Pediastrum mit und ohne Fluoreszenz

Nomarski · März 22, 2013, 20:10:03 NACHMITTAGS

Hallo,

was Licht in verschiedenen Wellenlängen so alles bewirken kann:

Weißes Licht

Fluoreszenz (Blauanregung)

VG
Bernd

Ronald Schulte · März 23, 2013, 13:18:14 NACHMITTAGS

Bernd,

Wie bei mir auch ist dein durchlicht-Bild viel scharfer wie das Fluoreszenz Bild. Hast du eine Ahnung wie das kommen könnte?

Grüße Ronald

Nomarski · März 23, 2013, 15:10:08 NACHMITTAGS

Hallo Ronald,

so richtig gefällt mir das auch noch nicht, wenn man etwas trickst, wird es besser:

Das muß wohl am Chlorophyll liegen, eine Pflanzenfaser macht dabei weniger Probleme:

Das ist mit Blauanregung. Nun schau mal, was mit dem Chlorophyl passiert, wenn ich mit Violett anrege:

Fragen über Fragen...

Viele Grüße
Bernd

Rolf-Dieter Müller · März 23, 2013, 15:46:23 NACHMITTAGS

Zitat von: Nomarski in März 23, 2013, 15:10:08 NACHMITTAGS
...
Das muß wohl am Chlorophyll liegen, eine Pflanzenfaser macht dabei weniger Probleme:
...
Fragen über Fragen...

Hallo Bernd,

so fraglich ist das doch alles gar nicht.

Am Chlorophyll liegt es nicht, eher am Streulicht. Diese Erscheinung wird als Out-of-Focus-Licht bezeichnet. Diese Erscheinung und wie man es reduzieren kann, ist hier sehr schön erklärt: http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/fluoreszenz_mikroskop/5_outoffocus.htm .

Und das man bei Deiner Violettanregung eigentlich relativ wenig von dem Chlorophyll erkennen kann, spricht für die gute Qualität Deiner Filter. Die Erklärung hierfür wäre doch einmal ein schönes Mikrorätsel.

Hinzu kommt natürlich die Leistungsfähigkeite der Kamera. Die besten Fluoreszenzaufnahmen die ich bisher gesehen habe, sind Aufnahmen, die mit einer chipgekühlten Zeiss Axiocam gemacht worden sind.

Wobei ich hier von Primärfluoreszenz spreche, also ohne Tricks und doppelten Boden. Deshalb gefallen mir Deine Aufnahmen ja auch so gut, weil es halt Primärfluoreszenz ist.

Viele Grüße
Rolf-Dieter

Rawfoto · März 23, 2013, 16:24:10 NACHMITTAGS

Hallo Bernd

Auflicht und offene Aperturblende und ein moeglichst duenner Schnitt sind die Eckpunkte zur Reduktion der "Aura" ...
Mich erinnert das an IR Fotografie ohne Lichthofschutzschicht ...

Liebe Gruesse

Gerhard

Nomarski · März 23, 2013, 16:44:57 NACHMITTAGS

Hallo Rolf-Dieter,

vielen Dank für den Hinweis und den Link. Anscheinend handelt es sich hier um ein Streulichtproblem, gegen das es aber diverse Methoden zur Abhilfe gibt.

Viele Grüße
Bernd

Johannes Kropiunig · März 23, 2013, 18:58:02 NACHMITTAGS

Hallo Bernd,

wäre dein Autoscheinwerfer hell genug für die Verwendung einer Dunkelfeldblende, oder ringförmige Beleuchtung in Verbindung mit der Fluorezenz?
Es würde mich nämlich interessieren, wie dann das Ergebnis aussehen würde.

Viele Grüße,
Johannes

Eckhard F. H. · März 23, 2013, 20:54:00 NACHMITTAGS

Hallo Rolf-Dieter,
danke für die Aufklärung und den Link. Das ist für mich neu.
Gruß - EFH

Horst Wörmann · März 23, 2013, 21:48:46 NACHMITTAGS

Liebe Fluoreszenzler,

die Unschärfe speziell beim Chlorophyll liegt nicht nur an der Überstrahlung.
Hier wirkt sich auch der Bayer-Filter der Kamera nachteilig aus.
Die Chlorophyll-Fluoreszenzemission liegt bei etwa 680 nm und hat eine sehr schmale Bande. Es werden also nur die roten Pixel duch die Bayer-Maske belichtet, wie man auch aus der spektralen Empfindlichkeitskurve der von Rolf-Dieter zitierten Kamera (MRC5 von Zeiss) erkennt. Die roten Pixel machen nur 25 % aller Pixel aus, damit sinkt die Auflösung.

Gegen das Streulichtproblem gibt es nur eine Methode: konfokale Mikroskopie (oder vielleicht noch Stacking mit Dekonvolution?), siehe die von Rolf-Dieter zitierte Quelle.

Auf der anderen Seite liegt das Optimum der Chlorophyll-Anregung bei 280, 435 und 485 nm. Bei 434 nm erhält man maximale Emission; sobald man bei anderen Wellenlängen einstrahlt, wird's dunkler. Deshalb z.B. der Scenedesmus-Fluoreszenztest nach DIN 38412-33 bei 435 und 485 nm zur Anregung, Messung bei 685 nm.
Es ist also kein Wunder, daß bei Anregung mit unpassenden Wellenlängen das Chlorophyll schwache bis keine Fluoreszenz zeigt, wohl aber die Pflanzenfasern.

Viele Grüße aus Bonn
Horst

Nomarski · März 24, 2013, 13:58:39 NACHMITTAGS

Hallo Horst,

vielen Dank für die weiteren Ergänzungen zu dieser Problematik. Die Sache mit der Bayer-Maske ist mir übrigens auch noch in den Sinn gekommen. Die roten Pixel sind eben auf dem Sensor nicht so oft vertreten.
Daß man bei 435 und 485nm die größten Emissionen bekommt, deckt sich auch mit meinen Beobachtungen. Für 280nm habe ich keinen Filtersatz, zumal ich auch nicht sicher bin, ob die Xenon-Lampe in dem Bereich noch ausreichend emittiert und ob der Rest des vorhandenen optischen Systems noch mitspielen würde.

VG
Bernd

Horst Wörmann · März 24, 2013, 18:18:02 NACHMITTAGS

Lieber Bernd,

meines Wissens gibt es keine Filtersätze unterhalb 365 nm; Zeiss geht mit Filtersatz 02 nur bis 365 nm.
Außerdem macht beispielsweise das Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0,75 unterhalb 300 nm komplett zu, obwohl als Fluoreszenz-Objektiv empfohlen.
Ich mache die Messungen im UV oberhalb 365 nm nur mit dem Labor-Fluoreszenzspektrometer, das hat eine 150-W-Xenonlampe und geht bis 190 nm.

Viele Grüße
Horst

Nomarski · März 24, 2013, 19:22:06 NACHMITTAGS

Lieber Horst,

Filtersätze von Zeiss unter 365 sind mir auch nicht bekannt. Aber ich kenne eben auch nicht alles. Inzwischen habe ich mir auch mal die Methoden bei dem Link, auf den Rolf-Dieter verwiesen hat, angeschaut. Außer der Abblendungsmethode kann ich davon momentan leider nichts an vorhandenem Gerät bewerkstelligen. So habe ich den Versuch gemacht, etwas Durchlicht beizumischen:

Wenn man das noch weiter abdrosselt, kommt man auch zu diesem Zustand:

Ein Pediastrum hatte ich leider auf die Schnelle vorgefunden, daher habe ich es mit der Fragillaria-Kette probiert.

Viele Grüße
Bernd