Salix alba (Silber-Weide) Schnitt und Einbettung

Winfried Todt · November 24, 2012, 19:56:58 NACHMITTAGS

Hallo liebe Leser,

ich möchte Euch an meinen ersten Färbeversuchen teilhaben lassen.
Als Objekt diente mir Salix alba. Die frischen Zweige habe ich in Kerzenwachs eingegossen und dann mit meinen Rotationsmikrotom geschnitten (Schnittstärke laut Einstellung 40µm).

Das Schneiden ging einigermaßen problemlos. Die Schwierigkeit bestand nur darin, Schnitte zu finden, die auch noch das ,,Mark" in der Mitte des Zweiges hatten. Dies war bei ungefähr 10% der Schnitte der Fall.
Die Schnitte, die sich zu einer Art Zigarre aufgerollt hatten, habe ich in einem Wasserbad von ca. 55-58°C (gemessene Temperatur) vom Wachs befreit. Beim Herausnehmen der Schnitte aus dem Wasserbad sind mir viele Schnitte verdorben, da sie sich selbst wieder, mit dem für mich unsichtbar gewordenem, auf der Wasseroberfläche schwimmenden flüssigen Wachs, überzogen hatten und es mir nicht mehr gelungen ist diesen Wachsüberzug zu entfernen.
Die brauchbaren Schnitte habe ich kurz (ca. 15 Minuten) in Alkohol fixiert und dann in die Färbelösung gegeben. Ich habe Etzold-grün verwendet. Die Färbelösung habe ich in eine Vertiefung meiner Tüpfelplatte gegeben; das spart Färbelösung.
Während des Färbens habe ich die Schnitte regelmäßig aus der Färbelösung genommen und mit der Lupe kontrolliert, bis eine Differenzierung in der Färbung zu erkennen war.
Die gefärbten Schnitte habe ich auf den Objektträger gegeben und mit Zellstoff (Toilettenpapier) abgetupft und dann mit Euparal eingedeckt.
Nach dem Eindecken stellte ich fest, das sich die Farben verändert hatten. Sie waren alle samt blasser geworden und sahen aschgrau aus. Auf Probe hatte sich eine Art Nebelschleier in Form von unzähligen kleinsten Blasen ausgebreitet, die an einen beschlagenen Spiegel erinnerten. Selbst Versuche mit dem Exsikkator scheiterten, diese Bläschen zu entfernen.

Nach ca. einer Woche Lagerzeit bei Zimmertemperatur, ich wollte die Proben schon wegschmeißen, da ich meinte, das sie unbrauchbar seien, waren diese Blasen verschwunden. Das Aschgrau hatte sich wieder in Farbe verwandelt, allerdings waren die Farben stark gedunkelt und die ursprünglich beobachtet Differenzierung war nicht mehr so deutlich zu erkennen. Mit dem Ergebnis bin ich nicht zufrieden.

Ich freue mich über Anregungen und Hinweise.
Herzliche Grüße
Winfried

Klaus Herrmann · November 24, 2012, 20:36:21 NACHMITTAGS

Hallo Winfried,

kann sein du hast das Rot zu stark ausgezogen, kann auch sein, dass der Ansatz zu viel (teures) Grün enthält, dann sollte ich dir noch etwas Rotkomponente separat schicken mit dem du kurz vorfärbst.
Das Grün kommt ja sehr schön.
Wenn du nicht richtig mit Isopropanol entwässert hast, gibt es milchige Verfärbungen und weil noch Wasser im Schnitt ist wird das Rot ausgezogen. Das wäre der erste Ansatz zur Fehlerbehebung: sorgfältig entwässern, bevor Euparal drauf kommt.

Winfried Todt · November 24, 2012, 21:09:05 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

ich vermute erst einmal nicht, das es an der Färbelösung liegt.
Bei der Entwässerung sehe ich ein Problem, da ich sie mit meinen Mitteln nicht überprüfen kann; jedenfalls kenne ich keine entsprechende Methode. Ich vermute aber, dass wenn die dünnen Schnitte für mindestens 15 Minuten in 99% Alkohol gelegen haben, dass sie entwässert sein sollten.
Herzliche Grüße
Winfried

Klaus Herrmann · November 24, 2012, 21:56:52 NACHMITTAGS

Hallo Winfried,

nach meiner Erfahrung ist es gut nach dem Auspülen mit Wasser - um Farbreste zu entfernen - das Wasser weitgehend abzuschütteln und dann rasch mit 100% Isopropanol spülen um möglichst viel Wasserreste zu entfernen, dann mit neuer Menge Isoprop ein 2. Mal etwa 30 sec. und dann nochmal mit frischem 1-2 Minuten ganz entwässern (wenn die Schnitte dicker als 30 µm sind 5 Minuten).
Dann noch feucht vom Isoprop eindecken mit Euparal.

Ob die Färbung gelungen ist prüft man ganz am Anfang am wasserfeuchten Präparat.

Winfried Todt · November 24, 2012, 22:19:25 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

die Färbereste habe ich nicht mit Wasser ausgespült, sondern mit 99,9% Isopropanol. Dazu habe ich die Schnitte mit dem Pinsel mehrfach im Alkohol verrührt (bewegt). Ich werde also in Zukunft noch eine zweite und dritte Alkoholstufe einlegen.
Wie lange dürfen die gefärbten Schnitte im Alkohol verbleiben?
Herzliche Grüße
Winfried

Klaus Herrmann · November 24, 2012, 22:28:44 NACHMITTAGS

Hallo Winfried,

das Ausspülen mit Wasser ist schon zwingend; wenn keine Farbwolken mehr abgehen wird weitergemacht wie beschrieben!

Winfried Todt · November 24, 2012, 23:50:24 NACHMITTAGS

Hallo Klaus,

ich möchte mich bei Dir bedanken, dass Du so geduldig meine Fragen beantwortest. Jede Antwort löst gleich neue Fragen bei mir aus. Ich möchte lernen und das geht halt nur durch Selbermachen und Hinterfragen.

Wenn ich unsere Diskussion jetzt zusammen fasse ergibt sich folgende Reihenfolge beim Färben:
No.: 1 Die Schnitte werden im warmen Wasserbad vom Kerzenwachs befreit.
No.: 2 Die Schnitte werden in 99,9% Isopropanol fixiert.
No.: 3 Die Schnitte werden in Etzold-grün gefärbt.
No.: 4 Die Schnitte werden mit Wasser gespült um Färbereste zu entfernen.
No,: 5 Die Schnitte werden in 99,9% Isopropanol überführt um sie zu entwässern.
No.: 6 Die entwässerten Schnitte werden in (oder mit) Euparal eingedeckt.

Warum kann ich bei Schritt No. 4 zum Entfernen der Färbereste keinen Alkohol verwenden?

Herzliche Grüße
Winfried

Klaus Herrmann · November 25, 2012, 10:37:26 VORMITTAG

Hallo Winfried,

geben und nehmen:
ich beantworte dir Frage 4, wenn du mir erklärst, wieso du das Kerzenwachs mit heißem Wasser entfernst, und nicht, wie man das seit 100 Jahren macht mit einem geeigneten Lösemittel? (Xylol nehmen auch heute noch viele, aber Rotihistol ist das offizielle Ersatzmittel dafür, das angeblich gesund sein soll, aber diese Diskussion will ich damit nicht auslösen) Zusatzfrage: warum Kerzenwachs und nicht Paraffin für die Histologie?

# Nr 4: Die Entfernung der Farbreste, die nicht auf das Gewebe aufgezogen haben geht mit Wasser schonender, weil dann gut und ausreichend lange gespült werden kann, ohne dass wieder Farbstoff durch wässrigen Alkohol aus dem Gewebe gezogen wird. Die Phase Alkohol mit etwas Wasser muss sehr rasch durchschritten werden, damit besonders die Rot-Töne nicht ausgezogen werden. Wenn man mal im wasserfreien Isopropanol ist passiert nichts mehr.

Winfried Todt · November 25, 2012, 11:24:13 VORMITTAG

Hallo Klaus,

Kerzenwachs nehme ich, da ich die Kerzen vorrätig habe und die Proben ja nicht mit Wachs infiltriert werden, sondern nur eingegossen. Anderenfalls hätte ich mir ein Histo-Wachs gekauft.
Die Schnitte haben sich im Wachs eingerollt und sollten sich im warmen Wasser entrollen (entspannen).
Xylol habe ich mir noch nicht gekauft, aber dies werde ich nachholen, da ich gelesen habe, dass man Xylol auch zum Reinigen der Mikroskop-Optiken benutzen kann.

zu No. 4: Jetzt habe ich das mit dem Alkohol und dem Wasser verstanden.

Herzlichen Dank
Winfried

Klaus Henkel · November 26, 2012, 15:27:54 NACHMITTAGS

Zitat von: Winfried Todt in November 25, 2012, 11:24:13 VORMITTAG
Hallo Klaus,

Kerzenwachs nehme ich, da ich die Kerzen vorrätig habe und die Proben ja nicht mit Wachs infiltriert werden, sondern nur eingegossen. Anderenfalls hätte ich mir ein Histo-Wachs gekauft.
Die Schnitte haben sich im Wachs eingerollt und sollten sich im warmen Wasser entrollen (entspannen).
Xylol habe ich mir noch nicht gekauft, aber dies werde ich nachholen, da ich gelesen habe, dass man Xylol auch zum Reinigen der Mikroskop-Optiken benutzen kann.

zu No. 4: Jetzt habe ich das mit dem Alkohol und dem Wasser verstanden.

Herzlichen Dank
Winfried

NEIN ... NEIN!

Können Sie mir sagen, lieber Herr Todt, wo Sie das gelesen haben? Verwenden niemals Xylol zum Optikreinigen.
Gruß KH

Winfried Todt · November 26, 2012, 17:17:33 NACHMITTAGS

Verehrter Herr Henkel,

dies habe ich in der Gebrauchsanleitung zum Zeiss STANDARD GFL und WL gelesen. Dort steht auf Seite 15:

Pflege und Behandlung des Geräts
. . . ,,Die Reinigung des Geräts soll sich auf äußere Flächen beschränken. Staub von optischen Teilen mit einem vorher gut in Äther entfetteten Pinsel entfernen, fester haftende Verunreinigungen mit einem staubfreien, weichen Leinenlappen (nicht Leder). Dieser kann mit Lösungsmitteln - etwa Benzin oder Xylol, jedoch nicht Alkohol (Spiritus)! - leicht angefeuchtet sein."

Herzliche Grüße
Winfried

Klaus Henkel · November 26, 2012, 17:34:34 NACHMITTAGS

Zitat von: Winfried Todt in November 26, 2012, 17:17:33 NACHMITTAGS
Verehrter Herr Henkel,

dies habe ich in der Gebrauchsanleitung zum Zeiss STANDARD GFL und WL gelesen. Dort steht auf Seite 15:

Pflege und Behandlung des Geräts
. . . ,,Die Reinigung des Geräts soll sich auf äußere Flächen beschränken. Staub von optischen Teilen mit einem vorher gut in Äther entfetteten Pinsel entfernen, fester haftende Verunreinigungen mit einem staubfreien, weichen Leinenlappen (nicht Leder). Dieser kann mit Lösungsmitteln - etwa Benzin oder Xylol, jedoch nicht Alkohol (Spiritus)! - leicht angefeuchtet sein."

Herzliche Grüße
Winfried

Danke für die Quellenangabe.
Kommentar dazu: Erstens ist zu berücksichtigen, daß diese Anleitungen vor etwa 45 Jahren geschrieben wurden. Inzwischen sind die Klebetechniken für Linsen und Abdichtung der Fassungen anders. Und in so vielen Jahrzehnten bleiben auch neue Erfahrungen nicht aus.
Zweitens: Ich werde hier einmal den von Ihnen wiedergegebenen Text so verändern, daß er verständlicher ist:

,,Die Reinigung des Geräts soll sich auf äußere Flächen beschränken. Staub von optischen Teilen hingegen mit einem vorher gut in Äther entfetteten Pinsel entfernen, fester haftende Verunreinigungen an den mechanischen Teilen des Stativs mit einem staubfreien, weichen Leinenlappen (nicht Leder). Dieser kann mit Lösungsmitteln - etwa Benzin ~~oder Xylol~~, jedoch nicht Alkohol (Spiritus)! - leicht angefeuchtet sein."

Xylol würde ich noch nicht einmal an die Objektivfassungen bringen. Nur allzu leicht gerät dann davon etwas an den Fassungsrand und wird durch allerfeinste Kapillarrisse im Dichtungskitt, die bei so alten Objektiven meist vorhanden sind, ins Innere gesogen. Dort löst das Xylol dann den Balsam zwischen den Objektivlinsen an. Und dann ...

Gruß KH

Michael W. · November 26, 2012, 17:49:31 NACHMITTAGS

Hallo Herr Henkel,

Xylol wurde vor 1970 in vielen Schriften als Lösungsmittel zur Reinigung optischer Teile genannt. Hier z.B. in der Bedienungsanleitung vom Universal (1969):

ZitatBehandeln Sie optische Teile erst mit Lösungsmitteln, wenn Anhauchen (destilliertes Wasser) nicht zum Ziel führt. Als Lösungsmittel sind in sparsamer Form Aceton, Xylol oder reines
Benzin zulässig - niemals jedoch Alkohol, der die Kittflächen der optischen Systeme zerstören würde.

An anderer Stelle wurde es auch zum Entfernen von Immersionsmitteln empfohlen:

ZitatSofort nach Beendigung der Arbeiten sind die Immersionsmittel von den Objektiven zu entfernen. Dazu ein weiches, leicht mit Benzin oder Xylol angefeuchtetes Tuch benutzen. Alkohol
darf nicht verwendet werden.

Ein paar Jahre später wurde aber dann von Xylol ausdrücklich abgeraten. Auch bei anderen Herstellern habe ich schon gelesen, dass man niemals Xylol verwenden sollte. Das ist auch der Grund, warum ich es niemals verwenden würde. Außerdem hinterlässt Xylol mehr Schlieren als andere Mittelchen. Leichtere Verschmutzungen werden bei mir immer ohne Lösungsmittel enfernt (fast immer) und wenn das nichts hilft, Isopropanol bzw. Wundbenzin.

Viele Grüße
Michael

Winfried Todt · November 26, 2012, 17:50:11 NACHMITTAGS

Verehrter Herr Henkel,

danke für die schnelle Antwort. Ich habe vor ein paar Tagen mein Zeiss GFL bekommen und lese momentan viele Anleitungen zu dem Mikroskop und in den unterschiedlichsten Ausgaben wurde sogar zum Reinigen von Immersionsöl-Objektiven Xylol empfohlen.

Ich verspreche: "Ich nehme kein Xylol zu Reinigen von Optiken"

Herzlichen Dank für die Aufklärung
Winfried

Ergänzung: Da war Michael schneller

Klaus Henkel · November 26, 2012, 18:07:18 NACHMITTAGS

Zitat von: Winfried Todt in November 26, 2012, 17:50:11 NACHMITTAGS
Verehrter Herr Henkel,

danke für die schnelle Antwort. Ich habe vor ein paar Tagen mein Zeiss GFL bekommen und lese momentan viele Anleitungen zu dem Mikroskop und in den unterschiedlichsten Ausgaben wurde sogar zum Reinigen von Immersionsöl-Objektiven Xylol empfohlen.

Ergänzung: Da war Michael schneller

Auch dazu Kommentar: Die Immersionsöle damals sind leicht verbackt und verklumpt. Wenn man nicht alsbald abgewischt hat, half tatsächlich nur noch ein Lösungsmittel - mit allen Risiken. Die heutigen Imm.öle verbacken nicht mehr, es genügt, das Obkektiv täglich ein Mal sanft abzuwischen, vorsichtig, ohne Druck, am besten mit einem weichen, oft gewaschenen Baumwolltaschentuch.
Ein "oft gewaschenes Leinenläppchen" wie es früher meist empfohlen wurde, möchte ich aus heutiger Sicht ebenfalls ablehnen. Darunter wurde ein Leinentüchlein verstanden, das etwa 20 Jahre lang mindestens allmonatlich ausgewaschen worden war. Heutige Leinengewebe halten gar nicht so lange, und neu sind sie selbst nach 10 Wäschen so hart, daß man sich bei Schnupfen damit eine blutige Nase holen kann. - Es gibt viele "blindgescheuerte" Frontlinsen!

Gruß KH