Primärfluoreszenz – Auflicht- und Durchlichtfluoreszenz im Vergleich

[Rolf-Dieter Müller]

Liebe Forumsmitglieder,

für mein Reisemikroskop hat mir Bernd (Nomarski) eine Durchlichtfluoreszenz gebaut, die er u.a. hier vorgestellt hat: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10933.0 und wie wir es von Bernd her kennen, hervorragend funktioniert und dieses besonders bei Sekundärfluoreszenz.

Aber wie sieht das mit Primärfluoreszenz aus, und das noch im Vergleich mit einer HBO? Um diese Frage zu beantworten, habe ich die Durchlichtfluoreszenz an ein Axioskop adaptiert, an dem ich auch die Möglichkeit für Auflichtfluoreszenz habe.

Für die Durchlichtfluoreszenz musste ich Bernd's Beleuchtung etwas modifizieren und habe dafür eine 3 Watt LED blau genommen, und zwar so wie es wilfried48 vorgeschlagen hat: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10683.msg79952#msg79952 . Die Wellenlänge ist laut technische Information mit 470 nm angegeben.

Jetzt brauchte ich noch ein geeignetes Objekt für Primärfluoreszenz. Aber was nehmen, das für den Vergleich vorzeigbare Bilder ergibt? Die Vegetationsperiode beginnt erst wieder in ein paar Wochen. Ich habe mich deshalb für Berberis Julianae (Julianes Berberitze) entschieden, die ich als immergrüne Heckenbepflanzung im städtischen Umfeld gefunden habe. Die Blattquerschnitte wurden mit dem bewährten Haga-Rasierklingenmikrotom gemacht, das besonders für solche Dünnschnitte geeignet und einfach zu verwenden ist.

Alle Aufnahmen mit Nikon 1 J1, Direktadaption wie ich sie hier beschrieben habe: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10915.msg81516#msg81516

Nachstehend das Ergebnis, das nicht weiter kommentiert werden muss.


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller

[Klaus Herrmann]

Lieber Rolf-Dieter,

Danke für die schöne Gegenüberstellung!

Auf den ersten Blick fast kein Unterschiede. Bei genauerem Hinsehen fällt auf, dass die AL-Fluo Details besser bringt und das Rot intensiver kommt.

Aber die Verhältnisse sind auch - mal abgesehen vom Unterschied AL/DL - in der Filterung nicht vergleichbar und in der Anregung schon gar nicht.

Lichtquellen:HBO und - schmalbandige - LED

als Anregungsfilter: BG12 und das BP 450-490

Sperrfilter ist identisch LP 515 aber beim Filterblock ist noch der dichroitischen Teiler dabei.

Wenn man AL/DL vergleichen wollte, was sicher interessant wäre, dann müsste man nur mit der LED beleuchten und einmal mit BG 12 und zum Vergleich mit BP 450-490 anregungsfiltern und korrekterweise einen halbdurchlässigen Teilerspiegel im AL verwenden. Aber beim Teilerspiegel könnte man zu Vereinfachung mal den dichroitischen Teiler belassen.

Du hast doch sonst nix zu tun - also mach mal! 

[Holger Adelmann]

Lieber Rolf-Dieter,

dieser Vergleich ist schwierig in der Aussage, da beide Verfahren (Auflicht, Durchlicht) mit verschiedenen Beleuchtungen und Filtern durchgeführt wurden.
Üblicherweise gibt allerdings die Auflicht Fluoreszenz nach meinen Erfahrungen die am besten definierten und klarsten Bilder was Kontrast und Hintergrundunterdrückung angehen.

Herzliche Grüsse
holger

[peter-h]

Liebe Fluoreszenzler,

wie wäre es mit einer Aufwand - Nutzen - Analyse ? Wo ist der Einsatz , Hobby oder Institut ? Wie oft kann/darf/soll ich eine HBO ein-ausschalten?
Wenn ich dann noch die Kosten vergleiche ist doch ein kleiner Qualitätsverlust sicher hinzunehmen. Ob in 10 Jahren noch jemand von HBO reden wird?

Sonntagsgrüße eines LED-Liebhabers
Peter

[Rolf-Dieter Müller]

Erst einmal vielen Dank für die hilfreichen und sachkundigen Beiträge.

Bevor ich im Einzelnen antworte, eine Anmerkung vorab. Bei beiden Fluoreszenzaufnahmen war die Belichtungszeit identisch mit einer Sekunde. Das ist die nach dem jetzigen Stand der Kamerasoftware die längste Belichtungszeit für die Nikon 1 J1 mit Bajonettadapter bei Zeitautomatik. Und aus auch nur, wenn eine Stufe Belichtungskorrektur zugeschaltet wird.

Ich war schon erstaunt über die erzielte Intensität bei meinem einfachen Aufbau zur Durchlichtfluoreszenz und enttäuscht wie wenig die Zeiss HBO 50 davon abweicht. Immerhin ist das hier Primärfluoreszenz, der Schnitt enthält keine zusätzlichen und fremden Fluoreszenzfarbstoffe und da habe ich von der HBO etwas mehr erwartet.

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Wenn man AL/DL vergleichen wollte, was sicher interessant wäre, dann müsste man nur mit der LED beleuchten und einmal mit BG 12 und zum Vergleich mit BP 450-490 anregungsfiltern und korrekterweise einen halbdurchlässigen Teilerspiegel im AL verwenden. Aber beim Teilerspiegel könnte man zu Vereinfachung mal den dichroitischen Teiler belassen.

Du hast doch sonst nix zu tun - also mach mal!
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@Klaus, vielen Dank für Deinen Arbeitsauftrag, den ich aber nicht annehmen kann, weil ich so eine interessante Untersuchung lieber anderen überlassen möchte. Du hast natürlich recht, für einen direkten Verfahrensvergleich müsste man Deinen Einwand berücksichtigen. Aber ich wollte einfach nur mal wissen, wie ist Intensität und Farbwiedergabe mit einer einfachen LED im Durchlicht. Statt jetzt weitere Versuche zu machen, nehme ich die Durchlichtfluoreszenz als schnelle und preiswerte Möglichkeit um abzuschätzen, ob es sich lohnt die HBO zu zünden. Dann ist das Warten auf die optimale Intensität etwas entspannter. Zudem ist der HBO-Betrieb eine recht teure Angelegenheit.

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Üblicherweise gibt allerdings die Auflicht Fluoreszenz nach meinen Erfahrungen die am besten definierten und klarsten Bilder was Kontrast und Hintergrundunterdrückung angehen.
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@Holger, Du bringst es wieder einmal auf dem Punkt. Genau das vermisse ich bei der gezeigten Auflichtfluoreszenz. So richtig überzeugen mich die Ergebnisse, auch die von mir bisher gezeigten, immer noch nicht. Vielleicht sollte ich mir einmal andere HBO-Lösungen anschauen.

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wie wäre es mit einer Aufwand - Nutzen - Analyse ? Wo ist der Einsatz , Hobby oder Institut ? Wie oft kann/darf/soll ich eine HBO ein-ausschalten?
Wenn ich dann noch die Kosten vergleiche ist doch ein kleiner Qualitätsverlust sicher hinzunehmen. Ob in 10 Jahren noch jemand von HBO reden wird?
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@Peter, Deine Argumente sind natürlich berechtigt. Um die Kosten in den Griff zu bekommen, werde ich künftig immer eine Vorprüfung mit der LED-Durchlichtfluoreszenz machen. Es ist sehr angenehm, wenn man die bereitgestellte Intensität sofort zur Verfügung hat und ich bin in der Entscheidung etwas unabhängiger, den Brenner nicht unnötig zu starten. Ich möchte aber auch nicht auf die HBO verzichten, da ich mich vornehmlich für Primärfluoreszenz interessiere und hierfür ganz andere Intensitäten benötigt werden als bei Sekundärfluoreszenz. Mit der Berberitze habe ich jetzt einmal ein Objekt genommen, was für Primärfluoreszenz besonders geeignet ist. Aber es muss ja nicht immer Berberitze sein.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

[Rawfoto]

Hallo Rolf-Dieter

Spannend, wirklich spannend ...

Am iPAd habe ich fast keinen Unterschied gesehen, jetzt sitze ich am Bildbearbeitungsplatz ==> 2 Eitzo CG241 W (HW-Kallibriert und Linearisiert)

Da schauen die beiden Aufnahmen sehr unterschiedlich aus und man erkennt, dass der Schwarzpunkt bei der Aufnahme mit der HBO nicht stimmt. Schwarz liegt auf der LAB-Achse in dem Beispiel bei über 25 (sollte zwischen 0 und 8 liegen). Bei der LED liegst Du auf 5, also exakt richtig ...

Ich Vergleich liegt in Deinem Beispiel die HBO weit schlechter, was aber an der Überbelichtung und dem daraus resultierenden geringeren Kontrast liegt ...

Was ich aber so spannend finde ist, die Led bringt ein wirklich gutes Ergebnis, das hätte ich nicht erwartet ...

Also auf jeden Fall besten Dank für das Zeigen, da kann ich mir wieder Gedanken machen ...

Liebe Grüße aus Wien (immer noch ohne Frost im 8.) :-))

Gerhard

[peter-h]

@ Rolf-Dieter,

meine Fragen zur Präparation. Wurde fixiert, oder nur sofort in Wasser überführt? Wie lange ist das haltbar?
Ist es nur die Belichtungszeit, welche noch eine HBO erfordert oder gibt es andere Gründe? Viele Kameras lassen doch selbst bei Automatik bis 30s zu.

Nächtliche Grüße
Peter

[Rolf-Dieter Müller]

@Gerhard, ich habe soeben noch zwei Bilder aus der Belichtungsreihe mit HBO 50 aus dem Papierkorb holen können. Diese sind mit 1 / 1,6 Sekunden und 1 / 2,5 Sekunden belichtet.




@Peter, um Artefakte zu vermeiden, mikroskopiere ich Primärfluoreszenz immer unfixiert. Es ist ein Wasserpräparat, das naturgemäß nicht haltbar ist. Man könnte aber in Glycerin oder Glyceringelatine einschließen. Hierbei lässt aber dann die Fluoreszenz des Chlorophylls merklich nach und die Präparate sind auch nur begrenzt haltbar. Also falls Du interessiert bist, könnte ich neue Schnitte machen und Dir ein Glyceringelatinepräparat zusenden.

Mich interessiert bei der HBO neben Intensität auch das zur Verfügung gestellte Spektrum.


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

[peter-h]

@ Rolf-Dieter,

danke für das Angebot, ich versuche es mal selbst. AL Fluoreszenz kann ich mit dem Zeiss-Knochen und einer blauen 3 Watt LED versuchen.

Gruß
Peter

[Rolf-Dieter Müller]

Jetzt wird es wirklich interessant. Ich habe heute von einem aufmerksamen Mitleser den Hinweis bekommen, das man auf einer Zeiss-Seite mit der interaktiven Grafik "Matching Filter Sets with Microscope Light Sources" den Zusammenhang zwischen Filtersatz und Effektivität in Abhängigkeit von der Lichtquelle überprüfen kann.

Auch von hier aus vielen Dank für den Tipp.

Die Grafik ist hier veröffentlicht: http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/matchingfiltersets/index.html
Rechts ,,Filter Set 09" auswählen und dann mit ,,Light Source" die Lichtquellen überprüfen.

Ich will das Ergebnis nicht vorweg nehmen, aber ein Hinweis sei mir schon gestattet: Peter (peter-h) wird es freuen.

Mein Setup noch einmal zusammengefasst dargestellt:

Auflichtfluoreszenz: Lichtquelle HBO 50, Filtersatz 09 = Anregung 450-490, Emission LP 515.

Durchlichtfluoreszenz: Lichtquelle LED blau 30 lm 470 nm, Anregung BG3, Emmission LP 515 (aus Zeiss Filtersatz 09).

Wie Klaus Herrmann schon richtig bemerkte, sind die von mir verwendeten Verhältnisse nicht vergleichbar. Was jetzt aber aus meiner Sicht nicht unanständig ist zu versuchen, vergleichbare Bildergebnisse mit einem weniger aufwändigen Setup zu erreichen. Die LED ist schnell am Akku angeschlossen und auf die Lichtaustrittsöffnung des Stativs gestellt. Die letzten Feinheiten kann ich ja dann immer noch und falls gewünscht nach zünden der HBO mit Auflichtfluoreszenz herausholen.

Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter

[peter-h]

Eine schöne interaktive Seite von Zeiss.
Nun glauben sicher auch Skeptiker, dass so ein kleines Leuchtdiödchen für irgend was brauchbar ist  HBO klingt eben so kräftig, aber daneben mit den Linien ist auch vorbei.
Selbst bei 365nm sollte man eine UV-LED nicht unterschätzen ! Man sieht es nicht ! Laser-Klasse 3 B ! das ist schon was.
Was habe ich damit schon gebleicht, vergilbt, oder abgetötet. Ein wertvolles Präparat würde ich heute nichtmehr mit der kleinen UV-LED bestrahlen. Man(n) lernt .

Strahlende Grüße
Peter

[Frank D.]

Hallo Rolf-Dieter,

jetzt hast Du Dir aber auch den ungünstigsten (Standard)-Filtersatz ausgesucht, den es für die HBO gibt.
Satz 09 ist für die FITC-Methode gedacht und deren Anregungswellenlänge liegt bei 490nm.
Aus diesem Grund kann für FITC auch eine normale Halogenleuchte (von Zeiss werden 100 Watt empfohlen) eingesetzt werden.

Und wenn man einmal die niedrige Intensität der HBO in 490er Bereich mit Deinem doch guten Ergebnis vergleicht wird einem sofort klar, wie stark die Anregung erst für die typischen Quecksilberlinien wäre. Und dafür sind die Sätze 02, 05 und 14 sehr gut geeignet.

Eine Sache interessiert mich aber noch.
Sind 450-490nm für die Primärfluoreszenz von Pflanzenteilen wirklich optimal?

Freundliche Grüße
Frank

[Horst Wörmann]

Hallo Frank:

"Eine Sache interessiert mich aber noch.
Sind 450-490nm für die Primärfluoreszenz von Pflanzenteilen wirklich optimal?"

Nein, ist es nicht.
Aber man erhält immerhin ein aussagekräftiges Bild, nimmt jedoch dabei geringere Intensitäten in Kauf.
Berberin z.B. geht bei 375 nm, Chlorophyll bei 434 nm optimal (beides aber gemessen in Lösung).
Für andere Fluorophore müßte ich nachsehen.
Anregung neben dem Maximum gibt immer geringere Emission, wie Du ja auch geschrieben hast.

Für ideale Ergebnisse sollte man auch mal bei anderen Wellenlängen testen.

Viele Grüße aus Bonn,
Horst Wörmann

[Rawfoto]

Hallo Horst

Mir würde jetzt ein Tipp wo Du den "optimalen" Bereich nachsiehst interessieren, gibt es da eine Tabelle ..., oder einen Link auf diese Tabelle ...

Lieber Horst-Dieter

Danke, so wie es jetzt aussieht hast Du im ersten Schritt die falschen Bilder in den Papierkorb verfrachtet :-))

Schönen Tag

Gerhard

[Werner Jülich]

Vielleicht hilft dieser Hinweis: https://www.micro-shop.zeiss.com/index.php?s=539709732d2041&l=de&p=de&f=f

Werner Jülich