Autor Thema: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd  (Gelesen 20358 mal)

Ronald Schulte

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HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« am: September 15, 2013, 17:30:41 Nachmittag »

In die Histologie Literatur wird oft geschrieben das eine Fixierung von Gewebe in Glutaraldehyd ein besseres Ergebnis gibt im Vergleich mit Formalin. Details werden besser/deutlicher dargestellt! (In die Elektronen Mikroskopie wird immer mit Glutaraldehyd oder eine Kombination von Formalin und Glutaraldehyd Fixiert und oft nachfixiert mit Osmiumtetroxid).
In mein versuch habe ich ein Teil von die Zunge eine Ratte Fixiert in ein Kombination von Formalin/ Glutaraldehyd und ein Teil in Gepuffertes Formalin 4%. Eingebettet wurde in Plastik (Technovit 7100).
Das FA/GA Gemisch stammt von ‘Karnovsky’   (Morris J. Karnovsky, Professor of Pathological Anatomy, Emeritus,  http://neuro.med.harvard.edu/faculty/karnovsky.html).
Rezept:
- Formaline 16%, 13ml (Frisch herstellen aus z.B. 16 Tabletten Paraformaldehyde Lösen auf 60 Grad in AD und mit 1N Natriumhydroxid Tropfenweise Justieren bis PH7.0);
- Glutaraldehyd 50% (EM grade), 5ml;
- Phosphat Puffer nach Sorensen PH 7.2, 50ml;
- AD, 32ml.
Resultat ist ein Gemisch von 100ml Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5% in Puffer mit ein PH 7,2.

Das Gewebe wurde geschnitten am LKB 2218 Historange mit ein Leica Hartmetallmesser in ‘D’ Schliff.
Mikroskopiert am Leitz Orthoplan und Fotografiert mit ein Moticam 2300.


Periphere Nerven (Theorie aus: Sobotta/Welsch),

Periphere Nerven bestehen aus Bündeln markloser und markhaltiger Axone, deren Perikarya (Zellleib) im ZNS (zentrales Nervensystem) oder in Ganglien liegen. Sie dienen der Übertragung von Informationen von der Peripherie zum ZNS und vom ZNS oder den vegetativen Ganglien zur Peripherie. In peripheren Nerven findet man Axone, Gliazellen (Schwann-Glia), Bindegewebe und Gefäße.













In diesen Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in 4% gepuffertes Formalin sind zwei periphere Nerven zu beobachten wo die Markscheiden der Nerven nicht sehr deutlich hervorkommen.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 63x, NA 1.4






Ein weiteren Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5% kommen die Markscheiden schon besser hervor.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Plan Fluotar 25x.

Mu = Muskelzelle;
K = Kern eine Muskelzelle;
Fz = Fettzelle;
Mz = Mastzelle;
P = Perineurium;
Ms = Markscheide.






Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 40x.

Mz = Mastzelle;
P = Perineurium;
Ms = Markscheide;
Ax = Axon;
Sch = Kern eine Schwann-Zelle;
Pfeilpunkten = drei kleine periphere Nerven mit zwei Markhaltige Axonen.






Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Perjod/Schiffs Reagenz (PAS).
Objektiv Leitz Planapo 40x.

Mu = Muskelzelle;
K = Kern eine Muskelzelle;
Mz = Mastzelle;
Ms = Markscheide;
Ax = Axon;
Sch = Kern eine Schwann-Zelle.






Schnitt mit eine Dicke von 1,5µm und Fixiert in Formalin 2% und Glutaraldehyd 2,5%.
Färbung: Toluidin blau in Boraxlösung.
Objektiv Leitz Planapo 63x, NA 1.4.




Viel spass beim anschauen, grusse Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
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Mikrotome:
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LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Florian Stellmacher

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #1 am: September 15, 2013, 19:12:39 Nachmittag »
Lieber Ronald,

WOW - wer braucht da noch ein Elektronenmikroskop!  ;)

Herzliche Grüße,
Florian
Vorwiegende Arbeitsmikroskope:
Zeiss Axioskop 40 (DL, Pol, AL-Fluoreszenz)
Olympus BHS (DL, Pol, Multidiskussionseinrichtung)
Leitz Orthoplan (DL, DF, Pol, AL-Fluoreszenz)
Zeiss Axiophot (DIK und AL-Fluoreszenz)
Wild M400 Fotomakroskop (DL, DF, AL, Pol)

koestlfr

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #2 am: September 15, 2013, 20:29:25 Nachmittag »
Lieber Ronald!

Grandios, sensationelle Bildqualität und hoch interessant!

Liebe Grüße
Franz
Liebe Grüße
Franz

Fahrenheit

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #3 am: September 15, 2013, 23:03:03 Nachmittag »
Lieber Ronald,

schön, mal wieder einen Deiner sehr interessanten histologischen Beiträge zu lesen! Ich weiß gar nicht, was mir besser gefällt: Deine fantastischen Bilder oder Deine eingänglichen Erläuterungen.

Herzliche Grüße
Jörg
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Arbeitsmikroskop: Leica DMLS
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bbb

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #4 am: September 15, 2013, 23:14:40 Nachmittag »
Hallo Ronald,
super Bilder und klasse gefärbt!

Allerdings muss ich etwas berichtigen:
Du meintest in der Elektronenmikroskopie wird IMMER mit Glutaraldehyd (GA) beziehungsweise einer Kombination aus GA und Formaldehyd fixiert.
Das ist so nicht richtig.
Oftmals wird bei kleinen Proben (2x2x2mm) auch nur in Osmium fixiert.
Bei noch kleineren Proben (1x1x1mm) sogar nur in Osmiumdampf.
Größere Proben fixieren wir in meinem Institut meist mit einer Mischung von Osmiumtetraoxid, Uranylacetat und Natriumperjodat.
Zwar wird GA oft und gern eingesetzt aber es ist nicht für alle elektronenmikroskopischen Untersuchungen geeignet da es auf manche nachzuweisenden Strukturen sehr aggressiv reagiert (zum Beispiel beim Nachweiß von Ribosomen und Virenstrukturen).

Aber dennoch wie gesagt eine ausser ordentlich schöne Arbeit von dir, ich freue mich jedes mal wenn ich deine Bilder sehe! :)
Grüße



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Detlef Kramer

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #5 am: September 16, 2013, 11:14:52 Vormittag »
Hallo Max,

kleine Ergänzung: GA oder GA/FA ist immer dann unerlässlich, wenn es um die Darstellung von Struktur-Proteinen geht. Das ist der Grund, warum die Mikrotubuli erst entdeckt wurden, nachdem Karnowski sein Rezept publiziert hatte. Außerdem dringen die Aldehyde schneller ins Gewebe ein und verhindern so autolytische Prozesse.

Gruß
Detlef
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Jan Kros

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #6 am: September 16, 2013, 13:59:38 Nachmittag »
hallo Ronald
ich schliessse mich andere Schreibern an
sehr schoene Bilder und gut dokumentiert

herzlichen Gruss
Jan

bbb

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #7 am: September 16, 2013, 15:39:29 Nachmittag »
Hallo Detlef,
Ich sagte ja auch nur  nicht immer ;).
Das es nicht immer komplett ohne geht weiss ich, sonst könnten wir ja verschiedene Strukturen nicht nachweisen.
Grüße



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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #8 am: September 16, 2013, 20:59:30 Nachmittag »
@*.*
Danke für eure Beitrage. Ich war schon sehr beeindruckt das es wirklich Unterschiede gibt. Das nächste Projekt wird sein um ein Teil von das gleiche Gewebe, das ich auch zusatslich Osmiert habe, in Durcupan ein zu betten (wird zur zeit durch ein Histo-Freund durchgeführt) und von das Gewebe Semidunn Schnitte an zu fertigen. Bin sehr gespannt was da vor ein Detail unterschied raus kommt.
Bilder davon werden bestimmt nochmal in ein Beitrag vorgeführt.

Grusse Ronald
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bbb

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #9 am: September 16, 2013, 21:38:49 Nachmittag »
Ronald,
ich bin gespannt drauf! ;)
Osmiumtetraoxid habe ich mir nun auch wieder bestellt.
Darin werde ich nun bald die Spinalganglien von Teichmolchen, Feuersalamandern und Chameleons fixieren. :)
Grüße



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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #10 am: September 17, 2013, 10:17:13 Vormittag »
Max,

Ich habe immer grosse mühe um Ganglien zu finden. In meine Bücher sieht es immer einfach aus aber wenn den Bauch dann geöffnet ist sieht alles doch wider was anders aus. Woran kannst du Ganglien erkennen? Hast du da zufällig was Bilder von?

Grusse Ronald
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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #11 am: September 17, 2013, 17:47:12 Nachmittag »
Ronald,
man erkennt sie nur als eine Verdickung im Bereich der Nerven die von der Medulla spinalis (dem Rückenmark) abgehen.
Sozusagen wie kleine "Knötchen" in den Nerven.
Ein Bild habe ich leider nicht.
Grüße



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Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #12 am: September 18, 2013, 08:42:14 Vormittag »
Max,

Danke, ich werde beim nächstes Projekt mal besser schauen.

Eigentlich wäre es mal gut das eine, der es beherrscht, mal ein Schnell-Kurs: 'Autopsie oder Sektion eine Ratte', organisieren möchte. Irgendwo ein Samstag in November/Dezember oder so etwas.

Grusse Ronald
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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #13 am: September 18, 2013, 11:44:09 Vormittag »
Ronald,
für Studenten biete Ich soetwas an.
Das nächste mal Im September.
Kosten:
Ratte 8€
Verbrauchsmaterial 5-7€
In Jena.
Grüße



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CaDi

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #14 am: September 18, 2013, 22:45:07 Nachmittag »
Lieber Ronald,

das sind wieder tolle Bilder :-)

Du könntest noch etwas mit der Vehicle- Osmolarität experimentieren.
Entweder mit einem Zusatz von NaCl (+ z.B. 50 oder 100 mOsmol) oder Plasmaexpander (z.B. 2-4% HES oder Dextran).
Das kann sich selbst bei einer Immersionsfixierung deutlich auf das Gewebe auswirken. Bei einer Perfusionsfixierung ist die Anpassung von Osmolarität und kolloidosmotischem Druck noch sehr viel wichtiger.

Bei Nervengewebe kann man auch mal das Griffith- full- strength ausprobieren.
Da sind es dann sogar 5% GA und 4% FA in 0.8M Na- Cacodylatpuffer. Besonders
bei Immersionsfixierungen des Gehirns soll das gut sein.

Bei so starken Fixativen wirkt sich auch die Fixativ- Osmolarität spürbar auf das Gewebe aus (deutlich über 1000mOsmol). Die Osmolarität des Vehicles (Puffer + Salze oder Plasmaexpander) hat in der Regel aber mehr Einfluss auf das Gewebe, sodass man diese bei der Berechnung stärker gewichten sollte.
Da gibt es ja die praktische "Maunsbach- Formel" in Deinem Buch :-)

Die genannten Begriffe in der Elmi sind immer etwas undeutlich finde ich. Die Behandlung mit Osmiumtetroxid ist ja eine Fixierung, eine "Osmierung" und eine Kontrastierung. Die Behandlung mit Uranylacetat ist en- bloc auch eine Fixierung und Kontrastierung, am Grid eine Kontrastierung.

Die Fixierung in der Elmi ist sehr kniffelig. Die Chemikalien reagieren relativ spezifisch. Detlef hat die Reaktion der Aldehyde ja schon angesprochen.

Früher wurde nur mit ungepuffertem Osmiumtetroxid fixiert. Palade hat 1952 die gepufferte Osmiumtetroxidfixierung vorgestellt, denn das Osmiumtetroxid reagiert mit Gewebe sauer.
Sabatini hat später die Eigenschaften von Aldehyden verglichen, Glutaraldehyd war der "Testsieger". So musste auch nicht mehr mit dem hochgiftigen Osmiumtetroxid perfundiert werden.

Stark vereinfacht könnte man vielleicht sagen:

Formaldehyd reagiert mit vielen Komponenten, vernetzt aber primär reversibel und fixiert dadurch eher schwach. So ist das Gewebe für die anschließende Verarbeitung anfälliger für Artefaktbildung.

Glutaraldehyd reagiert primär mit den Proteinen. Nukleinsäuren und Lipide werden idR. nur durch assoziierte Komponenten (Kernproteine oder Lipoproteine) fixiert. Nukleinsäuren reagieren möglicherweise bei höheren Temperaturen mit dem GA, nach Aufspaltung der Wasserstoffbrückenbindungen der DNA.

Osmiumtetroxid reagiert primär mit den Lipiden.

Die genauen Reaktionen sind meines Wissens nach nicht vollkommen geklärt. Das Glutaraldehyd soll in Lösung in mind. 13 verschiedenen Formen vorkommen, die Verteilung ist u.a. abhängig von pH und Temperatur.

Eine Primärfixierung mit FA/GA deckt bei der Immersionsfixierung m.E. ein sehr breites Spektrum ab. Mit einer anschließenden Osmierung hat man dann viele verschiedene Komponenten fixiert und für die weitere Verarbeitung stabilisiert.

Du könntest ja mal verschiedene fixierte Gewebe im Kühlschrank in Puffer lagern. Solche Gewebe können sich sehr lange gut halten. Möglicherweise bietet sich mal die Gelegenheit, das Gewebe in Epon einzubetten. Dann könnte man davon Semis und Ultras schneiden und am TEM fotografieren :-)

Ich bin sehr gespannt auf weitere Fotos und freue mich, dass Du so aufwändige Verarbeitungen meisterst.

Viele Grüße,
Carsten