Grösse der Stackschritte

[Horst Wörmann]

Lieber Wolfgang,

das mit dem Erwärmen eines POM-Blockes ist schon eine gute Idee und funktioniert beim Auflicht gut, wie ja schon eindrucksvoll gezeigt wurde. Mein Problem war aber die korrekte Köhlerbeleuchtung, die bei hoher Vergrößerung - nur dafür ist meine Einrichtung gedacht - unerläßlich ist und bedingt, daß der Kondensor nahe am Objektträger ist. Vielleicht gibt's auch beim POM-Block eine Lösung dafür?

Tobias braucht meiner Meinung nach keine Sorgen wegen der Bildqualität beim 40er zu haben. Die von Kurt angebenen Ebenenabstände sind zu gering. Unsere Profis hier arbeiten mit minmal 300 nm. Zeigt ja auch die Rechnung.

Viele Grüße
Horst

[Kurt Wirz]

Hallo Horst

Tobias braucht meiner Meinung nach keine Sorgen wegen der Bildqualität beim 40er zu haben. Die von Kurt angebenen Ebenenabstände sind zu gering. Unsere Profis hier arbeiten mit minmal 300 nm. Zeigt ja auch die Rechnung.

Verstehe ich da etwas falsch?
Mein 40er ist ein NIKON M Plan, 40/0.5 ELWD, 210/0 und für die Apertur von 0.5 zeigt meine Liste 370nm.
Du meinst somit, dass meine Abstände nicht zu gering, sondern zu gross sind??

Kurt

[Horst Wörmann]

Hallo Kurt,

bitte um Entschuldigung: ich bin von meinem Plan-Neofluar 40x/0,75 ausgegangen. Bei 0,75 Apertur komme ich nach Deiner Liste auf einen Ebenenabstand zwischen 140 und 95 nm, und das halte ich für zu gering. Nach der Formel ist die axiale Auflösung für nA 0,75, Brechungsindex 1,52 und 540 nm Wellenlänge rund 3000 nm. Bei fünffacher Überabtastung komme ich dann immer noch auf ca. 600 nm Ebenenabstand und damit weit über die 140...95 nm aus Deiner Liste.

Viele Grüße
Horst

[Kurt Wirz]

Hallo Horst
Keine Entschuldigung nötig, alles o.k.
Ich habe meine Überlegungen hier zur Diskussion gestellt und erwarte somit Fragen und ebenfalls Richtigstellungen, samt Kritik.
Bei 1:1 sind innerhalb der Tiefenschärfe (bei gleicher resultierenden Bildqualität) nicht so viele Bilder nötig wie bei 100:1.
Nach meiner Erfahrung spielt dabei der Abbildungsmassstab nicht die entscheidende Rolle, sondern die Blende/Apertur.
Ich habe versucht, dies in einer Annäherung, in eine Formel zu verpacken. Hier soll sich nun zeigen, ob diese Formel für die Füchse ist, oder ein dienlicher Hinweis.
Meine beschriebene Beobachtung bezieht sich auf einen CMOS-Bayer-Sensor mit einem Pixelpitch von 0.004mm.

Kurt

[Horst Wörmann]

Hallo Kurt,

Deine Kurve beruht auf kritischer Beobachtung und ist deshalb sicher bei geringen Vergrößerungen bestens geeignet. Bei hohen Aperturen spielt aber die Auflösungsgrenze bedingt durch die Wellenoptik eine zunehmend größere Rolle. Wollte damit nur sagen, daß die Kurve zu den hohen Aperturen nicht extrapolierbar ist. Peters Grafik führt da in die Irre. Ist wohl doch alles nicht so einfach...

Viele Grüße aus Bonn
Horst

[Kurt Wirz]

Hallo Horst

Weil es nicht so einfach ist, habe ich dieses Thema eröffnet.
Die Beobachtung hat gezeigt (sofern man die Tiefenschärfe mit λ/(Na x NA)) dass die Anzahl der nötigen Schritte innerhalb der Tiefenschärfe mit steigender Apertur, steigt.
Weshalb dies so ist, kann ich nur vermuten. So vermute ich, dass die Kurve betreffend Auflösung zu freiem Arbeitsabstand (FWD), im Bereich der Tiefenschärfe, von niedriger zu höherer Apertur, sich von platykurtic zu leptokurtic verändert?
Ich frage, ob dies abwegig ist, oder zutreffen könnte, ebenfalls frage ich, ob jemand eine klare Antwort kennt und diese hier kund tut.

Vielen Dank

Kurt

[peter-h]

Eine rein theoretische Betrachtung !

Was sicher nur sehr schwer in Bilder festzuhalten ist, kann man versuchen in theoretischen Überlegungen oder besser Rechnungen nachzuweisen. Dazu habe ich versucht aus Konstruktionsdaten eines einfachen Mikroobjektivs (Achromat) über Spotdiagramme die Größe des Einflusses in Z-Richtung zu berechnen.

Objektiv


In Z-Richtung liegt die Schrittweite bei 1µm. Das Airyscheibchen hat hier einen Durchmesser von ~2µm.


In der Bildmitte sind diese Schrittweiten sicher noch erkennbar, für einen Punkt 8mm von der Mitte im Zwischenbild entfernt, ist eine Änderung nur noch bedingt erkennbar.
Sicher gibt es bessere Objektive welche dann eine Änderung auch leichter erkennen lassen, aber diese Objektive haben fast immer auch eine höhere Apertur und damit wieder ein anderes Verhalten.

Nun wäre eine Gegenüberstellung aus der Praxis schön.  

Viel Freude bei der Betrachtung
Peter

[martin_hu]

Hallo liebe stacker

hier noch als Ergänzung meine Messungen, die ich nun wiederholt habe.
Jürgen hat die Situation in der Praxis schon erwähnt die ich hiermit bestätige.
Ich habe am Axioskop und auch am Orthoplan gemessen hier als Beispiel
am Axio, beim Orthoplan etwa das selbe Resultat.
Jeweils 1/1000mm verstellt und Messweg an der Messuhr abgelesen. (gerundet)

Stackschritt in 1/1000mm

Verstellweg/Messweg

1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 4.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 0.5
1 / 5.0
1 / 1.5
1 / 0.5
1 / 1.0

Die Präzision im denken stimmt leider nicht mit der Realität überein,
es ergeben sich riesige sprünge in der Mechanik. (bis 4.5/1000mm)
Aber es gibt ja inzwischen gute Ideen wie man das umgehen kann.

Viele Grüsse

Martin

[Rene]

Hallo Martin,

Jumps of 4.5 um wouldn't be acceptible at all for my work... No dounbt your measurements are correct, but a well maintained Olympus inverted (from the 1980's) seems to work better in that respect.

Are you going in one direction only?

Best wishes, René

[l'œil armé]

Guten Tag,

mit dem Axioscop/Axioplan u.ä. Modellen wundert mich eine mangelhafte Genauigkeit nicht, wegen des Kugelumlauf-Getriebes. Zeiss selbst ging zur Zeit dieser Modelle bei den Konfokalmikroskopen direkt an die Feintriebwelle. Dritthersteller wie zum Beispiel BioRad, die von außen über einen an den Mikrometertrieb angesetzten Schrittmotor die Z-Achse steuerten, hatten mit den gleichen Problemen, vor Allem mit mangelhafter Reproduzierbarkeit der Stackschritte zu kämpfen. Heute ist dort ein Schrittmotor eingebaut, der zwar sehr genau ist, aber andere Probleme aufwirft. Allerdings haben diese nichts mit dem Stacken zu tun.

Wenn hingegen ein Orthoplan mit seinem Trieb derartige Ungenauigkeiten produziert, dann stimmt meiner Meinung nach etwas nicht. Ist bei der Messung gegen die Schwerkraft gearbeitet worden? Wenn nicht, dann könnte hier schon der Hund begraben liegen.

Liebe Grüße

Wolfgang

[martin_hu]

Hallo Wolfgang

Das Orthoplan hat ja bekanntlich einer der besten Triebe die gebaut wurden.
Meiner ist Top in Form, aber für diese feinen Schritte reichst doch nich, es würde mich
wundern wenn das ein konventionelles Mikroskop bewältigt.
Messen kann ich, die Messuhr drückt noch mit sehr leichtem Federdruck auf den Tisch!
Ev. Könnte man den Druck noch erhöhen und so den Prozess etwas optimieren.
Oder ein System mit Rückkoppelung des Messwegs, analog oder besser digital.

Liebe Grüsse

Martin

[Stuessi]

Hallo,

hier einzelne Bilder bei einer Abstandsänderung von jeweils ca. 0,1 µm.



Gruß,
Stuessi

[Kurt Wirz]

Hallo Martin

1 µm kann man den Tisch bei einem guten Mikroskop AUFWÄRTS bewegen,
beim Hinunterschrauben, bewegt er sich nicht bei jeder Verstellung (Friktion).

Mein lieber Stuessi
Für mich sprichst du mit deinen Bildern in Hieroglyphen.
Ich bitte um Erläuterung für Dummis!

Vielen Dank

Kurt

[Eckhard F. H.]

Meiner ist Top in Form, aber für diese feinen Schritte reichst doch nich, es würde mich
wundern wenn das ein konventionelles Mikroskop bewältigt.

Hallo Martin,
das würde mich auch wundern. Ebenfalls auch, wenn sich die Industrie nicht des Problems annähme. Vor ...zig Jahren wurde von Drehern die Feinverstellung des Supportes (Passmaße) in Y-Richtung über die Verstellung der angewinkelten X-Richtung vorgenommen. Vermutlich wird dieses Prinzip irgendwann wieder aufgegriffen.
Gruß - EFH

[Stuessi]

...Nun wäre eine Gegenüberstellung aus der Praxis schön.  ...

Hallo Peter,

Dein für die Theorie gewähltes Objektiv habe ich nicht, mit einem anderen versuche ich aber eine Gegenüberstellung.

Im folgenden Beispiel wurde der Abstand zwischen Loch-Präparat und Objektiv bei meiner gewählten Kombination
NPL FLUOTAR 50x/0,85  +  NEX-5N
von Aufnahme zu Aufnahme um Delta z = 0,5 µm verringert.




Bei einem Stack würde diese Schrittweite 0,5 µm sicher ausreichen.


Gruß,
Stuessi