Autor Thema: Kontrast und Auflösung in der Praxis  (Gelesen 8323 mal)

Nomarski

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Kontrast und Auflösung in der Praxis
« am: Februar 11, 2013, 19:04:50 Nachmittag »
Hallo Forum.

Es kommt hin und wieder vor, daß Diatomeen in einem Präparat nahezu unauffindbar werden und sie praktisch beim Durchmustern übersieht, obwohl sie nicht sonderlich klein sind. Der Grund ist, daß sie ziemlich dünn sind und der Brechungsindex zum Einbettungsmedium fast identisch ist. Was kann man tun?

Die folgenden Aufnahmen wurden durch ein Neofluar 25/0,6 gemacht, die Apertur sollte also gerade noch für die Auflösung einer Pleurosigma reichen.


Das erste Bild zeigt eine Hellfeldaufnahme, es wurde mit der Iris 1/3 abgeblendet.


Da es ein Phasenobjektiv ist, schauen wir mal, wie sich die Kieselalge im Phasenkontrast verhält. Kontrast ist zwar da, aber keine Auflösung der Struktur.


Die Schiefe Beleuchtung bringt nun zwar die Struktur zum Vorschein, aber der Kontrast ist immer noch relativ schwach.


Im Dunkelfeld, mit dem sich prinzipiell jedes Mikroskop ausstatten läßt, ist die Struktur erkennbar.

Mit stärkeren Objektiven und höheren Aperturen geht zwar alles besser, keine Frage, aber gerade in solchen Grenzsituationen lassen sich die Vor- und Nachteile verschiedener Kontrastverfahren gut erkennen.

Viele Grüße
Bernd

Winfried Todt

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #1 am: Februar 11, 2013, 19:31:26 Nachmittag »
Hallo Bernd,

eine gelungene und lehrreiche Dokumentation.

Herzliche Grüße
Winfried

BergerN

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #2 am: Februar 11, 2013, 22:12:28 Nachmittag »
Hallo Bernd,
könnten die drei Bilder auch durch ein "stacking" Verfahren ihre Bildinformationen vereinen?
Danke für's zeigen.
Nick

Nomarski

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #3 am: Februar 11, 2013, 22:39:20 Nachmittag »
Hallo Winfried, hallo Nick,

vielen Dank für euer Interesse.
Wie sollte das Stacking-Verfahren denn stattfinden? Wäre das auch etwas für die Mikroskopiker, die nur visuell beobachten? Also muß es am Mikroskop passieren und nicht am PC.

Viele Grüße
Bernd

Hugo Halfmann

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #4 am: Februar 11, 2013, 23:04:46 Nachmittag »
Hallo Bernd,

eine schöne und gut verständliche Darstellung. Danke !
Viele Grüße aus dem Bergischen Land

Hugo Halfmann

rhamvossen

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #5 am: Februar 12, 2013, 16:33:17 Nachmittag »
Hallo Bernd,

Ich finde das die Struktur von P angulatum besser mit Schiefe Beleuchtung oder Kreisformig schiefe Beleuchtung zu zehen ist als mit Dunkelfeld. Das heisst, mit "normales" Dunkelfeld. Das Dunkelfeld was man mit der Heine Kondensor machen kan ist eine andere Sache. Damit sehe ich die Struktur von Pleurosigma schon mit ein Leitz 25/0.50 Achromat. Und mit "off axis" Kreisformige schiefe Beleuchtung mit der Heine Kondensor ist es noch besser zu sehen. Beste Grüsse,

Rolf
« Letzte Änderung: Februar 12, 2013, 16:48:47 Nachmittag von rhamvossen »

Nomarski

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #6 am: Februar 12, 2013, 17:06:27 Nachmittag »
Hallo Rolf,

ich sehe selber, daß diese Aufnahmen in der zur Verfügung stehenden Forumsdarstellung etwas bescheiden rüberkommen. Visuell oder direkt am Bildbetrachter, wo man noch zoomen kann, wirkt das anders und es wird dann sogar noch die Struktur beim ersten Bild erkennbar. Einige andere mögliche Kontrastverfahren habe ich nun bewusst weggelassen, da es wieder nur Verwirrung und Aufruhr stiftet. Aber du darfst gerne hier eine Pleurosigma mit deinem Leitz 25/0,50 Achromat posten.

Viele Grüße
Bernd


rhamvossen

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #7 am: Februar 12, 2013, 18:11:50 Nachmittag »
Hallo Bernd,

Hier 2 Ausschnitt Bilder von P angulatum, Dunkelfeld und Kreisformige schiefe Beleuchtung (Kondensor dezentriert) mit der Heine Kondensor, Leitz 25/0.50 Achromat, im Dunkelfeld wird die Struktur nicht ganz aufgelöst.





Beste Grüsse,

Rolf


purkinje

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #8 am: Februar 12, 2013, 18:34:09 Nachmittag »
Hallo Bernd und alle Kontrastkundigen,

ich finde auch, dass es schön und klar dargestellt ist.
Weil wir gerade beim Thema Kontrast, Auflösung und Testdiatomeen sind, eine Frage an den/die  Kontrastkundigen:
Gemaß dieser, schon mal gezeigten Tabelle (http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9100.0) dürfte sich Frustulia rhomboides und Amphipleura pellucida nicht bzgl. der Auflösung unterscheiden (erforderliche Apertur 1,3-1,4) Ich schaffe aber im Hellfed, wie im Dunkelfeld mit meinem Testpräparat (Kemp) eigentlich nur Frustulia rhomboides aufzulösen- Woran könnte das liegen?
Stimmt die Tabelle von Göke mit der Erfahrungswirklichkeit überein?
Beste Grüße
Stefan

reblaus

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #9 am: Februar 12, 2013, 18:54:14 Nachmittag »
Hallo -

bei P. angulatum hatte ich den subjektiven Eindruck, dass sich die Areolen verschiedener Exemplare in der Größe unterscheiden. Weiß hier jemand mehr? Kann es sein, das sich die Verkleinerung während der vegetativen Zellteilung auch auf die Größe der Areolen auswirkt? In den erwähnten Grenzsituationen könnte sich das dann vielleicht bemerkbar machen.

Viele Grüße

Rolf

Eckhard F. H.

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #10 am: Februar 12, 2013, 19:22:09 Nachmittag »
Zitat
...und der Brechungsindex zum Einbettungsmedium fast identisch ist.
Hallo Bernd!
Ein interessanter Nachsatz. Wäre nicht schlecht, fände er im Forum Widerhall. :)
Gruß - EFH

Tausendblatt

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #11 am: Februar 12, 2013, 20:13:54 Nachmittag »
Hallo,

es ist schon möglich die Poren von Amphipleura pellucida im Dunkelfeld
darzustellen, allerdings muss man alles auffahren, was auflösungsoptimierend ist:
Höchstmögliche Kondensorapertur, kurzwelliges Licht (z.B. Blau 450 nm) und die gerade noch
dunkelfeldfähige Objektivapertur (etwa 1,3), für den Kontrast eventuell polarisiertes Licht.

Die Bilder dazu hier: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=15360.msg118508#msg118508

Viele Dunkelfeldgrüße

Jens

Zitat
Hallo Bernd und alle Kontrastkundigen,
ich finde auch, dass es schön und klar dargestellt ist.
Weil wir gerade beim Thema Kontrast, Auflösung und Testdiatomeen sind, eine Frage an den/die  Kontrastkundigen:
Gemaß dieser, schon mal gezeigten Tabelle (http://www.mikroskopie-fo...de/index.php?topic=9100.0) dürfte sich Frustulia rhomboides und Amphipleura pellucida nicht bzgl. der Auflösung unterscheiden (erforderliche Apertur 1,3-1,4) Ich schaffe aber im Hellfed, wie im Dunkelfeld mit meinem Testpräparat (Kemp) eigentlich nur Frustulia rhomboides aufzulösen- Woran könnte das liegen?
Stimmt die Tabelle von Göke mit der Erfahrungswirklichkeit überein?
« Letzte Änderung: Februar 12, 2013, 21:58:15 Nachmittag von Tausendblatt »

Gunther Chmela

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #12 am: Februar 12, 2013, 22:37:13 Nachmittag »
Gemaß dieser, schon mal gezeigten Tabelle (http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=9100.0) dürfte sich Frustulia rhomboides und Amphipleura pellucida nicht bzgl. der Auflösung unterscheiden (erforderliche Apertur 1,3-1,4) Ich schaffe aber im Hellfed, wie im Dunkelfeld mit meinem Testpräparat (Kemp) eigentlich nur Frustulia rhomboides aufzulösen- Woran könnte das liegen?
Stimmt die Tabelle von Göke mit der Erfahrungswirklichkeit überein?

Hallo,

diese Tabelle stimmt durchaus mit den Erfahrungswerten überein - mit Ausnahme des Druckfehlers, auf den ich hingewiesen habe.
Warum Frustulia sich deutlich leichter auflösen läßt, das hat zwei Gründe:

1. Die Gitterkonstante schwankt bei dieser Art relativ stark. Man bekommt daher öfter einmal ein Exemplar mit etwas gröberer Struktur unter das Objektiv.

2. In diesem Grenzbereich der möglichen Auflösung spielt der Kontrast eine ganz wesentliche Rolle - und der ist offensichtlich bei der Struktur von Frustulia deutlicher als bei Amphipleura.

Meine Erfahrung geht ebenfalls dahin, daß sich Frustulia wesentlich leichter auflösen läßt als Amphipleura. Dabei rede ich allerdings von Auflösung im geraden, normalen Hellfeld. Letzteres ist für mich immer das Kriterium, was etwa ein bestimmtes Objektiv leistet und was nicht.

Grüße
Gunther


peter-h

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #13 am: Februar 12, 2013, 23:16:53 Nachmittag »
Hallo zusammen,

zu Einschlußmedien habe ich auf meiner HP einige Messungen zusammengestellt. F. rhomboides ist sehr viel einfacher aufzulösen als A. pellucida. Messungen an der A.p. zeigten Porenabstände von 170nm - 220nm, je nach Präparat.
Weiter ist zu bedenken, dass der Brechwert (gemessen an ZRAX) mit abnehmender Wellenlänge zunimmt.
Bei 600nm R.I.~1,69 , bei 365nm R.I.~1,755. Quarz hingegen ändert sich sehr viel weniger. Damit steigt der Kontrast mit Verringerung der Wellenlänge.

Gruß
Peter (H)

Nomarski

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Re: Kontrast und Auflösung in der Praxis
« Antwort #14 am: Februar 13, 2013, 09:41:17 Vormittag »
Hallo Rolf,

Danke für deinen Bilder zum Vergleich. Offenbar liegt in deinem Fall eine viel stärkere Nachvergrößerung vor, wenn man annimt, daß die Pleurosigmen etwa die gleiche Größe haben. Wahrscheinlich hast du dazu noch formatfüllend fotografiert.
Das habe ich in meinem Fall nun nicht, sondern habe einiges von der Aufnahme zunächst weggeschnitten, das nicht interesiert. Und es ist immer noch die vollständige Kieselalge zu sehen. Die Pixelzahl war dann aber immer noch über den vorgeschriebenen 1200x900, so daß ich skalieren mußte, für die Darstellung von Feinstrukturen eher suboptimal.

Dann wäre noch die Sache mit dem Einbettungsmedum, der Index ist in meinem Fall mit 1,65 angegeben. Mir ist aber nicht bekannt, für welche Wellenlänge dieser gelten soll.

Und zuletzt die Geschichte mit der Amphipleura, die hier angesprochen wurde. Das ist aber ein ganz anderes Kaliber und für mich jedenfalls nur mit Hilfe von Ölimmersion aufzulösen. Aber der Vergleich zwischen den Kontrastverfahren fällt in der Ebene ähnlich aus, wobei die Dunkelfeldkondensoren leider keine höhere Aperturen haben können als die Objektive und man sich mit Genzdunkelfeld begnügen muß.


Das Bild wurde auf 10µm ausgeschnitten, ich brauchte nicht weiter runterskalieren. :D

Viele Grüße
Bernd