Autor Thema: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel  (Gelesen 49189 mal)

Fahrenheit

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #30 am: März 18, 2009, 22:30:08 Nachmittag »
Guten Abend zusammen!

Hier - wie oben angekündigt - der Vollständigkeit halber das alte Eingangsposting.

Für diejenigen, die hier unten eingestiegen sind: im ersten Posting gibt es nun eine PDF-Datei mit der kompletten Präparationsanleitung.

Vielen Dank!
Jörg

Hallo liebe Forumsmitglieder,

heute möchte ich einmal die Präparation von Pflanzenschnitten in Word und Bild vorstellen und bitte dabei um Eure / Ihre Tipps und Hinweise, wo ich etwas verbessern kann. Achtung - langer Beitrag  ;)
Ich hoffe, die Darstellung ist OK und ich langweile nicht mit Selbstverständlichkeiten.

Ausgangsmaterial ist ein Nadelstück einer Schirmtanne, das nun seit geraumer Zeit in AFE (Alkohol 96%, Formalin Lösung 35% und Essigsäure 96%) gelegen hat. Einige mögen sich noch an meinen Einstands-Thread erinnern, da ging es um das frische Material.

Schritt 1: Handschnitt in Holundermark
Das noch AFE-feuchte Probestück habe ich zurechtgeschnitten und in ein passendes Stück Holundermark eingebettet. Geschnitten habe ich mit einer einseitig gefassten Rasierklinge aus der Hand.
Das Ergebnis waren 15 unterschiedlich dicke Schnitte, die mir einigermaßen brauchbar erschienen - und jede Menge Ausschuss.


Bild 1: Eingebettete Probe. Um sauberere Schnitte zu ermöglichen und ein schnelles Abstumpfen der Klinge zu vermeiden, ist es empfehlenswert, das obere Ende des Holundermarks in Form eines Pyramidenstumpfes zuzuschneiden. Somit muß man nicht durch die am Aussenrand liegenden Leitbündel schneiden.
Dies habe ich hier nicht gemacht - man kann die Leitbündel am Rand noch gut erkennen.


Bild 2: bekantete Holundermarkstücke bereit zur Aufnahme einer Probe


Bild 3: Einer der Schnitte frisch von der Klinge in Wasser unter dem Deckglas (40x mit Leica C-Plan 4x)

Schritt 2: Wässern
Ausspülen der AFE Fixierung für zwei mal ca. 5 Minuten und anschließend 15 Minuten in jeweils ca. 5 ml destilliertem Wasser.
Ein Bleichen mit z.B. Klorix habe ich unterlassen. Dies führt meiner Meinung nach vor allem beim Palisadenparenchym später zu etwas unsauberen Farben. Andererseits bleiben die Plasten in den Zellen erhalten und sichtbar.


Bild 4: Wässern

Schritt 3: Färben mit Etzolds Gemisch
Nach dem Wässern habe ich die Schnitte in eine stark verdünnte Etzold-Lösung gelegt (3 Tropfen Etzold auf ca. 5 ml Destilliertes Wasser). Die Einwirkzeit betrug 24 Stunden. Im Ergebnis waren die Schnitte sehr intensiv angefärbt, 2 Tropfen auf 5 ml hätten wohl gereicht.


Bild 5: Beginn des Farbbads


Bild 6: Ende des Farbbads

Schitt 4: Arrangieren und Eindecken
Nach dem Färben wurden die Schnitte in Isopropanol entwässert. Dazu habe ich die Schnitte in wiederum ca. 5ml Isopropanol überführt und dort zwischen 10 und 30 Minuten liegen lassen. Ich habe einige Präparate angefertigt und dazu die Schnitte nach Bedarf aus dem Isopropanolbad entnommen.

Um das Ausbluten des roten Farbstoffs der Etzold-Lösung (Fuchsin) gering halten zu können, ist es sicher besser, nur die gerade zur Weiterverarbeitung anstehenden Schnitte zu behandeln. Das kann auch auf dem Objektträger mit einigen Tropfen Isopropanol geschehen, die dann aber mindestens 3, besser 5 mal durch Absaugen und erneutes Auftropfen gewechselt werden sollten.
Anhaftendes Wasser sollte bei diesen geringen Alkoholmengen vor dem ersten Schritt z.B. mit Filterpapier vorsichtig aufgenommen werden. Verweildauer in der ersten Stufe max. 15 Sekunden.

Am Schnitt haftende Luftblasen weisen auf eine nicht ausreichende Entwässerung hin.

Eingedeckt habe ich mit Euparal. Zum Auftropfen benutze ich ein Holzspießchen.
Euparal ist gegenüber kleineren Luftblasen recht tolerant, diese verschwinden in der Regel in den ersten 3 Tagen des Aushärtens.


Bild 7: Arrangieren der Schnitte auf dem gereinigten Objektträger mit Hilfe einer Schablone. Die Handhabung der Schnitte erfolgt mit einem feinen Maderhaar-Pinsel.


Bild 8: Frisch eingedecktes Präparat

Schritt 5: Überprüfen der Präparate
Nach dem Eindecken habe ich die Präparate geprüft. Übrig geblieben sind 4 Objektträger. Davon 3 mit 2 und einer mit 4 Schnitten. Der Rest war unbrauchbar: zu dick und/oder zu lange im Isopropanolbad.

Nach der Prüfung ging es mit M8 Muttern beschwert für 3 Tage auf die Heizung zum aushärten. Durch den Volumenverlust des Euparals musste ich bei zwei Präparaten während des Aushärtens etwas Eindeckmittel nachtropfen.

Hier zwei Bilder von den frisch eingedeckten Präparaten:


Bild 9: Ausschnitt aus einem Schnitt bei 200-facher Vergrößerung mit Palisadenparenchym und Harzkanal (photografiert durchs Okular mit Canon S3IS - Leica C-Plan 20x, nicht nachbearbeitet)


Bild 10: Leitbündel der Nadel ebenfalls bei 200-facher Vergrößerung. Die rote Farbe hat unter dem zu langen Bad im Isopropanol gelitten. Technik wie bei Bild 8.


Bild 11: beschwertes Präparat. Je nach Präparat beschwere ich mit bis zu 4 Muttern.

Schritt 6: Beschriften und Fertig  :)
Hier ein paar Bilder von den besten Schnitten nach dem Aushärten - nach den 3 Tagen auf der Heizung haben die Präparate noch drei weitere Tage waagerecht gelegen.

Im Vergleich zu den frisch eingedeckten Präparaten sind die Bilder nun viel klarer und die Farben kommen besser heraus.


Bild 12: Übersicht über eine Nadelhälfte bei 40-facher Vergrößerung. (photografiert durchs Okular mit Canon S3IS - Leica C-Plan 4x, leicht nachgeschärft).
Die inhomogene Beleuchtung ist beim Blick durch das Okular für das Auge kaum zu erkennen. Ich habe nach besten Wissen und Gewissen geköhlert. Was könnte das sein?


Bild 13: Ausschnitt bei 100-facher Vergrößerung mit Leitbündel und Harzkanälen. Technik wie bei Bild 11, nur mit dem Leica C-Plan 10x.


Bild 14: das Leitbündel bei 200-facher Vergrößerung. Technik wie bei Bild 11, nur mit dem Leica C-Plan 20x.


Bild 15: Die beschrifteten Präparate. Der Einfachheit halber mit passenden Klebeetiketten, die Langzeitstabilität ist allerdings nicht garantiert.
Die Beschriftung sollte auf der linken Seite den Namen des Objektes und ggf. den wissenschaftlichen Namen enthalten, sowie die Kurzbeschreibung des Präparats ("Nadel quer"). Auf das rechte Etikett gehören der Name des Präparators, Einschlussmittel und ggf. Art der Färbung sowie das Erstellungsdatum.
Die Euparalkleckse rühren vom Nachtropfen her. Das läßt sich vermeiden, wenn man gleich die richtige Menge erwischt und beim Aushärten korrekt belastet.

Allen, die bis zum Ende durchgehalten haben, vielen Dank!  ;D

Ich freue mich auf Eure / Ihre Anregung und Kritik.

Einen Schönen Abend!
Jörg

Nachtrag: Einige Typos beseitigt und Ergänzungen anhand der Tipps aus den anhängenden Postings vorgenommen. Für die Tipps auch hier noch mal vielen Dank!
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fschumm

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #31 am: Mai 18, 2009, 10:54:31 Vormittag »
Bei der Gelegenheit möchte ich doch anregen statt Etzold, das besonders in Kursen geschickt ist, auch mal wieder, wenn man Zeit hat, nacheinander zu färben, da man mehr Einfluß auf das Resultat hat.
Bsp.
wässriges bas. Fuchsin
Beizen in 1-2% Pikrinsäurelösung
Differenzieren in Spiritus
Gegenfärben mit Anilinblau, Astrablau, Malachitgrün, Lichtgrün oder ähnlichem
Entwässern bei Lichtgrün das in Alkohol schnell ausgezogen wird besser in Äthylglycol, n-Butanol oder ähnlichem
Intermedium (z.B. Methylbenzoat, Xylol, ....)
Einschlussmittel

ungewohnte Bilder liefert z.B.
essigsaure wässrige Malachitgrünlösung (verholzte Teile)
Beizen mit Phosporwolframsäure, Phosphormolybdänsäure oder Tannin-Brechweinstein um Entwässerung zu überstehen
Gegenfärben mit Kongorot
weiter wie üblich, Entwässerung, Einschlußmedium

F. Schumm
FS

42

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #32 am: März 16, 2012, 10:59:12 Vormittag »
Vielen Dank für diesen wertvollen Beitrag.
« Letzte Änderung: März 16, 2012, 11:09:20 Vormittag von 42 »
MfG
Christian

Fahrenheit

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #33 am: März 16, 2012, 16:16:26 Nachmittag »
Lieber Christian,

gerne! Schön, dass er Dir geholfen hat.

Weitere Anleitungen zu Fixierung, Schnitt und Färbung botanischer Präparate findest Du auch auf der Webseite des Mikroskopischen Kollegiums Bonn in der Bibliothek unter "http://Botanische Mikrotechnik". Passende Arbeitspläne kannst Du im Downloadbereich der Seite herunter laden.

Herzliche Grüße
Jörg
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Wutsdorff Peter

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #34 am: Mai 17, 2017, 12:08:32 Nachmittag »
Grüß Dich Jörg,
wie muß ich vorgehen, wenn ich mit Glyzeringelanine eindecken will?
Die Probe liegt in AFE.
Dann in Stufen wässern? Färben, und dann  in Glyz. eindecken?
Kann man auf das Stufebwässern vor dem Färben verzichten, gleich Färben und mit Glyz. eindecken?

Danke für die Hilfe

               Gruß Peter

Fahrenheit

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #35 am: Mai 17, 2017, 13:03:02 Nachmittag »
Lieber Peter,

Ja. Um färben zu können, musst Du aus dem AFE ins Aqua dest., das sollte stufenweise geschehen, um die Schnitte nicht zu sehr zu belasten.
Daran führt kein Weg vorbei, zumal das AFE das Aufziehen und die Haltbarkeit der Farben stark beeinflusst.
Nach dem Färben musst Du gut mit Aqua dest. spülen, um überflüssige Farbe zu entfernen.
Nach allem, was ich weiß, kannst Du aus dem Aqua dest. gleich in Gylzeringelatine eindecken.

Zur Haltbarkeit solcher Präparate kann ich nichts sagen, würde bei Pflanzenschnitten heute aber immer den Weg über Isopropanol ins Euparal empfehlen.

Herzliche Grüße
Jörg
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Wutsdorff Peter

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Re: Von der Probe zum Präparat - Präparieranleitung mit einfachen Mittel
« Antwort #36 am: Mai 17, 2017, 17:46:24 Nachmittag »
Guten Abend Jörg,
vielen Dank für die schnelle Antwort.
Ich habe ein kleines Exkursionsmikrosk. von Meopta erworben, das ich in die Ferien mitnehme.
Mit  Glyc-Gelant. geht es schneller, zumal ich keine Dauerpräp. anfertigen will.
Jetzt weiß ich wie es geht.

Gruß  Peter

Wutsdorff Peter

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Differenzieren: Chlorix, Essigsäure +Ethanol, HCL
« Antwort #37 am: Juni 10, 2018, 19:00:53 Nachmittag »
Guten Abend Jörg und an die übrigen Experten,