Autor Thema: Ciliaten fixieren  (Gelesen 13261 mal)

novus

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Ciliaten fixieren
« am: Mai 07, 2012, 12:36:34 Nachmittag »
Hallo!
Wie kann man Ciliaten fixieren? Ich habe die Foren-Suchfunktion benutzt und dort einen Hinweis gefunden, demzufolge ein Forenmitglied (Martin Kreuzer?) einmal eine Anleitung für die Fixierung von Ciliaten geschrieben hat, kann diese Anleitung aber nicht finden.
Ich habe den guten Tipp bekommen, mir ein Blitzgerät anzuschaffen. Nun habe ich noch keins, aber auch wenn ich eines hätte, wäre da noch das Problem der Schärfeeinstellung bei sich bewegenden Objekten. Da muss ich erst noch Erfahrungen sammeln.

Ich habe es bisher mit Formalin (0,4%) probiert. Das funktioniert halbwegs gut bei Heu- oder Nierentierchen (d.h. mit hoher Verlustrate), aber größere Protozoen lösen sich schlicht auf (genau genommen, explodieren sie geradezu). Alkohol hat den gleichen Effekt. Farbstoffe wie Hämatoxylin oder Erythrosin, welche Nukleusbestandteile färben (und damit m.E. eigentlich den Zellstoffwechsel beenden sollten) funktionieren auch nicht so recht, selbst wenn ich wässrige Lösungen ansetze. Wenn sie nicht gleich zur Auflösung führen, dann verlieren die Tierchen meistens ihre Form.

Ich kann mich entsinnen, einmal gelesen zu haben, dass sich Ciliaten verlangsamen lassen, wenn man Tapetenkleister hinzu gibt. Hat jemand damit Erfahrung?

Gruß,
Novus

Peter Reil

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #1 am: Mai 07, 2012, 16:59:22 Nachmittag »
Hallo Novus,

Tapetenkleister funktioniert gut.

Grüße
Peter R.
Meine Arbeitsgeräte: Olympus BHS, Olympus CHK, Olympus SZ 30

JB

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #2 am: Mai 07, 2012, 18:43:45 Nachmittag »
Hallo,

Sollen es Frisch- oder Dauerpraeparate werden?

Fuer Dauerparaeparate bietet es sich an, die Ciliaten direkt an Objekttraeger oder Deckglaeschen zu fixieren:

Konzentierte Ciliaten auf sauberes Deckglaeschen ueberfuehren und unter Beobachung moeglichst viel Fluessigkeit entfernen.
Antrocknen lassen. Je kuerzer die Eintrocknungszeit, desto weniger Chance haben die Ciliaten zu zerfallen.
Fixieren mit Formaldehyd oder AFA (Alkohol-Formol-Eisessig).
Faerben und Eindecken.

Bei Frischpraeparaten zerfallen einige Ciliaten sehr leicht. Man kann die Resultate verbessern indem man die Tiere in isotonischer Loesung fixiert. Ich verwende fuer Einzeller (allerdings nicht fuer Ciliaten) 4% Formol in PBS.
Empfohlen zB hier: http://www.jstor.org/stable/3225394?seq=1
Hazen et al. (1976): A Method for Fixing and Staining Peritrich Ciliates. Transactions of the American Microscopical Society , Vol. 95(4): 693-695

PBS: Phosphate buffered saline = Physiologische Kochsalzloesung mit Phosphatpuffersystem (pH 7.4)
http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline

Sie koennen auch einfachere Rezepte versuchen, zB 0.9 % NaCl Loesung mit 4 % Formol.

Je hoeher die Formolkonzentration, desto staerker werden die Proteine vernetzt. 4% statt 0.4% koennte bessere Ergebnisse bringen (muss es aber nicht).

Beste Gruesse,

Jon

treinisch

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #3 am: Mai 07, 2012, 22:29:22 Nachmittag »
Hallo,

du kannst auch folgende Methode zur iso-osmotischen Fixierung probieren: Probengefäß offen mit einem offenen Gefäß mit Formalin in einen geschlossenen eher kleinen Behälter stellen. Je nach Konfiguration sind nach einigen Stunden die Ciliaten tot und nach einigen weiteren Stunden soweit fixiert, dass man gefahrlos zu kruderen Mitteln wie der direkten Zugabe von Formalin greifen kann.

Die Methode ist sehr sanft, hab sie aber auch erst ein paar mal ausprobiert.

Viele liebe Grüße

Timm
Gerne per Du!

Meine Vorstellung.

novus

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #4 am: Mai 07, 2012, 22:49:32 Nachmittag »
Hallo allerseits!
Das sind ja weitaus mehr Informationen, als ich erhofft hatte.

Peter R., gibt es da noch etwas zu beachten (z.B., um zu verhindern, dass der hygroskopische Kleister die Ciliaten, äh, "aussaugt")?

Jon, ja, es geht um Frischpräparate. Danke für die Quelle, das sieht vielversprechend aus. PBS müsste ich über meinen Chemikalienhändler bekommen können. Mit 4% Formalin hatte ich noch schlechtere Erfahrungen gesammelt, daher hatte ich die Lösung auf 0,4% verdünnt, weil mir einfach nichts Besseres mehr einfiel. Aber wenn man das Grundproblem mit PBS in den Griff kriegt, spricht wohl nichts mehr gegen höhere Formalin-Dosen.
Mit

Timm, das hat den Vorteil, dass ich es morgen gleich mal ausprobieren kann.

Herzlichen Dank an Euch alle & viele Grüße!
Michael
 

JB

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #5 am: Mai 07, 2012, 23:07:50 Nachmittag »
Hallo,

Wenn PBS nur unter Kostenaufwand zu haben ist, versuchen Sie es einfach zuerst mit 0.9% NaCl (Speisesalz reicht aus).

PBS hat den Vorteil, dass es Ameisensaeure, aus der (unvermeidlichen) langsamen Oxidation von Formaldehyd durch Luftsauerstoff, abpuffert.

Timms Methode hoert sich sehr gut an. Davon gibt es auch die Variante, einen haengenden Tropfen am Deckglas mit den Ciliaten direkt oben auf die Formolflasche zu legen. Die Fixierung geschiet dann etwas schneller.

Viel Erfolg,

Jon

novus

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #6 am: Mai 10, 2012, 02:06:34 Vormittag »
Guten Abend oder guten Morgen, wie man's nimmt.

Bevor ich endlich schlafen gehe, möchte ich wenigstens noch eine Rückmeldung geben. Ich habe Timms Methode nun ausprobiert und kann sagen, dass sie bei Pantoffeltierchen und Glockentierchen gut funktioniert hat. Trompetentierchen lösten sich auch nicht auf, verloren aber ihre Form.

Bei zwei Ciliatenarten (die ich leider nicht bestimmen kann), hinter denen ich nun schon seit einer Woche her bin, um sie ins Fotoalbum zu kriegen und von denen ich sicher bin, dass sie in der Probe enthalten waren, hat es aber leider nicht funktioniert. Von denen war nichts mehr zu entdecken, hier schlug vermutlich die Lyse zu. Es kann aber auch sein, dass ich zu lange gewartet habe. Ich habe die Probe gestern abend angerichtet und kam erst vor drei Stunden dazu, nachzuschauen.

Ich werde auch die PBS-Methode probieren, sobald ich die Lösung gekauft habe. Der Kostenfaktor stört mich nicht, es wird halt eine Weile dauern. Ich kenne für so etwas in einer Nachbarstadt eine kleine Handlung für Laborbedarf, bei der es ein, zwei Wochen dauern kann, bis eine Bestellung eintrudelt (Chemikalien hat man dort fast keine mehr vorrätig). Aber ich mag dieses Lädchen. Internetbestellungen sind ja ganz praktisch, doch mir ist die Dr.-Emma-Variante sympathischer. Ich habe da keine Eile, zumal diese Wasserprobe ohnehin schon so langsam am Ende ist.

Sobald ich zum Baumarkt komme, probiere ich auch die Kleistermethode.

Viele Grüße,
Michael

treinisch

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #7 am: Mai 10, 2012, 02:10:47 Vormittag »
Hallo Michael,

ähmm, Tapetenkleister ist nur leger ausgedrückt. Gemeint ist Methylcellulose.
Kannst Du in der Apotheke bestellen: PZN 3926910.

Das Zeug aus dem Baumarkt enthält Zuschlagstoffe und Verunreinigungen die
die Freude „trüben”.

Viele Grüße

 Timm
Gerne per Du!

Meine Vorstellung.

Herbert Dietrich

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #8 am: Mai 10, 2012, 08:24:44 Vormittag »
Hallo Michael,

Stehle empfiehlt in "Mikroskopie für Jedermann"  Quittenschleim: einige zerquetschte Quittenkerne mit Wasser zu übergießen
und einige Tage stehen zu lassen oder wasserlösliche Methlcellulose aus der Apotheke (3g auf 95ml warmes Wasser)

vor einiger Zeit wurde hier im Forum empfohlen, der Tümpelprobe etwas Ultraschall-Geel beizumischen.
Eine kleine Menge ist sicher vom Hausarzt zu erhalten, ansonsten günstig über ebay.

Gruß
Herbert

novus

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #9 am: Mai 11, 2012, 16:11:29 Nachmittag »
Timm,
das mit dem Tapetenkleister kam mir gleich spanisch vor...

Jedenfalls habe ich jetzt alles von der Kochsalzlösung bis zur Methylzellulose bestellt und wenn ich am Wochenende Gelegenheit finde, es auszuprobieren, werde ich einen kurzen Erfahrungsbericht geben. Wenn's der "Kleister" nicht tun sollte, probiere ich auch das Ultraschallgel. Man lebt und lernt.

Gruß,
Michael

cicindela

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #10 am: Mai 11, 2012, 18:08:46 Nachmittag »
Hallo,
das mit dem Tapetenkleister kam mir gleich spanisch vor...
Fixieren ist nicht Fixieren!
Ist Fixieren gemeint im Sinne von "kurzfristig an der Bewegung hindern" oder im
histologischen Sinne von "Abtöten unter möglichst getreuer Beibehaltung der inneren Strukturen" ?
Kleister etc ist gut für Ersteres, Formalin für Letzteres ...

Gruß,
Franz

novus

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #11 am: Mai 13, 2012, 21:48:07 Nachmittag »
Ich meinte "Abtöten unter möglichst getreuer Beibehaltung der inneren Strukturen", auf den kurzfristig behindernden "Kleister" kam ich nur als Alternative. Mein Posting war da missverständlich, Franz, das stimmt.

Ich möchte ein kurzes Feedback geben. Phosphatgepuffertes Formalin in isotoner NaCl-Lösung funktioniert wirklich gut. Gegenüber der Methode, bei der man Formalin aus dem gasförmigen Zustand langsam in das Frischpräparat diffundieren lässt, hat es den Vorteil, sehr viel schneller (nämlich unmittelbar) durchführbar zu sein.

Leider scheint es aber bei der Formalinfixierung einen selektiven Effekt zu geben. In meinen Proben gibt es einen Ciliaten, der auch durch PBS nicht zu fixieren ist. Ich weiss nicht, welches Spezies es ist (aber es ist mit Sicherheit kein Rädertierchen, völlig anderer Aufbau). Ganz gleich, ob gepuffert oder nicht, diese Spezies löst sich auf.

Ich konnte das unmittelbar beobachten. Nach der Zugabe von PBS-Formalin schwamm die Protozoe noch eine Weile erratisch herum, hörte plötzlich auf, sich zu bewegen und verwandelte sich im nächsten Augenblick in eine Plasmawolke. Der Zerstörungseffekt war so explosiv, dass er wohl durch den osmotischen Druck erzeugt wurde. Ich weiss nun nicht genau, warum die Fixierung hier nur zum Teil gelang (denn abgetötet wurde der Einzeller natürlich). Es könnte sein, dass es dem Formalin nicht rechtzeitig gelingt, die Zellstruktur zu festigen, bevor sie durch den osmotischen Druck zerissen wird.  Vielleicht führt bei dieser Spezies das Formalin aber auch erst zu der strukturellen Instabilität, weil es durch die Verneztung der Proteine in der Zellwand sozusagen Löcher erzeugt, durch die noch mehr Wasser einströmt. Im ersten Falle wäre de Lösung einfach: Höhere Formalinkonzentration. Im zweiten Falle wäre diese Spezies wohl prinzipiell nicht mit Formalin fixierbar. Vielleicht gibt es auch eine ganz andere Erklärung, ich verstehe von der Materie schlicht zu wenig.

Methycellulose schadet hier zwar nicht, hat diesen Typ aber auch nicht sonderlich verlangsamt. Ich muss damit noch mehr herumexperimentieren, doch habe ich bereits soviel in aqua dest. gelöste MC zugegeben, dass der Tropfen des Präparats auf das Dreifache anschwoll, ohne dass es einen Effekt hatte. Die Durchsichtigkeit liess alllerdings ein wenig nach.

Fazit: Ich werde erst mal mit PBS in höherer Formalinkonzentration weitermachen, um zumindest in diesem Punkt Klarheit zu haben. Erst muss ich aber mehr Exemplare heranzüchten, das wird ein paar Tage dauern. Die neue Wasserprobe, die ich gestern geholt habe, ist noch ein bisschen dünn besiedelt.

Schönen Abend,
Michael

Bernhard Lebeda

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #12 am: Mai 13, 2012, 22:33:38 Nachmittag »
Hallo Michael

ich erlaube mir meinen Senf dazu zugeben:

gehe ich recht in der Annahme, daß Du keine Dauerpräparate anfertigen, sondern die Ciliaten schlicht und ergreifend leichter fotografieren möchtetst?
Dann ist die ganze Fixiererei etwas überkandidelt! Es sei denn Du möchtest Versuchsreihen zur Taxonomie hinsichtlich formalinophiler bzw. formalinophober Ciliaten anstellen  ;D

Das klassische Mittel der Wahl ist schlicht die Schichtdicke des Frischpräparats so weit zu verringern, daß die Ciliaten eingeklemmt werden. Das geschieht am besten durch abwarten, Tee trinken und verdunsten lassen! (Absaugen saugt u.U. die interessanten Ciliaten mit weg!). Als Ergänzung gibt es noch die klassische Methode des anbringens von Wachsfüßchen am Deckglas. Durch leichtes Andrücken legt man dann vorsichtig die Einzeller fest.
Möchte man bestimmte Details der Ciliaten besser erkennen können, bedient man sich entweder Kontrastverfahren wie Dunkelfeld, Phasenkontrast oder bei entsprechendem Bankkonto auch DIK. Oder aber man färbt. Da gibt es z.B. das klassische Ausstrichverfahren nach Bresslau: Probe mit Opalblau-Phloxinrhodaminlösung vermischen, dünn ausstreichen und schnell mit Fön o.ä. eintrocknen lassen. Üblich ist auch Färbung mit Methylgrün-Pyronin.

Wenn denn trotzdem unbedingt fixiert werden soll, wäre daß hier auch eine Alternative:

http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artjul03/wdfixers1.html


Professionelle Methoden wie z.B in dem Klassiker " Kultur und Präparation der Protozoen" von Max Mayer (Kosmos Verlag, grüne Reihe antiquarisch oder von mir als pdf) sind für den Laien oder Hobbyisten eher nicht durchführbar, da die Chemikalien nicht beschaffbar sein dürften und die Methoden die üblichen Laborsicherheitseinrichtungen voraussetzen!!

Fototechnisch gesehen wäre auch über eine Blitzeinrichtung nachzudenken.


Viele Mikrogrüße

Bernhard
« Letzte Änderung: Mai 13, 2012, 22:39:04 Nachmittag von Bernhard Lebeda »
Ich bevorzuge das "DU"

Vorstellung

novus

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #13 am: Mai 14, 2012, 11:35:46 Vormittag »
Hallo Bernhard!

gehe ich recht in der Annahme, daß Du keine Dauerpräparate anfertigen, sondern die Ciliaten schlicht und ergreifend leichter fotografieren möchtetst?

Ja und Nein. Im Moment geht es erst einmal um das leichtere Fotografieren, aber Dauerpräparate stehen als nächstes auf dem Programm. Spätestens dann werde ich wohl um's Fixieren nicht herum kommen. Ich habe erst Anfang des Jahres mit dem Mikroskopieren begonnen und bin dabei, mir so peu à peu die nötigen Techniken anzueignen.


Dann ist die ganze Fixiererei etwas überkandidelt! Es sei denn Du möchtest Versuchsreihen zur Taxonomie hinsichtlich formalinophiler bzw. formalinophober Ciliaten anstellen  ;D

Ich wusste doch, dass es dafür ein Stichwort geben muss!  :)
Mir war schon klar, dass es dazu irgendwo etwas zum Nachlesen geben müsste, aber ich konnte per Suchmaschine nichts finden und da ich weder Biologe noch Chemiker bin, fehlt mir auch die Wissensbasis, um gezielt die geeignete Fachliteratur zu finden. Zumal man auch in Datenbanken wie Biological Abstracts ohne die richtigen Suchbegriffe aufgeschmissen ist.
Außerdem bin ich ein neugieriger Mensch und auch wenn es mir ursprünglich nur um's leichtere Fotografieren ging, hat mir dieses Problem einfach keine Ruhe gelassen. Tatsächlich dachte ich, dass eventuell so ein Unterschied dahinter stecken könnte, aber da ich blutiger Anfänger bin, ging ich erst einmal davon aus, dass ich etwas beim Fixieren falsch gemacht hätte. Und das habe ich auch. Wenn sonst schon nichts dabei herauskam, dann doch eine Menge guter Hinweise, wie ich es in Zukunft besser machen kann.
Danke für den Tipp, ich werde jetzt mal gezielter recherchieren, denn das Thema iinteressiert mich immer noch.



Das klassische Mittel der Wahl ist schlicht die Schichtdicke des Frischpräparats so weit zu verringern, daß die Ciliaten eingeklemmt werden. Das geschieht am besten durch abwarten, Tee trinken und verdunsten lassen!

Tja, das hatte ich schon probiert, aber meistens den richtigen Zeitpunkt verpasst (sprich: es wurden Quetschpräparate). Deshalb suchte ich nach einer Alternative. Aber Du hast schon Recht, warum kompliziert, wenn's auch einfach geht.

Wenn denn trotzdem unbedingt fixiert werden soll, wäre daß hier auch eine Alternative:

http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artjul03/wdfixers1.html

Das sieht hochinteressant aus!

Professionelle Methoden wie z.B in dem Klassiker " Kultur und Präparation der Protozoen" von Max Mayer (Kosmos Verlag, grüne Reihe antiquarisch oder von mir als pdf) sind für den Laien oder Hobbyisten eher nicht durchführbar, da die Chemikalien nicht beschaffbar sein dürften und die Methoden die üblichen Laborsicherheitseinrichtungen voraussetzen!!

Verstehe - und soviel Labor ist bei mir nicht drin, aber die pdf würde mich trotzdem interessieren, wenn auch nur wegen der Kultivierungstechniken. Wärst Du so freundlich, mir eine Kopie zu schicken?

Fototechnisch gesehen wäre auch über eine Blitzeinrichtung nachzudenken.

Ja, das wurde bereits erwähnt und mir leuchtet das natürlich auch ein. Aber da hapert es bei mir an der Hardware. Ich müsste mir eine neue Kamera kaufen, für die es ein Blitzgerät mit Kabel gibt. Das habe ich vorerst aufgeschoben.

Erst mal vielen Dank an Dich und die anderen hilfsbereiten Forenmitglieder. Das alles hat mir sehr weiter geholfen!

Viele Grüße,
Michael

« Letzte Änderung: Mai 14, 2012, 11:58:42 Vormittag von novus »

Bernhard Lebeda

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Re: Ciliaten fixieren
« Antwort #14 am: Mai 14, 2012, 23:21:29 Nachmittag »
Hallo Michael

Deine jetztige Kamera wird doch einen internen Blitz haben. Damit kann man jedes Blitzgerät mit Slavefunktion auslösen. Das kann heutzutage fast jeder Popelblitz! Solltest Du schon ein Blitzgerät besitzen, hilft so was hier:

http://www.foto-walser.biz/shop/Artikel/4168/410/walimex_walimex_Synchroblitzschuh_mit_Servoblitzausloeser.htm

Das PDF hat 50MB. Ich schicke es am besten auf CD. Kannst mir eine PN mit Deiner Adresse schicken.

Viele Grüße

Bernhard
Ich bevorzuge das "DU"

Vorstellung