Autor Thema: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz  (Gelesen 27176 mal)

Ronald Schulte

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HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« am: Februar 25, 2012, 22:51:48 Nachmittag »
Heute möchte ich mal ein Histochemische Reaktion vorführen.
In dieses Forum haben andere Histo- und Pathologie Kollegen schon mal einige Bilder gezeigt aber noch nie, vor soweit ich weis, ist beschrieben wie die Färbung vor geht.
Nachtrag: Florian Stellmacher hat hier doch schon mal beschrieben wie die Reaktion vorgeht!

Ziel dieses Präparat war: Nachweisen von dreiwertiges Eisen (Fe3+) in Makrophagen (Siderophagen).

Allgemeines: Makrophagen gehören zu den Fresszellen (Phagozyten) und sind als Leukozyten (weiße Blutkörperchen) als Zellen des Immunsystems bekannt.

Die hier vorgeführte Reaktion heißt auf Deutsch: Berlinerblau-Reaktion nach Perls. Auf Englisch: prussian blue reaction.  Eingeführt durch der Deutsche Pathologe ‘Max Perls’ (1843-1881).

Hämoglobine (von griech. αἷμα haíma ‚Blut‘ und lat. globus ‚Kugel‘),
sind eisenhaltige, sauerstofftransportierende Proteine, die in den roten Blutkörperchen (Erythrozyten) der Wirbeltiere  und ihren Varianten gefunden werden. Sie nehmen den Sauerstoff in der Lunge bzw. den Kiemen auf und verteilen ihn im Körper. Die Bindung des Sauerstoffs erfolgt an einem Eisenkomplex des Protoporphyrins IX (Häm). Wirbeltier-Hämoglobine sind Proteinkomplexe aus vier Untereinheiten (2 α, 2 β), die jeweils eine Häm-Gruppe, die in ein Globin eingebettet ist, enthalten. Die Häm-Gruppe ist außerdem für die rote Farbe des Hämoglobins verantwortlich.

Abbau von Hämoglobin,
 Wenn die roten Blutkörperchen das Ende ihres Lebens (etwa 120 Tage) erreicht haben, werden sie in den mononukleären Phagozyten hauptsächlich in der Milz (und bei hohem Anfall von abzubauendem Hämoglobin auch in der Leber und im Knochenmark) abgebaut. Der Abbauprozess beginnt in der Milz und wird in der Leber fortgesetzt. Zuerst wird der Globinanteil vom Häm getrennt und zu Aminosäuren degradiert. Das Häm wird über eine Cytochrom-P450-abhängige Oxygenase (Hämooxygenase) zu Biliverdin gespalten, wobei zweiwertiges Eisen (Fe2+) und Kohlenmonoxid frei werden. Das Eisen wird von den Makrophagen an das im Blut vorhandene Transportprotein Transferrin abgegeben.

Das Hämosiderin besteht aus Bruchstücken von Ferritin, dem wichtigsten Speicherprotein für Eisen. Chemisch handelt es sich um einen wasserunlöslichen Komplex aus Eisen und verschiedenen Proteinen; der Eisenanteil beträgt etwa 37 %. Hämosiderin ist – anders als Ferritin – keine physiologische Speicherform und lässt sich im Gegensatz zu diesem nur intrazellulär auffinden, vor allem in Makrophagen. Es hat nativ eine goldgelbe Farbe, in histologischen Schnitten kann es mit der Berliner-Blau-Reaktion angefärbt und sichtbar gemacht werden.
Hämosiderin (dreiwertiges Eisen, Fe3+) entsteht besonders reichlich in Gebieten größerer Blutungen.
Es dauert einige Zeit (Wochen) er dreiwertiges Eisen gebildet wird.  Hämosiderinbeladene Makrophagen (sogenannte „Herzfehlerzellen“, Siderophagen) in z.B.  Sputum oder Lunge können Hinweis auf eine Herzinsuffizienz geben. Krankheiten mit vermehrter Eisenablagerung im Organismus heißen Hämosiderosen.

Als Siderophagen werden Makrophagen bezeichnet, die Hämosiderin, phagozytiert haben.


Zum Präparat:

Untersucht wurde ein Gesunde Milz und ein Hemorragische (mit viele Blutungen) Lunge.
Meine Hypothese war: kein oder sehr wenig dreiwertiges Eisen in die Milz nachweisbar und vieles in die Lunge wo viele Blutungen stattgefunden haben.
Die Milz wurde mit Technovit 7100 infiltriert und die Lunge in Paraffin.
Beiden wurden Fixiert in Formalin.
Weil Blutreiche Regionen in Formalin öfters Niederschläge erzeugen ist es sinnvoll um diese Niederschläge vor die Färbung zu entfernen. Mit gepuffertes Formalin sind die Niederschläge meistens nicht oder sehr wenig zu beobachten. Schlimmer wird es wenn das Formalin durch Ameisensäure-Bildung etwas in PH gesunken ist. Dann stört es richtig.
Entfernung ist sehr einfach. In Romeis 18 Seite 192 sind Drei Methodiken beschrieben. Zwei Alkalische und ein mit Pikrinsäure. Die Alkalische Formen haben ein Nachteil das die Schnitte abschwimmen können. Gesättigte Ethanolische Pikrinsäure bevorzuge ich gerne.



Bild 1
Ein Beispiel von Formolpigment. Hier in HE gefärbten Herzmuskelzellen-Schnitt. Das Pigment kommt vor als Braune Ablagerungen. Hier sehr fein aber gröberes Pigment kommt auch vor.





Bild 2
Meine Aufstellung um das Pigment zu entfernen.





Die Berlinerblau-Reaktion nach Perls (Romeis 18, Seite 239)





Die Reaktionslösung:
2% gelbes Blutlaugensalz (= Hexacyanoferrat II = Ferrocyankalium) und 1% HCL zu gleichen Teilen mischen.
Vorsicht: Die Lösung immer herstellen, und die Reaktion durchführen in eine Abzughaube weil das sehr giftige Cyanwasserstoff (Blausäure) frei kommen kann.  

 

Bild 3
Das Hämosiderin ist hier in eine HE Färbung schon zu sehen. Die Makrophagen haben ein Goldgelbe Farbe zwischen die viele Rote Erythrozyten.






Bild 4
Die viele Siderophagen zeigen hier das Blau angefärbte Hämosiderin.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Fluotar 10x,
Kamera: Moticam 2300




  
Bild 5
Die viele Siderophagen zeigen hier das Blau angefärbte Hämosiderin.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x,
Kamera: Moticam 2300





Bild 6
Die viele Siderophagen zeigen hier das Blau angefärbte Hämosiderin.
Oben im Bild eine mehrkernige Makrophage. Aktivierte Makrophagen können fusionieren und mehrkernige Riesenzellen bilden, um größere Fremdkörper zwecks Phagozytose zu umschließen. Um ihre Lokalisierung in verschiedenen Geweben zu beschreiben wurden ihnen spezielle Bezeichnungen gegeben. So heißen sie im zentralen Nervensystem Mikrogliazellen, in der Leber Kupffer-Sternzellen, in der Lunge Alveolarmakrophagen, mehrkernig und im Knochen vorkommend Osteoklasten, im Knorpelgewebe Chondroklasten, im Bindegewebe Histiozyten und in der Plazenta Hofbauerzellen
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Apo 40x,
Kamera: Moticam 2300





Bild 7
Die viele Siderophagen zeigen hier das Blau angefärbte Hämosiderin.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Apo 40x,
Kamera: Moticam 2300






Bild 8
Die Gesunde Milz, in Technovit 7100, lässt wie erwartet nur sehr wenig mit Hämosiderin beladene Siderophagen sehen.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x,
Kamera: Moticam 2300






Bild 9
Die Gesunde Milz, in Technovit 7100, lässt wie erwartet nur sehr wenig mit Hämosiderin beladene Siderophagen sehen. Das Hämosiderin liegt eindeutig Intrazellulär.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Apo 63x,
Kamera: Moticam 2300






Bild 10
Zugabe: in die Lunge waren auch einige mit Kohlenstaub beladene Makrophagen zu beobachten.
Leitz Orthoplan, Objektiv Leitz Plan Apo 40x,
Kamera: Moticam 2300




Viel Spaß beim anschauen, grüße aus Friesland, Ronald
« Letzte Änderung: Februar 26, 2012, 12:37:49 Nachmittag von Ronald Schulte »
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Florian Stellmacher

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #1 am: Februar 26, 2012, 04:54:56 Vormittag »
Lieber Ronald,

wieder ein sehr schöner und hervorragend bebilderter Beitrag! Vielen Dank!

Bezüglich des Nachweises von Eisen im histologischen Schnittpräparat hatte ich bei der Hämochromatose, die ich vor einiger Zeit einmal hier vorgestellt hatte, auch zwei Rezepte angegeben: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5242.msg70026#msg70026

Herzliche Grüße,
Florian
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Ronald Schulte

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #2 am: Februar 26, 2012, 11:04:55 Vormittag »
Florian,

Da hast du völlig recht und dein Beitrag von damals war auch meine Anregung um die Reaktion selbe mal aus zu führen.
Den Satz ist dann auch was unglücklich ausgewählt, ist für ein nichtdeutscher ab und zu schwierig um den genauen 'Schnur' zu finden.

Was mir in dein Protokoll auffällt ist die zweite Stufe:
2. 5 min. in 10%ige wässrige Kaliumferrozyanidlösung bringen
Warum muss dashier sein und in die Reaktion von Perls nicht?

Auch kann ich 'Purkinje' sein Beitrag von damals noch nicht erklären oder überhaupt verstehen! Warum Funktioniert es bei Makrophagen in Nervenwasser scheinbar anders? Eigentlich kann das nicht!

Zitat
nachdem ich mich viel mit der Untersuchung von Liquor cerebrospinalis (landläufig "Nervenwasser" genannt) befasse und dort öfters mal die Frage des Nachweises von frischeren Sickerblutungen im Hirne bei z.B. stärkeren neuartigen Kopfschmerzen auftritt, welche dann ja auch von Makrophagen abgeräumt wird, will ich anmerken, dass das Zeitfenster in dem die "verdauten" Erythrozyten als zweiwertige Eisenionen vorliegen eng ist.
Will sagen nur etwa 8-24 Stunden nach der Phagozytose von eisenhaltigem Eiweiß (wie etwa Erys) sind die Makrophagen Berliner Blau +, danach sieht man nur noch gelbliche und schließlich schwarze Ablagerungen in den Makrophagen (Hämosiderin) und die Reaktion ist wieder -.
Die "Liquorologen" messen deshalb nur noch Ferritin und färben die Liquorzellen gar nicht mehr auf Berliner Blau (unsicher, aufwendig, dauert länger).


Hoffentlich wird es hier nochmal erklärt, grüße Ronald



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Holger Adelmann

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #3 am: Februar 26, 2012, 11:13:18 Vormittag »
Wieder eine schöne und lehrreiche Arbeit, Ronald, vielen Dank !
Mir gefällt Bild 6 mit dem mehrkernigen Makrophagen besonders gut.

Diese Reaktion müsste doch auch mit Kunststoff-Schnitten funktionieren, da sie ja vorher abläuft?
Das gäbe dann ja noch bessere Bilder mit mehr Details.

Herzliche Grüsse
Holger


Ronald Schulte

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #4 am: Februar 26, 2012, 11:34:20 Vormittag »
Holger,

Bild 8 und 9 ist die gleiche Reaktion in Technovit.

Da ist nur sehr wenig Eisen III nachweisbar und so gehört es auch zu sein.

Grusse Ronald
« Letzte Änderung: Februar 26, 2012, 11:55:50 Vormittag von Ronald Schulte »
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Holger Adelmann

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #5 am: Februar 26, 2012, 11:55:56 Vormittag »
Danke, das ist mir durchgegangen Ronald.

Bei diesen beiden Bildern haben viele Kerne eine sogenannte Stechapfelstruktur, sind das Schrumpfungen?

VG
Holger

Ronald Schulte

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #6 am: Februar 26, 2012, 12:07:25 Nachmittag »
Holger,

Ich denke das die Reaktionslösung so seine Negative Einwirkung auf das Kunststoff hat. Das weil das gleiche Milz-Block mit eine Haematoxylin-Fuchsin Färbung wohl die Richtige Struktur zeigt.
Bild 1 ist die Weiße Pulpa mit die 'Sternhimmelzellen', Bild 2 ist das Rote Pulpa mit hier zufällig eine Megakaryozyte.

(da gebrauche ich mal 'die' und 'das', so wie es mir gut scheint. Deutsch ist noch nicht so einfach)

Bild 1, Weiße Pulpa




Bild 2, Rote Pulpa



Grüße Ronald
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Florian Stellmacher

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Re: HISTOCHEMIE: die Berlinerblau Reaktion in Lunge und Milz
« Antwort #7 am: Februar 26, 2012, 14:34:46 Nachmittag »
Lieber Ronald,

Zitat
Was mir in dein Protokoll auffällt ist die zweite Stufe:
2. 5 min. in 10%ige wässrige Kaliumferrozyanidlösung bringen
Warum muss dashier sein und in die Reaktion von Perls nicht?

deswegen: Die Turnbulls-Reaktion weist zweiwertigs Eisen nach, daher wird in der modifizierten Turnbulls-Färbung zunächst dreiwertiges Eisen in zweiwertiges überführt. Das Ergebnis der Färbung soll sensitiver sein, d.h. es werden noch geringere Mengen von Eisen nachgewiesen.

Herzliche Grüße,
Florian
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