Autor Thema: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer *  (Gelesen 10638 mal)

Rolf-Dieter Müller

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Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer *
« am: Juni 17, 2012, 00:58:46 Vormittag »
Liebe Forumsmitglieder,

ich möchte heute Abend meine Farn-Trilogie mit einem Wedelstängel-Querschnitt von Athyrium filix-femina (Gemeiner Frauenfarn) abschließen. Angefangen habe ich ja mit dem Dornfarn (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12574.msg94037#msg94037), der zweite Beitrag war der Rippenfarn (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12661.0).

Die Präparation ist recht übersichtlich, das heißt ein frischer Wedelstängel wurde mit dem Haga-Rasierklingenmikrotom geschnitten. Ein Schnitt blieb unfixiert und ungefärbt für die Fluoreszenzaufnahme zurück (Bild 1, Bild 2 als Hellfeldaufnahme), restliche Schnitte wurden für die Färbung (Bild 3) für 30 Minuten in AFE(50) fixiert (Schnittfixierung).

Interessant ist hierbei das Färbeprotokoll, denn entgegen meiner üblichen Verarbeitung habe ich statt abschließend mit 100% Isopropylalkohol nur bis 96% Ethanol entwässert und von da aus in Euparal eingeschlossen:

  • Schnitt aus AFE über Ethanolstufen abnehmender Konzentration (50% und 30%) in Wasser ausgewaschen.
  • Simultanfärbung mit W3Asim (enthält die Farben Acridinrot, Acrflavin, Alcianblau), Dauer ca. 10 Minuten, zum Anfang die Farblösung mit dem darin enthaltenen Schnitt auf ca. 60° Celsius erwärmt.
  • Den überfärbten Schnitt in Wasser ausgewaschen (3x gewechselt).
  • Differenzierung in 30% Ethanol (3x gewechselt bis keine Farbe mehr abging).
  • Schnitt in 50% Ethanol überführt (auf diese Stufe kann auch verzichtet werden).
  • Anschließend in 96% Ethanol entwässert.
  • Einschluss in Euparal.
  • Aushärten im Wärmeschrank oder auf Wärmebank.

Falls Sie dieses Färbeprotokoll nacharbeiten möchten gebe ich zu bedenken, das dieses einer meiner ersten Versuche ist ohne Isopropylalkohol direkt aus 96% Ethanol in Euparal einzuschließen. Für Euparal ist das ja unkritisch, da es etwas wasserverträglich ist. Wie haltbar aber jetzt die Färbung ist, das werden die nächsten Wochen zeigen.

Die Übersichtsbilder wurden mit Photomerge Panorama (Unterprogramm von Photoshop Elements) aus je 12 Einzelbildern zusammengesetzt. Alle Einzelaufnahmen mit 10x/0,3 PlanNeofluar.

Bild 1 = Primärfluoreszenz (Autofluoreszenz), Durchlicht


Bild 2 = Schnitt wie Primärfluoreszenz, jedoch nur Durchlicht-Hellfeld


Bild 3 = gefärbter Schnitt nach dem Färbeprotokoll, Durchlicht-Hellfeld


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter Müller


Hier noch die fortgeschriebenen Links zu Farn-Beiträgen im Forum:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12746.0 (Gemeiner Frauenfarn, Rolf-Dieter Müller)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12661.0 (Leitbündel vom Rippenfarn, Rolf-Dieter Müller)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12574.msg94037#msg94037 (Dornfarn, Rolf-Dieter Müller)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12456.msg92945#msg92945 (Wurmfarn, Jörg) *)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12483.msg93177#msg93177 (Davallia sp., Anatol)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=12418 (Wurmfarn, Christian)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=2974.msg18163#msg18163 (Lycopodium annotinum, Klaus Herrmann)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=3686 (Tüpfelfarn, Eckhard)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9608.msg68209#msg68209 (Streifenfarn, Anatol) *)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=2552 (Adlerfarn, Jörg)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4065.msg25959#msg25959 (Gemeiner Tüpfelfarn, Jörg)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=2927.0 (Wald-Rippenfarn, Klaus Herrmann)
http://www.mikroskopie.de/mikforum/read.php?2,43821,43821#msg-43821 (Davallia bullata, Rolf-Dieter Müller)

*) mit Anmerkungen zur Pflanzenanatomie
« Letzte Änderung: Dezember 05, 2013, 10:11:18 Vormittag von Florian Stellmacher »

Nomarski

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #1 am: Juni 17, 2012, 15:27:14 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter,

bevor gar keiner was sagt, möchte ich jedenfalls bekunden, daß dir die Aufnahmen mal wieder sehr gut gelungen sind und du dir sehr viel Mühe in der Beschreibung gegeben hast. Vielen Dank für deine Mühen, die hoffentlich nicht vergeblich waren.

Viele Grüße
Bernd

Detlef Kramer

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #2 am: Juni 17, 2012, 16:43:59 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

es kommen sicherlich noch mehr Kommentare, die möglichen Kommentatoren dürften sich aber noch auf Reise befinden.

Mir gefällt Foto 3 mit seinen warmen, ausgeglichenen Farben und Kontrasten am besten.

Herzliche Grüße
Detlef
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Fahrenheit

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #3 am: Juni 17, 2012, 16:44:44 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

vielen Dank für die Ergänzung zu Deinen anderen Farn-Schnitten!

Die Differenzierung mit Deinem neuen Farbansatz werde ich auch einmal probieren - bei dem Einschluss aus 96% Ethanol bin ich etwas vorsichtiger - aber das weißt Du ja.  ;)

Herzliche Grüße
Jörg
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Eckhard

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #4 am: Juni 17, 2012, 17:04:24 Nachmittag »
Liebe Freunde,

Rolf-Dieter, für Dich eine Gratulation für den gelungenen Schnitt. Alcianblau ist eine feine Alternative zu Astrablau. Allerdings bin ich etwas verwundert dass die Endodermis grün geworden ist  ;D

Jörg, ich teile Deine Skepsis. Meine nach Rolf-Dieters Beispiel in Ethanol entwässerten Bambusschnitte werden täglich argwöhnisch aus dem Wärmeschrank geholt und kontrolliert. Ich kann derzeit nichts Negatives feststellen.

Herzliche Sonntagsgrüsse,
Eckhard
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A. Büschlen

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #5 am: Juni 17, 2012, 17:26:27 Nachmittag »
Lieber Rolf-Dieter,

diese Farn-Trilogie mit Wedelstängel-Querschnitten zeigt sehr eindrücklich deine sorgfältige und präzise Arbeitsweise.

Besten Dank für diese umfassende Dokumentation.

Freundliche Grüsse

Arnold

Rolf-Dieter Müller

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Frauenfarn – Sekundärfluoreszenz
« Antwort #6 am: Juni 21, 2012, 00:03:48 Vormittag »
Liebe Freunde,

vielen Dank für Eure Kommentare. Ich melde mich zwar etwas spät, doch wollte ich mit meinem Dank die Gelegenheit eines weiteren Mikrobildes nutzen.

Diesmal ist es ausnahmsweise Sekundärfluoreszenz und zwar von dem oben gezeigten Schnitt, der ja mit den Wackerfarben Acridinrot und Acriflavin gefärbt ist. Statt des Astrablaus habe ich aber Alcianblau genommen und das alles als Simultanfärbung.

Anlass ist die Wiederinbetriebnahme der LED-Durchlichtfluoreszenz-Einrichtung, die mir dankenswerterweise Horst Wörmann überlassen hat. Leider hatte ich einmal die 470 nm-LED versehentlich ohne Steuerteil direkt an 12 Volt angeschlossen. Das geht natürlich nicht. Ein blitzartiges Aufleuchten und das war es dann für die LED. Heute Abend konnte ich nun Ersatz (Luxeon Rebel) einlöten und habe nach dem Justieren das nachstehende Mikrofoto gemacht.

Es sind 12 Einzelaufnahmen zu diesem Übersichtsbild zusammengesetzt, aufgenommen mit dem 10x/0,3 PlanNeofluar. Übrigens reichte es, die LED nur mit 50 mA zu betreiben, Belichtungszeit war 1,3 Sekunden bei 200 ASA pro Aufnahme.

Bild 4: Athyrium filix-femina (Gemeiner Frauenfarn), Wedelstängel quer, Sekundärfluoreszenz


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
« Letzte Änderung: Juli 12, 2012, 14:13:03 Nachmittag von Rolf-Dieter Müller »

Rawfoto

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #7 am: Juni 21, 2012, 06:56:14 Vormittag »
Guten Morgen Rolf-Dieter

Die Gegenueberstellung, primaer zu sekundaer finde ich besonders spannend! Danke dafuer, wie immer bewundere ich deine Schnitte mit dem Hager ...

Wie sich die Faerbung in den naechsten Wochen veraendert wuerde mich auch och sehr interessieren! Was treibt Dich eigentlich an ISO weg zu lassen, der eine Arbeitsschritt weniger? Das habe ich noch nicht verstanden?

Liebe Gruesse

Gerhard
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Rolf-Dieter Müller

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Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Fiederstängel quer
« Antwort #8 am: Juni 22, 2012, 08:16:25 Vormittag »

Wie sich die Faerbung in den naechsten Wochen veraendert wuerde mich auch och sehr interessieren! Was treibt Dich eigentlich an ISO weg zu lassen, der eine Arbeitsschritt weniger? Das habe ich noch nicht verstanden?


Lieber Gerhard,

auch Dir meinen Dank für Deinen Kommentar.

Es gibt zwei gute Gründe, warum ich zur Zeit probiere, nur mit 96% Ethanol zu entwässern.

Einen hast Du schon genannt, es wäre eine Reagenz weniger, die ich für diese Färbung vorhalten müsste. Für Fixierung und Differenzierung benötige ich in jedem Fall Ethanol. Und da ich festgestellt habe, dass die Färbung nach Differenzierung zumindest temporär stabil bleibt, belasse ich es beim Entwässern in 96% Ethanol und schließe danach direkt in Euparal ein.

Zum zweiten kann ich nach relativ kurzer Zeit auf der Wärmebank brauchbare Aufnahmen machen, das im Schnitt enthaltene Ethanol scheint schneller dem Euparal zu weichen als Isopropylalkohol. Inwieweit die Färbung wirklich stabil bleibt zeigen die nächsten Wochen und ich werde mich mit Eckhard austauschen, der ja auch ein Präparat nur mit Ethanol entwässert hat. Es bleibt also spannend.

Nach der Wiederinbetriebnahme meiner LED-Auflichtfluoreszenz-Einrichtung fehlte nur noch der Test mit Primärfluoreszenz (Autofluoreszenz), den ich nachstehend zeigen möchte. Es ist der Querschnitt eines Fiederstängels vom Frauenfarn, recht klein im Durchmesser, ganz so nach meinem Geschmack. Geschnitten im Rasierklingenmikrotom zeigt die Fluoreszenzaufnahme doch hier ein Problem auf, es wird beim Schneiden reichlich Chlorophyll verschleppt, was im oberen Drittel gut zu sehen ist. Abhilfe wären Gefrierschnitte oder die Einbettung in PEG 1500 wie es zum Beispiel Ralf Wagner für Moos- und Flechtenschnitte beschrieben hat: http://www.blam-hp.eu/allgbryo.html#peg

Die Mikrobild ist aus zwei Einzelbildern zusammengesetzt, 10x/0,3 PlanNeofluar, die LED wurde mit 700 mA Konstantstrom versorgt, Belichtungszeit je Aufnahme 4 Sekunden bei 200 ASA.

Bild 5: Athyrium filix-femina, Fiederstängel quer, (Auflicht-) Primärfluoreszenz, Anregungslicht 470 nm LED, Zeiss Filtersatz 09.


Viele Mikrogrüße
Rolf-Dieter
« Letzte Änderung: Juli 12, 2012, 14:13:33 Nachmittag von Rolf-Dieter Müller »

Rawfoto

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #9 am: Juni 24, 2012, 13:32:38 Nachmittag »
Hallo Rolf-Dieter

Spannend, danke, vor allem die Verschleppung! Stört/beeinträchtigt die Einbettung in PEG nicht eigentlich die Primärfluoreszenzen, ich würde das erwarten ...
Heute habe ich auch einmal versucht frischen Farn (Wurmfarn -Dryopteris filix-mas) mit dem Handmikrotom zu schneiden, wie machst Du das nur mit der Montage des Stängels?!? Ich habe Holundermark und Dämmplatte versucht, aber glücklich bin ich damit nicht geworden ...

Liebe Grüße

Gerhard
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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #10 am: Juni 24, 2012, 13:53:44 Nachmittag »
Hallo Gerhard,

versuche doch mal die von mir präferierte Methode der Möhreneinbettung. Einfach aus einer frischen Möhre einen Zylinder rausschneiden. Dann mit einem Zahnstocher oder einem Dorn einen Kanal durch den Möhrenzylinder bohren. Den Wedel durchschieben und dann den Zylinder trimmen, so dass er in das Mikrotom eingespannt werden kann.

Viel Erfolg!

Herzliche Grüsse
Eckhard
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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #11 am: Juni 24, 2012, 15:00:46 Nachmittag »
Hallo Eckhard

Danke, die wende ich des öfteren an, die hat aber einen Nachteil ==> man verschleppt Teile der Karotte (Ihr sagt Möhre dazu) in das Gewebe des Präparats und das hat mich schon schön genervt ...

Ich Stelle nur gerade fest, fixierte Präparate gehen leichter zu schneiden wie frische :-))

Liebe Grüße

Gerhard

Ps: auf geht's mit dem nächsten Versuch ...
« Letzte Änderung: Juni 26, 2012, 22:22:14 Nachmittag von Rawfoto »
Gerhard
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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #12 am: Juni 24, 2012, 17:18:17 Nachmittag »
Hallo Gerhard,

Zitat
man verschleppt Teile der Karotte (Ihr sagt Möhre dazu) in das Gewebe des Präparats und das hat mich schon schön genervt ...

Ich weiss nicht, wie Dir das gelingt. Ich habe sicher mehr als 100 x mit der Möhrenmethode geschnitten und mir ist dies noch nicht passiert.

Herzliche Grüsse
Eckhard

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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #13 am: Juni 24, 2012, 21:11:35 Nachmittag »
Hallo Eckhard

Ich kann das auch nicht sagen, ich denke aber es liegt daran das die Karotte ja mitgeschnitten wird und man den eigentlichen Schnitt aussortieren muss. Und ich denke da schleichen sich die kleinen Fusseln ein ...

Da ich aber heute beim Wurmfarn auf breiter Front gescheitert bin - ich will nicht einbetten, das muss ohne gehen - werde ich morgen zur Karotte greifen. Ohne AFE-Fixierung ist das Material scheinbar deutlich weicher, aber ich möchte das lernen (es geht mir um das Hand-Mikrotom). ==> Rolf-Dieter zeigt ja immer wie gut das geht ...

Wie dick würdet ihr den frischen Wurmfarn schneiden, meine Tests sind im Bereich zwischen 0,03 und 0,06 mm gelaufen ==> für UV-Anregung eigentlich immer noch zu dick, mein Ausschuss war bei deutlich über 95%, es gibt also auch Zufallstreffer :-)) So eine Quote habe ich normal nicht ... Es waren heute auch Linde 0,02 und 0,03 dran, allerdings am Jung HN-40 (kritisch betrachteter Ausschuss deutlich unter 20% und das bei über 300 Schnitten) ...

Mein Problem ist sicher die Fixierung des Schnittguts, die Linde habe ich auf einen Buchenblock aufgeklebt und wenn die Rinde nicht ein/ausgerissen ist war jeder Schnitt ein Treffer ...

Na' mal schauen wie das mit der Karotte geht, morgen am Abend kann ich mehr sagen ...

:-)

Gerhard
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Re: Gemeiner Frauenfarn (Athyrium filix-femina) – Farnwedel quer
« Antwort #14 am: Juni 26, 2012, 22:21:30 Nachmittag »
Hallo Eckhard

Ohne Deinen Tipp hätte ich in besagten Fall nicht zur Karotte gegriffen, es hat funktioniert und die Ausbeute drastisch angehoben. Die Minifusseln waren wieder da und ich habe etlichen Aufwand betrieben sie wieder weg zu bringen. Ich gehe da ja im Normalfall über drei Ethanol-Bäder (50 bis 70%, so genau ist das an der Stelle nicht). In das erste kommt der Schnitt mit der Karotte ==> zur Trennung, bei mir trennen sich nicht alle am Messer (habe am Jung HN-40 mit C-Messer geschnitten) Messer und Präparat Ethanolbenetzt ...

Am zweiten Bad habe ich das Gefühl noch eine leichte Schicht von Karottenschwebstoffen an der Oberfläche zu sehen, unter der 10x Lupe wird mit dem Pinsel nachgeholfen ...

Das 3. hat diesen Film nicht mehr an der Oberfläche ...

Das Ergebnis wurde Heute für Färbeversuche verwendet, die Lupenkontrolle ergab keine Probleme ...

Was mir aber aufgefallen ist, die Karotte färbt sehr leicht ==> Vergleiche mit ohne Karotte erzeugten Schnitten (Klorix beseitigt den leichten Farbstich aber restlos) ==> macht Ihr diese Beobachtung auch?!?

Noch einmal danke, ich habe die Karotte das erste Mal um Jung eingesetzt, bisher war die Technik nur dem AO-900 und dem Hand-Mikrotom vorbehalten ...

:-)

Gerhard
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