also bei denen ist das unvermeidbar?

[Hyperion]

Ja, denn die könne sonst leider ncht trocknen, bzw findet kein Luftaustausch statt. Lassen die anderen Schalen einfach bei RT stehen und tu sie nicht in den Kühlschrank. Die werden warscheinlich auch so, langsam trocken.

Man kann bzw muss manchmal auch solche Schalen ohne nocken verwenden, wenn man z. B. irgendwelche Gärer kultiviert. Die lässt man dann nach dem gießen unter der Sterilbank ne Stunde offen stehen und dann sind die auch trocken.

Bis du was siehst, mal sehen. Ich würde sie mindestens 2-3 Tage stehen lassen.

[crabtack]

Wenn ein Luftaustausch stattfindet, können dadurch nicht Bakterien auf den Nährboden gelangen?

Also die Schalen hatte ich bei Raumtemperatur 6 Stunden stehen gelassen, da waren sie noch nicht trocken..

[Hyperion]

Lass sie über NAcht stehen.

Also so gut 24 Stunden.

Nein da kommen keine Bakterien rein. Die Schalen sollen bzw müssen nicht dichte sein.

[Hyperion]

So, hier mal ein Handybild von einem Verdünnungsaustrich der S. m. Reinkultur und daneben nem 36 h alten Kolben mit LB den ich von der Platte links angeimpft habe und der in meinem badezimmer auf meinem Plattformschüttler bei ~ 22 °C und 200 rpm inkubiert wurde. Ich echt ist der Kolben viel roter, das Handy macht einfach scheiß Farben.

Der Abstrich aus der Dusche braucht noch, da kommen dann nächste Woche auch Bilder.



Uploaded with ImageShack.us

[crabtack]

Danke für die Bilder.
Der Verdünnungsausstrich sieht sehr professionell aus

Bei mir sind mittlerweile erste Kolonien zu sehen.
Auf der 5 Minuten Platte eine Einzige kleine weiße Kolonie.

Und auf der 1 Minute Platte ein dichter Bakterienrasen am Rand.

Also so gut 24 Stunden

Ok danke, mache ich das nächste Mal.
Mittlerweile sit die Flüssigkeit aber auch so shcon fast verdunstet, ich warte mal bis Morgen.

Gruß
Olaf

*Du hast nicht ernsthaft deinen Finger zensiert?

[Hyperion]

Der Verdünnungsausstrich sieht sehr professionell aus

Es geht. Wenn man geschickt ist bringt man bis zu 10 Stufen auf eine Platte, aber hier reichen vier.

Und auf der 1 Minute Platte ein dichter Bakterienrasen am Rand.

Musst mal schauen wie es aussieht, gerade wenn es am Rand ist, könnten es auch Kontamination durch Kondenswasser oder die Fingerchen (durch herabgefallene Schüppchen what ever) sein.

Den 20 ml Kolben zentrifugier ich heute Abend ab und schau dann ob der Farbstoff mehr im Pellet oder im Überstand ist (extrahieren mit Salzsaurem EtOH, dann Absorbtionsmessung im Spektrometer). Sobald dann mein Kieselgel und ein paar Liter Lösungsmittel da sind, versuche ich mich mal an der Extraktion aus einer größeren Menge Kulturmaterial mit anschließender Säulenchromatographie. Wenn es rein genug ist und man ausreichend davon hat um ein paar Kriställchen zu sehen kann ich ja mal versuchen ein Mikrofoto davon zu machen (oder jemandem hier aus dem Forum von den Kristallern ein paar mg schicken).

Zu dem Zweck würde ich meinen selbstgebauten Continuous Flow Reaktor anwerfen und im Laufe von so 1-2 Wochen versuchen eine größere Menge Zellmasse zu erzeugen.

Evtl. werde ich auch ein wenig am Medium schrauben. Ich habe ein Paper gefunden in welchem Maltose als Kohlenstoffquelle in Kombination mit Erdnussöl die höchsten Erträge bringt. Den Reaktor könne ich auch auf 30 °C heizen (Ausbeute am höchsten), was mit dem Schüttler nicht geht weil ich den nicht in meinen Inkubator bringe.

Oder ich benutze gleich definiertes Minimalmedium mit niedrigem Phosphatgehalt.. Mal sehen. Leider habe ich bei durchschnittlich 50-60 h Arbeitszeiten pro Woche kaum Gelegenheit meinem Hobby nachzugehen....

[crabtack]

Sei froh, dass deine Arbeit auf deinem Hobby basiert

10 Stufen, omg

Hmm, ich Mikroskopiere die Kolonien einfach mal, wenn sie voll ausgewachsen sind.
Von deinem Reaktor würde ich gerne mal ein Foto sehen, wie hältst du das Teil eigentlich steril?
Und was willst du mit so viel Prodigiosin?
Hoffentlich klappt das

Gruß
Olaf

[Hyperion]

Von deinem Reaktor würde ich gerne mal ein Foto sehen, wie hältst du das Teil eigentlich steril?

Ich autoklavier es im Institut un vor dem Gebläse sind sterile Luftfilter mit Teflonfilterscheibe angebracht.

Und was willst du mit so viel Prodigiosin?

Mir ins Regal stellen? Da bekommt man aber mit nicht Hochleistungsstämmen eh nur Konzentrationen von 1-2 mg / ml raus. Also wird es nicht soooviel werden und bei der Reinigung geht bestimmt auch nochmal die Hälfte flöten.

Sei froh, dass deine Arbeit auf deinem Hobby basiert

Nicht ganz, schließlich arbeite ich in der Pathologie und da gehts hier nur am Rande um Mikrobiologie....