Autor Thema: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt  (Gelesen 7145 mal)

bbb

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Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« am: August 23, 2013, 14:40:26 Nachmittag »
Hallo liebe Mikroskopiker :)

ich habe eine Knochenprobe eines Hundes aus der Zoologie bekommen.
Diese Probe ist in Müllerscher-Lösung fixiert.
Der Knochen wurde für 24 Stunden in Äther eingelegt um ihn zu entfetten.
(Keine Entkalkung!)
Nach Wässerung und Paraffin-Einbettung habe ich davon Hartschnitte mit einen Diamantmesser hergestellt.
Die Schnittdicke ist 20µm.
Gefärbt habe ich nach Schmorl (Thionin-Pikrinsäure).
Die Färbung ist nicht direkt eine Färbung sondern eine Präzipitationsmethode der Farbstoffe in Spalträume und Kerne.

Durchführung:
Entparaffinieren und Schnitte in aqua Dest. bringen
Schnitte 10 Minuten in Thionin-Lösung
kurz spülen in Wasser
Schnitte 1 Minute in Pikrinsäure-Lösung
Spülen in 70%-igem Ethanol 1 Minute
spülen in Wasser 1 Minute
Schnell entwässern mit 2 Portionen absolutem Ethanol oder Isopropanol
Xylol
Einschluss in Entellan

Ergebnis:
Kerne: purpurrot
Verzweigungen im Knochen: rot bis rotbraun
Hintergrund: gelb


Übersichtsbild 200-fach vergrößert
mehrere Osteone
Man kann sehr schön die Lamellen und Havers-Kanäle beobachten.


400-fach vergrößert
ein Osteon
man sieht sehr schön die Osteozytenlakunen und den Havers-Kanal in der Mitte


400-fach vergrößert
in diesem Bild sieht man sehr schön die Schaltlamelle (interstitielle Lamelle) die sich in der Mitte des Bildes befindet
Schaltlamellen befinden sich zwischen den Osteonen


400-fach vergrößert
ein Osteon welches im begriff ist abgebaut zu werden und durch ein neues ersetzt zu werden
daher kann man hier keine Zellkerne mehr erkennen


ein Übersichtsbild um nochmals alle Strukturen besser vergleichen zu können

Es war mein erstes mal das ich mit einem Diamantmesser Hartschnitte gemacht habe daher entschuldigt bitte das die Schnittdicke so hoch ist :)

Viel Spass beim anschauen!
Grüße



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David 15

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #1 am: August 23, 2013, 15:07:46 Nachmittag »
Hallo Max,

Sehr interessant ! Ich kann mich nicht erinnern hier schonmal Knochenschnitte gesehen zu haben. Mein Kompliment   :)

Viele Grüße
David
''Wir leben in einem gefährlichen Zeitalter. Der Mensch beherrscht die Natur, bevor er gelernt hat, sich selbst zu beherrschen.'' ( Albert Schweitzer)

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bbb

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #2 am: August 23, 2013, 15:11:04 Nachmittag »
Hallo David,
ja ich finde die Knochen-Hartschnitt-Technik ist etwas in Vergessenheit geraten, genau wie die Färbung nach Schmorl.
Und da ich solche Präparate noch nicht in meiner Sammlung hatte wollte ich es mal versuchen. :)
Vielen Dank für das Kompliment!
Grüße



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Ronald Schulte

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #3 am: August 23, 2013, 20:32:49 Nachmittag »
Max,

Genau wie David schon erwähnt hat sieht man hier nur sehr wenig Knochenschnitte. Warum wird schnell deutlich wenn man mal versucht um Knochen zu schneiden. Ich habe z.B. voriges Jahr mal eine Wirbelsäule mit Rückenmark Fixiert und dann in Trichloressigsaure entkalkt, zu mindestens das war meine Absicht. Die Knochen waren gut zu schneiden nur das Gewebe hätte schwer gelitten und sah nicht mehr so aus wie es sein sollte.
Deine Färbung sieht Prima aus obwohl ich von 'Schmorl' noch nie gehört hätte.
Kompliment du diesen Schnitt.

Grusse Ronald
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bbb

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #4 am: August 23, 2013, 20:35:27 Nachmittag »
Ronald,
vielen Dank für das Kompliment.
Ja Trichloressigsäure schädigt das Gewebe sehr stark.
Die beste Entkalkung ist immer noch mit EDTA-Lösung.
An zweiter Stelle kommt gleich die Bouin-Entkalkung die du nutzt.
Ich habe noch einige Blöcke mit Beckenkammstanzen, diese sind auch EDTA entkalkt und lassen sich prima schneiden.
Grüße



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Rawfoto

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #5 am: August 25, 2013, 11:17:12 Vormittag »
Hallo Max

Kompliment, finde ich spannend, danke für das Zeigen ...

Kannst Du bitte zum Prozess noch mehr schreiben, ich habe so etwas noch nie gemacht und keine Ahnung.

Was mir gerade durch den Kopf geht, wo schneidet man und wann schleift man (habe bei Knochen schon beides gesehen)?!?

Liebe Grüße

Gerhard
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Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

bbb

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #6 am: August 25, 2013, 20:42:07 Nachmittag »
Hallo Gerhard,
danke!

So zum Prozess:
1. Fixierung:
Es sollten Knochenstücke von maximal 0.5x0.5x1cm verwendet werden.
Die Fixierung ist beliebig, jedoch sollten keine Fixiergemische verwendet werden die entkalkend wirken. (Also zum Beispiel KEINE Bouin-Fixierung!)
Die beste Fixierung ist allerdings die Müller´sche Lösung:
2.5g Kaliumdichromat
1g Natriumsulfat
100ml aqua Dest.
Fixiert wird im dunkeln für 1 Woche.

2. Behandlung vor dem Einbetten
Das Fixiergemisch muss nun ausgewaschen werden.
Hierzu kommt der Knochen in Leitungswasser für 24 Stunden.
Es sollte sich nicht mehr gelb verfärben, daher am besten einmal nach 12 Stunden wechseln.
Die Stücke sollten nun zerkleinert werden.
Am besten in maximal 0.3x0.3x0.5cm dicke Stückchen.
Dies geschieht am besten mit einem Sägeskalpell oder einer kleinen feinen Säge.

Eine Auswahl an Sägen und Sägeskalpellen.
Anschließend kommt es für 6 Stunden in Äther um Fett zu entfernen.

3. Einbettung
Da der Knochen eh via Hartschnitt verarbeitet wird ist es nicht nötig die Entwässerung bei niedrig prozentigem Alkohol (in meinem Fall Ethanol) zu beginnen.
Also wird gleich in 2 Portionen absolutes Ethanol gebracht worin die Knochenstückchen jeweils 24 Stunden verbleiben.
Anschließend 2 Portionen Xylol.
Zum Übergang von Intermedium und Paraffin kommt eine warme Mischung aus Xylol und Paraffin zu gleichen Teilen bei 50°C für 12 Stunden.
Zuletzt kommen die Proben in 2 Portionen Paraffin bei 60°C für jeweils 12 Stunden und anschließend wird ausgegossen.

4. Schneiden
Da bei den Knochen Hartschnitten keine Schnitte mit einer Schnittdicke unter 10µm angefertigt werden brauchen die Blöcke nicht gekühlt zu werden.
Geschnitten wird mit einem Glas- oder vorzugsweise einem Diamantmesser.
Meine Schnitte wurden mit einem Diamantmesser angefertigt (1.5cm Klingenbreite).
Von welcher Firma das Messer ist weiss ich nicht da dieses ein Geschenk war.
Schnittdicke ist 20µm.

Wichtig ist das eine Einbettung nicht notwendig ist sondern ich sie ausschließlich durchführe um die Probe besser Händeln zu können.
Denn es ist schon ein Unterschied ob man ein kleines Stück Knochen versucht in das Mikrotom einzuspannen oder dieses einfach mit einem Block durchführt.


Ob man Knochenschliffe oder Knochenschnitte herstellt ist jedem selbst überlassen.
Jedoch ziehe ich die Schnitttechnik vor da beim Schleifen Blutgefäße zerstört werden die man noch mit Färbungen wie zum Beispiel der Fuchsin-Färbung darstellen könnte.

Wenn noch Fragen offen sind beantworte ich diese gern. :)
« Letzte Änderung: August 25, 2013, 20:45:39 Nachmittag von Max Bergmann »
Grüße



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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #7 am: August 26, 2013, 21:59:43 Nachmittag »
Hallo Max

Danke fuer die Beschreibung, werde den Beitrag noch ein paar Mal lesen, da steht viel unbekanntes fuer mich drinnen. Echt spitze ...

Liebe Gruesse

Gerhard
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bbb

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Re: Lamellenknochen vom Hund, Knochenhartschnitt
« Antwort #8 am: August 28, 2013, 09:53:29 Vormittag »
Hallo Gerhard,
gern geschehen.
Das freut mich sehr.
Zur Zeit überlege ich noch was mein nächstes Thema sein wird.
Grüße



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