Autor Thema: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz  (Gelesen 35374 mal)

Ronald Schulte

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HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« am: März 18, 2013, 21:32:18 Nachmittag »
Den Testis-beitrag der Dieter Stoffels in 2012 geliefert hat ist eigentlich schon nicht mehr zu verbessern aber ich versuche es doch mal auf meine eigene weise.
Ich zeige keine Methyleen Blau/Fuchsin Färbungen sondern Haematoxyline/Eosin, Toluidin und Fluoreszenz Bilder.

Ziel diesen Beitrag ist um möglich viele Details von die Spermatogonese zu zeigen und ein Fluoreszenz DNA Färbung in DAPI zu erzeugen und zu zeigen.
In mein Beitrag von Paraffin Schnitte der Hoden waren zu wenig Details zu sehen so wurde ein Maushoden nach einfache Formolfixierung eingebettet in Technovit 7100 und geschnitten am LKB 2218 Historange Mikrotom. Schnittdicke ist 1µm.
Die Schnitte werden auf den OT in ausgekochtes AD-Wasser gestreckt und getrocknet. Dann verbleiben sie 48 Stunden in Isopropanol 100%. Jetzt muss Mann den OT richtig ins Licht Spiegeln um den Schnitt noch zu finden.
Nach Färbung und eindecken wurden Bilder gemacht am Leitz Orthoplan mit ein Moticam 2300 Kamera.

Bild 1,
Zeigt den Aufbau der menschlichen Hoden. In diesen Beitrag werden Hoden der Maus gezeigt aber die Aufbau ist gleich.






Bild 2,
Ich fange gerne an mit ein großen Übersichtsbild weil das meist erklärend wirkt was und wo sich die Teile befinden.
Hier ein Teil der Hoden in ein Haematoxyline (Gill) und Alkoholische Eosin Färbung.
Ein Stitch von 148 Bilder mit ein Leitz Plan Fluotar 16x Objektiv.
A = Anschnitt von die Samenwege;
B = Rete Testis (Die Tubuli seminiferi gehen in die gestreckten Tubuli seminiferi recti über, die in das Rete testis einmünden. Es handelt sich dabei um ein System von untereinander verbundenen Gängen und abgeflachten Räumen, die von einem einschichtigen flachen oder kubischen Epithel ausgekleidet werden. Im Anschluss an das Rete testis beginnen die eigentlichen Samenwege);
C = Tunica albuginea (Der Hoden wird außen von einer kräftigen Bindegewebsschicht, Tunica albuginea, bedeckt. Die Schicht enthält viele glatte Muskelzellen. Das die Schicht weiter nicht fest verbunden aussieht und gefaltet neigt ist ein Fixierungs/entwässerungs-Artefakt);
D = Blutgefäße die noch abgefüllt sind mit Roten Blutkörperchen (Erythrozyten);
E = Tubuli seminiferi wo sich das Keimepithel aufhält






Bild 3,
Ein ‘Zoomify’-Bild ist hier zu sehen.






Bild 3a,
Den Grund das nicht alle durchschnitten schön Rund sind macht dieses Bild deutlich.





Spermatogenese,
Die Spermatogenese ist die Bildung von Spermien, also männlichen Keimzellen. Bereits pränatal als auch während der Pubertät bilden sich Spermatogonien aus den Stammzellen im Hoden (den sog. Stammspermatogonien). Nach der Pubertät können Spermatogonien zu Spermatozyten 1. Ordnung differenzieren (Zellvergrößerung). Zuvor teilen sie sich jedoch mitotisch, so dass (im Gegensatz zur Oogenese) der Bestand an Keimzellen im Organismus zeitlebens regeneriert wird (Spermatozytogenese). Die Spermatogenese kann also in drei Stufen gegliedert werden:
- Die mitotische Vermehrung;
- die meiotische Reifung;
- die Differenzierung oder Spermiogenese.

Stufen,
- Vermehrung
Im geschlechtsreifen Hoden liegen als Vorrat Stamm-Spermatogonien, aus welchen sich zwei Arten von Spermatogonien bilden: A-Spermatogonien und B-Spermatogonien. Die A-Spermatogonien gehen direkt aus den Stamm-Spermatogonien hervor und teilen sich mitotisch in zwei Tochterzellen, von denen eine bei den Stamm-Spermatogonien verbleibt, um zeitlebens eine konstante Population zu gewährleisten, während die zweite Tochterzelle sich weiter teilt. Diese neuen Zellen, die B-Spermatogonien, gehen in die nächste Phase, die Reifung.
B-Spermatogonien sind durch Zytoplasmafortsätze verbunden und bilden so Gruppen, die zusammen und gleichzeitig durch die folgenden Stadien gehen.

- Reifung
Die B-Spermatogonien wandern durch die Blut-Hoden-Schranke Richtung Hodenkanälchen (Tubuli seminiferi contorti). Jetzt werden sie als Spermatozyten 1. Ordnung (primäre Spermatozyten) bezeichnet. Diese durchlaufen dann die 1. Reifeteilung (Meiose I, Haploidisierung) und werden zu Spermatozyten 2. Ordnung (sekundäre Spermatozyten). Darauf folgend beginnt die 2. Reifeteilung (Meiose II, Äquationsteilung), woraus jeweils zwei Spermatiden hervor gehen. Es sind also aus einem Spermatozyt 1. Ordnung vier Spermatiden entstanden, welche sich durch den letzten Schritt – die Spermiogenese - zu Spermien entwickeln.

- Spermiogenese
In der Spermiogenese reifen die Spermatiden zu Spermien. Dabei kommt es zu einer Kernkondensation, einem Zellplasmaverlust und der Ausbildung einer Kinozilie (eines Schwanzes). Außerdem entsteht das Akrosom, das später dem Eindringen in die Eizelle dient, aus der Golgi-Region. Aus einem einzelnen, diploiden Spermatogonium gehen also durch Meiose vier haploide Spermien hervor, wobei zwei davon ein X-Chromosom und zwei ein Y-Chromosom tragen.

Zeitlicher Ablauf
Der Vorgang der Spermatogenese dauert etwa 64 Tage. In dieser Zeit „wandern“ die sich entwickelnden Keimzellen von der Basis der Hodenkanälchen (Tubuli seminiferi) zum Lumen der Hodenkanälchen. Wobei die mitotische Vermehrung der Spermatogonien ungefähr 16 Tage, die 1. Reifeteilung ungefähr 24 Tage, die 2. Reifeteilung nur wenige Stunden und die Spermiogenese wieder 24 Tage, dauert.



Bild 4,5,6,
Zur verdeutlichen von die Theorie.












Bild 7,
Das Keimepithel wird hier schon was deutlicher.
Objektiv Leitz Plan Fluotar 10x, Färbung: Haematoxylin nach Gill






Bild 8,
Wer voriges gut gelesen hat braucht eigentlich kein Erklärung mehr.
Keimepithel im Tubuli seminiferi.
Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x, Färbung: Haematoxylin nach Gill






Bild 9,
Keimepithel im Tubuli seminiferi.
Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x, Färbung: Haematoxylin nach Gill






Bild 10,
Keimepithel im Tubuli seminiferi.
Objektiv Leitz Plan Apo 40x, Färbung: Haematoxylin nach Gill
A = Spermatogonien;
B = Sertoli-Zellen;
C = Primäre Spermatozyten;
D = Spermatiden;
E = weitgehend ausdifferenzierte Spermatozoen, die aber noch in Taschen der Sertoli-Zellen stecken;
F = Schwänzen von Spermatozoen;
G = Myofobroblasten.






Bild 11,
Keimepithel im Tubuli seminiferi.
Objektiv Leitz Plan Apo 40x, Färbung: Haematoxylin nach Gill

Das Zytoplasma von die Sertoli-Zellen Lässt Orange angefärbte Körnchen sehen. Das könnte Lipidetropfen sein aber auch Lysosomen. Hoffe das ich später nochmal eine Perfusionsfixierung mit Formalin/Glutaraldehyde und eine nachfixierung mit Osmium-tetroxid, ausfuhren kann um noch bessere Details zu bekommen.







Bild 12,
EM Aufnahme, Vergrößerung 580x

1 = Lumen von ein Tubuli seminiferi;
2 = Sertoli Zellen;
3 = Spermatogonien;
4 = Primäre Spermatozyten;
5 = Frühe Spermatiden;
6 = Zellen von Leydig;
7 = Kapillaren und Venolen;
9 = Lymphraum.






Bild 13,
Links viele Schwänzen von Spermatozoen. Zwischen die zwei Tubuli liegen Zellen von Leydig und Erythrozyten.
Objektiv Leitz Plan Apo 40x, Färbung: Haematoxylin nach Gill






Bild 14,
Zeichnung von ein Tubuli seminiferi von Prof. Dr Mac Clara.






Bild 15,
Keimepithel gefärbt mit Toluidin Blau in Borax 1%.
Objektiv Leitz Plan Apo 63x.






Bild 16,
Keimepithel gefärbt mit Toluidin Blau in Borax 1%.
Viele Meiotische Teilungen sind sichtbar. Was auffällt ist das die Teilungen immer in Gruppen stattfindet. Wahrnehmbar im Ganzen Hoden, warum ist mir nicht bekannt.
Objektiv Leitz Plan Apo 63x.






Bild 17,
Keimepithel gefärbt mit Toluidin Blau in Borax 1%.
Viele Meiotische Teilungen sind sichtbar. Was auffällt ist das die Teilungen immer in Gruppen stattfindet. Wahrnehmbar im Ganzen Hoden, warum ist mir nicht bekannt.
Objektiv Leitz Plan Apo 63x.






Bild 18,
Keimepithel gefärbt mit nur Haematoxylin nach Gill.
Viele Meiotische Teilungen sind sichtbar. Was auffällt ist das die Teilungen immer in Gruppen stattfindet. Wahrnehmbar im Ganzen Hoden, warum ist mir nicht bekannt.
Objektiv Leitz Plan Apo403x.






Bild 19,
Keimepithel im Tubuli seminiferi.
Objektiv Leitz Plan Apo 63x, Färbung: Haematoxylin nach Gill





Den Fluoreszenz Farbstoff DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) Färbt DNA gezielt an.
Warnung: Aufgrund der DNA-bindenden Eigenschaften ist DAPI toxisch und mutagen.
Ich habe mal versucht um Technovit 7100 mit diesen Stoff an zu Färben und war überrascht das es sogar sehr gut geht.
Das DAPI wird in sehr niedrige Konzentration angeboten.
1Mikrogramm wird gelöst in 1 Milliliter AD.
Von 1 ml Stocklösung mache ich 20 Eppendorfer mit jedes 50 Mikroliter.
Diese Eppendorfer friere ich ein zwei Plastiktutchen ein die verpackt warden mit Aluminiumfolie um es für Licht zu schützen.
Wenn ein Mikroskopie/Histologie/Mikrotomie oder Farbetag auftaucht dann lasse ich ein Eppendorfer auftauen und löse es in 50ml Puffer nach Sorensen auf PH 7.4. Also etwas Basisch.
Die eigentliche Färbung ist sehr einfach.
- Den Schnitt Horizontal liegen und mit einige Tropfen DAPI bedecken,
- Fünf Minuten Färben,
- spulen mit AD,
- Schnitt trocknen und eindecken mit Depex.  



Folgende Bilder sind gemacht mit ein Leitz Ploemopak mit Filterblock ‘A’. Beleuchtung HBO100.
Ich habe die Filterdaten und Farbstoffdaten mal in ein Grafik zusammengestellt und so wird deutlich das DAPI sehr gut mit Filterblock ‘A’ zusammenpasst.
z.B. Eosin liefert mit Filterblock ‘A’ ein Pechschwarzes Bild.








Bild 20,
Alle DNA haltende Zellen Fluoreszieren weniger oder stark Blau.
Die reifenden Spermatozoen leuchten sehr schön auf aber auch z.B. die Kerne von die Sertoli-Zellen sind erkennbar.






Bild 21,
Alle DNA haltende Zellen Fluoreszieren weniger oder stark Blau.
Die reifenden Spermatozoen leuchten sehr schön auf aber auch z.B. die Kerne von die Sertoli-Zellen sind erkennbar.






Bild 22,
Alle DNA haltende Zellen Fluoreszieren weniger oder stark Blau.
Die Spermatozoen im Nebenhoden leuchten auch sehr schön.




Viel Spaß beim anschauen, grüße Ronald

« Letzte Änderung: März 18, 2013, 21:50:00 Nachmittag von Ronald Schulte »
Mikroskope:
2x Leitz Orthoplan (DL, DF, Phako, POL, AL-Fluoreszenz, AL-DIC und Diskussionseinrichtung).
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Rene

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #1 am: März 18, 2013, 22:06:29 Nachmittag »
Wow, dank je voor het meegenieten Ronald!

Groeten, René

Fahrenheit

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #2 am: März 19, 2013, 07:36:55 Vormittag »
Lieber Ronald,

eine wie immer sehr schön ausgearbeitete und perfekt bebilderte Dokumentation, die ich gerne gelesen habe.
Deine Fluoreszenzaufnahmen sind klasse!

Herzliche Grüße
Jörg
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Und hier zur Webseite des MKB: Klick !

Arbeitsmikroskop: Leica DMLS
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arturoag75

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #3 am: März 19, 2013, 09:51:13 Vormittag »
Amazing...very interesting as usual ;)

Heino Lauer

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #4 am: März 19, 2013, 13:00:14 Nachmittag »
Lieber Ronald,

eindrucksvolle Bilder zeigst Du uns, wieder einmal.

Ein lehrreicher Beitrag, und eine schöne und wertvolle Ergänzung zu Dieters Arbeit.
Vielen Dank dafür.

Herzlicher Gruß

Heino
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Johannes Kropiunig

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #5 am: März 19, 2013, 17:57:44 Nachmittag »
Hallo Roland,

ich gebe es ehrlich zu, ich selbst würde aus verschiedenen Gründen ('Mitleid, Ekel, usw.) solche Schnitte nicht machen können, deshalb bin ich Froh, dass es jemand anderes tut.
Also danke für deine immer wieder lehrreichen Beiträge!
Eine Frage kann ich mir trotzdem nicht verkneifen, hattest du beim schneiden kein mulmiges Gefühl in der Leistengegend, oder härtet man da mit der Zeit ab ?

Viele Grüße,
Johannes
Biologische Mikroskop: Zeiss Standard 16
Stereomikroskop: Lomo MBS 10
Kameras:  EOS 1100D, EOS 1000D, EOS 1000Da, und EOS 350Da Peltier gekühlt

Sag es mir - und ich werde es vergessen. Zeige es mir - und ich werde mich daran erinnern. Beteilige mich - und ich werde es verstehen.
Laotse

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #6 am: März 19, 2013, 20:57:59 Nachmittag »
@ Danke für euren Lob.

@ Johannes,
Das macht mir wenig. Beim 'Steak' essen beiße ich auch kräftig durch!

Grüße Ronald
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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #7 am: März 23, 2013, 13:07:14 Nachmittag »
Hat noch eine ein Idee was das Granulat im zytoplasma von die Sertoli Zellen in z.B. Bild 11 sein könnte?

Grüße Ronald
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Heino Lauer

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Re: HISTOLOGIE: Granula in den Sertoli Zellen
« Antwort #8 am: März 23, 2013, 14:20:53 Nachmittag »
Lieber Ronald,

nach Bucher u. Wartenberg [1] sind es "... je nach dem Funktionszustand verschiedene Einschlüsse wie Lipidtröpfchen, Glykogen und gelegentlich Eiweißkristalle, sein Enzymgehalt lässt auf eine beträchtliche Stoffwechselaktivität schließen."

Mills [2] spricht ebenfalls von Lipidtröpfchen, die im Cytoplasma enthalten sein mögen,  ergänzt aber weiter: "The cytoplasm may contain lipid vacuoles and / or granular eosinophilic material. Much of the phagocytosed material represents remnants of the residual bodies of the spermatid or degenerated earlier germ cell forms."

Herzlicher Gruß

Heino


[1] Bucher, Wartenberg: Cytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie des Menschen. 12. Auflage, Huber, Bern 1997. S.351

[2] Mills: Histology for Pathologists. 3.ed, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 2007. S.945
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Heino Lauer

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Re: HISTOLOGIE: Granula in den Sertoli Zellen
« Antwort #9 am: März 23, 2013, 14:40:34 Nachmittag »
Lieber Ronald,

im schönen Benninghoff - Drenckhahn [1] findet sich noch die folgende Erklärung: "Die Sertoli-Zelle behält aber einen Teil des Spermatiden- Zellleibes in Form eines Residualkörpers zurück. Der Residualkörper enthält Mitochondrien, Ribosomen und zahlreiche weitere Organellen des Spermatiden-Zytoplasmas. Die Sertoli-Zelle umschliesst den Residualkörper und baut ihn ab. Auch degenerierende Spermatozyten  und Spermatiden werden von Sertoli-Zellen phagozytiert und aufgelöst." Dies nur als Ergänzung zum Text von Mills und zu der von Dir gebrachten Tafel.

Herzlicher Gruß

Heino


[1] Drenckhahn (Hrsg): Benninghoff - Drenckhahn  Anatomie. 16. Aufl. Urban & Fischer München 2003. S. 809
« Letzte Änderung: März 23, 2013, 14:48:57 Nachmittag von Heino Lauer »
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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #10 am: März 23, 2013, 21:39:48 Nachmittag »
Heino,

Danke für deine Sucharbeit. So etwas dachte ich mir auch aber weis es nicht sicher. Ich hoffe das ich später nachdem ich Gewebe in Formalin und Glutaraldehyd Perfussion Fixiert habe, ich noch bessere Details bekomme.

Stimmt es das "Bucher, Wartenberg: Cytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie des Menschen" isbn: 978-3456827858 hat?
Hat das Buch gute Bilder?
Vielleicht konntest du mal ein oder zwei Seiten scannen und hier Posten oder mir mailen. Wurde das gehen?

Grüße Ronald
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Heino Lauer

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #11 am: März 23, 2013, 23:23:01 Nachmittag »
Lieber Ronald,

die ISBN stimmt. Der Bucher ist eines meiner liebsten Histologie-Bücher. Mit der 12. Auflage hat Huber dieses Werk leider eingehen lassen.
Die 8. Auflage (1973) ist für meine Begriffe die schönste und wertvollste. Bis zur 12. Auflage 1997 ist der Umfang deutlich gesunken, um die Stoffülle etwas zu reduzieren und das Werk für das Studium interessanter zu machen. Ähnlich wurde ja auch mit dem Junqueira (Springer) verfahren.

Die Abbildungen im Bucher sind gut und instruktiv, es ist aber auch ein hoher Anteil einfarbig gehalten. Wenn man erst einmal Deine Fotos gesehen hat, geht einem die Einschätzung, die Bilder seien gut, ja nicht mehr so leicht aus der Feder...

Der Bucher lebt, ganz besonders in den früheren Auflagen, von seiner enormen Detailfülle. Gerne werde ich Dir, allerdings leider erst am Montag, einige Seiten scannen.

Herzlicher Gruß

Heino
 
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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #12 am: März 24, 2013, 10:11:47 Vormittag »
Heino,

Ich warte die scanns gerne ab weil ich am Internet nichts finden kann. Du kannst sie auch mailen an: microscoop(at)ronaldschulte.nl

Grüße Ronald
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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Hoden der Maus, Spermatogonese und Fluoreszenz
« Antwort #13 am: März 24, 2013, 17:16:27 Nachmittag »

Hier noch zwei Bilder wie die OT aussehen.





Grüße Ronald
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