Histologie: Nachweis von Granulozyten im Schnitt mit der NASDCL-Esterase

[bbb]

Hallo Forumsmitglieder und vorallem natürlich Histologie-Interessierte,
mittels der NASDCL-Esterase (Naphtol-AS-D-Chloracetat-Esterase) können neutrophile Granulozyten kenntlich gemacht werden.
Ab dem Stadium des Promyelozyten reagieren sie positiv.
Die stärkste Anfärbung besteht im Promyelozyten-Myelozyten-Stadium, bei den Stab- und Segmentkernigen fällt die Reaktion schwächer aus.
Das Gewebe sollte in Formalin (FA) oder Paraformaldehyd (PFA) fixiert werden.

Reagenzien:
Enzym-Lösung:
8 Tropfen 4%-ige methanolische Parrosanilin-Lösung zu 8 Tropfen 4%-iger wässriger Natriumnitrit-Lösung geben und 1min. reagieren lassen (Lösung wird gelblich).
80ml Phosphat-Puffer pH7.0 zugeben
20mg Naphtol-AS-D-Chloracetat in 2ml Dimethylsulfoxid lösen und zugeben
kräftig schütteln!
Filtrieren --> Fertig
Die Enzym-Lösung ist nur ca. 60min. stabil und muss daher immer frisch hergestellt werden!

Hämalaun nach Mayer
(Herstellung siehe hier: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=17948.0
 
Durchführung:
- Schnitte entparaffinieren und in Phosphatpuffer pH7.0 bringen
- Schnitte in Enzym-Lösung stellen für 30min.
- Schnitte in Leitungswasser spülen
- Kernfärbung mit Hämalaun nach Mayer für 5min.
- Schnitte in kaltem Leitungswasser spülen
- bläuen in warmen Leitungswasser für 15min.
- aufsteigende Alkoholreihe, Xylol und Eindecken

Färbeergebnis:
Kerne - blau
neutrophile Granulozyten - leuchtend rot

Das Gewebe ist in Paraformaldehyd fixiert und über Ethanol und Decalin in Paraplast Xtra-plus eingebettet.
Die Schnitte sind alle 1.5 bis 2µm dick.


Milz - Ratte
100fach Vergrößert


Milz - Ratte
200fach Vergrößert


Milz - Ratte
400fach Vergrößert


Milz - Ratte
400fach Vergrößert


Wirbelkörper (blutbildendes Knochenmark) - Mensch
entkalkt mit Na-EDTA
400fach Vergrößert


Skelettmuskel - Ratte
200fach Vergrößert


Lunge - Ratte
300fach Vergrößert


Lunge - Ratte
200fach Vergrößert


Lunge - Ratte
200fach Vergrößert


Lunge - Ratte
300fach Vergrößert


Pankreas (Ductus pancreaticus) - Ratte
100fach Vergrößert


Leber (links Nekrose) - Ratte
200fach Vergrößert


Leber (Periportalfeld/Glisson Trias) - Ratte
100fach Vergrößert


Leber (Periportalfeld/Glisson Trias) - Ratte
100fach Vergrößert


Leber - Ratte
100fach Vergrößert


Herzmuskel quer geschnitten - Ratte
200fach Vergrößert


Herzmuskel längs geschnitten - Ratte
200fach Vergrößert


Duodenum - Ratte
50fach Vergrößert


Duodenum - Ratte
100fach Vergrößert


Duodenum längs geschnitten - Ratte
200fach Vergrößert


Duodenum quer geschnitten - Ratte
200fach Vergrößert


Ileum - Ratte
100fach Vergrößert


Colon - Ratte
50fach Vergrößert


Colon - Ratte
200fach Vergrößert


braunes Fettgewebe (im Bereich der Nieren) - Ratte
200fach Vergrößert

Heute mal ein paar mehr Bilder.
Ich Scanne jetzt immer mit einem speziellen Scanner für Objektträger die Schnitte ein und mache dann aus den Scans Fotos.

Viel Spass beim anschauen !!!

[Ronald Schulte]

Max,

Eine sehr Interessante Nachweiß nur frage ich mich was denn genau nachgewiesen wird!

Die stärkste Anfärbung besteht im Promyelozyten-Myelozyten-Stadium, bei den Stab- und Segmentkernigen fällt die Reaktion schwächer aus.

Welches Enzym ist in die Promyelozyten-Myelozyten-Stadium Stärker nachweisbar wie in die Stab- und Segmentkernigen Stadium und warum ist das so?

Grüße Ronald

[bbb]

Hallo Ronald,
ja da habe ich wohl vergessen etwas mit hin zu schreiben.

Also es wird das Enzym Naphthol-AS-D-Chloroacetat (spezifische neutrophilen Esterase) nachgewiesen, dieses ist ein spezifisch in neutrophilen Granulozyten vorkommendes Enzym.
Es kann auch in Monozyten und anderen Granulozyten nachgewiesen werden, ist dort allerdings kaum bis schwach mit dieser Färbung nachzuweisen und nicht spezifisch.

Es ist in dem Stadium der Promyelozyten und Myelozyten stärker nachzuweisen weil in diesem Stadium die neutrophile Granulation ausgebildet wird und durch die Bildung eine besonders starke Enzymaktivität hat.
Die Granulation enthält unter anderem die Enzyme Lysozym, Kollagenase, Laktoferrin, Elastase, Plasminogenaktivatoren, Neuramidase, Cathepsin G und natürlich Esterase.
Wenn die Esterase-Reaktion hoch ist, reagieren auch die anderen Enzyme stark.
Bei manchen Erkrankungen können die Reaktionen auch negativ ausfallen, deis liegt dann an Fehlbildungen im Bereich der Granulation oder hat andere Gründe wie Aminosäure-Fehlbildungen.
Kurz und knapp gesagt ist die Esterase somit ein Marker für die allgemeine Funktion der Granulozyten und für den Nachweiß dieser.
Unter anderem um Infiltrate bei Entzündungen, Leukämien und anderes nachzuweisen.

Ich hoffe ich konnte deine Fragen beantworten.

[reblaus]

Hallo Max -

der Nachweis von Esterase-Aktivität dient ganz allgemein als relativ unspezifischer Vitalitätsnachweis von Zellen.

Bei Pflanzenzellen wird z.B. Fluoreszein-Diacetat als Substrat verwendet. Dieses fluoresziert nicht, ist polar und wird von der Zelle aufgenommen. Wird es aber von Esterasen in Fluoreszein und Essigsäure gespalten, entsteht ein stark gelb fluoreszierender Farbstoff, der von der Zellmembarn zurückgehalten wird und sich in der Zelle ansammelt.

Natürlich sind weder Fluoreszein-Diacetat noch Naphtol-AS-D-Chloracetat die natürlichen Substrate für die Esterasen in den Zellen - oft kennt man deren wirkliche Substrate gar nicht. Insofern müssen natürlich diese cyto-/histochemischen Analysen mit Vorsicht interpretiert werden.

Das einzige was klar zu sein scheint: Wenn unfixiert gefärbte Pflanzenzellen keine Reaktion zeigen sind sie wohl tot. Die tierischen Zellen sind aber schon fixiert und geschnitten, also garantiert tot. Nun überleben die meisten Enzyme diese Prozedur wohl nicht. Wenn einzelne Enzyme, wie hier z.B. die Esterasen dies doch tun sind die Ergebnisse natürlich noch vorsichtiger zu interpretieren.

Nichtsdestotrotz - Glückwunsch zu Deiner histochemischen Arbeit!

Rolf

[bbb]

Hallo Rolf,
danke!

In diesem Fall wurde es mit Vorsicht genossen, da die Ergebnisse zum einen Immunhistochemisch bestätigt sind und durch ein bestimmtes Interferon-Antikörper-Komplexmedikament welches bei uns in der Forschung zur Testung ist wurden Kreuzreagierende Enzyme "abgeschaltet", sozusagen ein Knock-out bestimmter reaktiver Enzymzentren.

[Florian Stellmacher]

Hallo Max,

zu ergänzen wäre, dass auch Mastzellen CAE-positv reagieren, und ich bin ziemlich sicher, dass etliche Zellen in Deinen Schnitten (z.B im der Dünndarmscheimhaut) tatsächlich Mastzellen und keine neutrophilen Granuozyten sind.

Herzliche Grüße,
Florian

[bbb]

Hallo Florian,
darauf bezieht sich ja der Enzym-Knock-Out den ich angesprochen habe.
Dabei werden die Enzymvorstufen in bestimmten Zellen wie zum Beispiel in Monozyten Und Mastzellen blockiert.
Daher sind die Zellen die in den Schnitten von mir positiv sind auch nur neutrophile Granulozyten.
Ist ja auch ein Forschungsschwerpunkte bei uns

[Florian Stellmacher]

Hallo Max,

okay, vielen Dank!

Herzliche Grüße,
Florian