Präparieren/Mikroskopieren einer Zecke

Creep · November 24, 2014, 11:14:45 VORMITTAG

Hallo Mikroskopiefreunde,

letzte Woche kam meine Frau von einer Reise zurück und fand dann zufällig an sich so ein kleines Tierchen. Es ließ sich leicht entfernen (war also noch lose), sah aber verdächtig nach einer kleinen Zecke aus. Da meine Mutter schon unangenehme Erfahrungen (Borreliose) mit diesen Dingern gemacht hat, wollte ich sichergehen, was es ist und ob es schon Blut gesaugt hat. Mit einer Lupe konnten wir nicht viel erkennen, da kam ich auf die Idee, die Gelegenheit zu nutzen und "mal schnell" die ja noch recht neue und wenig gebrauchte Mikroskopieausstattung einzusetzen.

Ich hab das Viech zuerst in ein Uhrglas mit Fixierlösung gegeben, dort einige Minuten ruhen lassen, es dann mit einem Pinsel auf einen Objektträger gegeben, die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt, Magnacol aufgetropft und ein Deckglas aufgelegt.

Wie gesagt, die Aktion war völlig ungeplant. Und in der Eile hab ich natürlich nicht lange überlegt, wie die korrekte Vorgehensweise gewesen wäre. Ich vermute, für Magnacol hätte ich von der Fixierlösung erstmal über aqua dest. gehen müssen?

Jedenfalls habe ich das Tierchen dann erstmal mit dem Biolam untersucht. Zeiss Jena 3.2 semiplan Objektiv und 5x Okulare im Trinotubus. Das Ganze sah schon sehr vielversprechend aus. Im Vergleich mit Abbildungen sollte es wirklich eine Zecke sein. Und von meinem laienhaften Eindruck her sollte sie auch noch "leer" sein, also keine Gefahr. Dann hab ich schnell mal meine Canon EOS auf den Tubus gesetzt, versucht, halbwegs genau zu fokussieren und ein paar Aufnahmen gemacht. Das Ergebnis hab ich dann gestern mit einer Testversion von Helicon Focus gestackt:

Wie man sieht, habe ich den Fokus wohl nicht richtig getroffen. Ich habe auch nicht an Stacken gedacht und deswegen während der Aufnahmen nur wenig am Fokus geändert. Außerdem ist die EOS für Astronomie umgerüstet, ohne IR Filter, was sicher nochmal die Qualität verschlechtert. Für die NIKON hab ich aber den T2 Adapter so schnell nicht gefunden.

Dann habe ich das Präparat mit Muttern beschwert zwei Tage trocknen/härten lassen und den gleichen Versuch noch einmal gemacht. Diesmal habe ich die EOS auf Serienaufnahme gestellt, jeweils 10 Aufnahmen nacheinander machen lassen und währenddessen die Feinfokussierung weitergedreht. Das Ergebnis gefällt mir schon etwas besser:

Allerdings ist mir aufgefallen, daß die Zecke "lebt"

Die Lage der Beinchen hat sich deutlich verändert. Auch Kopfbereich und Unterlein sehen deutlich anders aus. Das wird natürlich daher kommen, daß das Einschlußmittel trocknet und das Deckglas immer stärker auf das Objekt drückt. Aber auch die Durchsichtigkeit des Unterleibs scheint deutlich geringer geworden zu sein.

Jetzt würde ich Euch gern um ein paar Kommentare und Anregungen bitten. Was kann ich besser machen?
Ich denke, ein paar Stückchen Faden oder Draht könnten den Druck auf das Objekt verringern. Aber führt das dann nicht zu mehr Lufteinschlüssen?
Ist Magnacol für diese Objekte geeignet oder paßt etwas anderes besser?
Wir kann ich die Schärfe verbessern? Auch im Liveview erschienen mir die Kanten nie wirklich scharf. Liegt das am fehlenden IR Filter? Dann probiere ich es mit der Nikon noch einmal.
Ist meine Vorgehensweise zum Stacken schonmal grundsätzlich richtig? Aufnahmeserie und dabei Fokussierung ändern?

Da ich ja gerade erst mit dem Mikroskopieren anfange, bin ich wirklich für jeden Hinweis dankbar!

Gruß
René

Jürgen H. · November 24, 2014, 12:37:20 NACHMITTAGS

Rene,

zum Stacken und Photographieren mögen Berufenere als ich etwas sagen.

Zitathttp://Allerdings ist mir aufgefallen, daß die Zecke "lebt"

Die Anführungszeichen hättest Du getrost weglassen können. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Zecke die Einbettung zunächst überlebt hat. Die Tierchen sind unwahrscheinlich zählebig. Selbst hochprozentiger Alkohol macht ihnen, wenn sie unversehrt sind, zunächst einmal nichts aus.

Schöne Grüße

Jürgen

Klaus Herrmann · November 24, 2014, 13:00:52 NACHMITTAGS

Hallo René,

Zecke stimmt auf jeden Fall, sie scheint auch noch den kompletten "Stechapparat" zu besitzen, saß also nicht tief in der Haut drin.

Irgendwie hat das mit dem Stapeln nicht geklappt und auf dem 2. Bild auch nicht mit dem Weißabgleich. Und da haben 3 Beine Luft gezogen - sieht man an den dunklen Rändern der Lufteinschlüsse.

Ist Magnacol wasserlöslich? Wenn ja, dann würde ich den OT in Wasser legen und die Zecke befreien, danach in Ethanol ein paar Tage und dann in Isopropanol; aus dem kannst du sie weiter verarbeiten entweder gleich in Euparal oder wenn du sie aufgehellt haben möchtest in Toluol und aus diesem in Malinol.

Creep · November 24, 2014, 14:10:01 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen, hallo Klaus,

danke für die schnellen Kommentare! Auf die Idee, daß sie das Einbetten und vor allem die Fixierlösung tatsächlich überlebt hab, bin ich wirklich nicht gekommen. Aber klar, es sind ja recht zähe Tierchen.

Ich denke, diese Zecke werde ich lieber so lassen, wie sie ist. Ich habe Angst, daß ich sonst mehr kaputtmache als verbesser. Aber jetzt gehe ich auf die Suche nach neuen Objekten und werde dann etwas sorgsamer vorgehen. Magnacol ist wasserlöslich. Ansonsten habe ich nur noch das Einschlußmittel aus dem Färbeset hier:

http://www.biologie-bedarf.de/products/388711/?PHPSESSID=5bd29e2aba0196c3028ca8cb76433378

Wo kann man Euparal oder Toluol/Malinol bestellen? Oder kann man auch mit den Kits, die dort beim biologie-bedarf angeboten werden, etwas anfangen? Haben es alle Einschlußmittel an sich, daß sie schrumpfen und damit das Objekt verformen oder gibt es auch formstabil aushärtende?

Viele Grüße
René

liftboy · November 24, 2014, 18:06:46 NACHMITTAGS

Hallo René,

das mit dem Magnacol war nichts! Das Zeug eignet sich nur für Einbettung aus wasserhaltigen Medien, nicht für Insekten und deren Derivate. Hier bleibt Dir der traditionelle Weg nicht erspart (längeres fixieren, am Besten in "Kissers Gemisch", die Alkoholreihe zügig hoch, und dann Einschluß in Euparal, oder nach Überführung in Xylol, Einschluß in Malinol oder Balsam; bei dickeren Objekten "nachtropfen" nicht vergessen).
Das richtige Fixieren ist wichtig, da sonst das Plasma im Inneren schrumpft (Henriette würde sagen:"nicht schön")
Einen kleinen Schluck Euparal könnte ich Dir zum testen schicken, Alk wirst Du wohl genug haben.

Grüße
Wolfgang

Creep · November 25, 2014, 09:10:59 VORMITTAG

Hallo Wolfgang,

das hatte ich mir schon gedacht. Du erwähntest ja damals, daß das Magnacol für Mückenlarven etc. geeignet wäre. Aber ich hatte jetzt erstmal nichts Besseres. Danke auch für Dein Angebot! Ich werde jetzt aber sowieso noch eine Gelegenheit hier aus dem Forum nutzen, um meinen Grundstock an notwendigen Reagenzien zu ergänzen. Man weiß ja nie, was einem als Nächstes über den Weg läuft. Wichtiger ist natürlich, zu wissen, was man wofür benutzt. Also mehr im Forum lesen und doch noch ein Buch außer dem Kosmos kaufen...

Das Problem mit der Dicke der Objekte bei Insekten könnte man natürlich auch durch Schnitte lösen. Ich will jetzt natürlich lieber erstmal das vorhandene Equipment benutzen und Erfahrung sammeln als viele neue Gerätschaften kaufen und dann doch nichts damit machen. Soweit ich das verstanden hab, ist mein kleines Hand-Zylindermikrotom ja vor allem für Pflanzenschnitte geeignet. Könnte man es auch für z.B. Insekten benutzen? Das Problem dabei wäre dann sicher das Einbetten in geeigneten Mitteln und die Befestigung im Mikrotom. Größere Insekten (Fliegen, Wespen usw.) fallen einem ja quasi vor die Füße. Leider weiß ich bisher damit in der Durchlichtmikroskopie noch nicht viel anzufangen.

Viele Grüße
René

Jürgen H. · November 25, 2014, 14:07:01 NACHMITTAGS

Rene,

Insekten mit einem Handzylindermikrotom zu schneiden ist zwar theoretisch mit einer Schnittdicke von etwa 10 bis 20 mü denkbar. Mein allererster Paraffinschnitt durch eine Mücke kam so zustande. Freude wirst Du auf Dauer daran nicht haben. Für die tierische Histologie brauchst Du schon ein vernünftiges schweres Mikrotom. Der Rest lässt sich verhältnismäßig einfach realisieren.

Schöne Grüße

Jürgen

Creep · November 25, 2014, 14:46:51 NACHMITTAGS

Hallo Jürgen,

ich denke, ich kann auch ohne das erstmal schon viel ausprobieren. Es gibt ja genug pflanzliche Objekte und solche, die man nicht schneiden braucht. Und ein Versuch mit Mücke, Zecke oder Regenwurm im Handmikrotom kostet ja nichts. Außer Paraffin. Wichtiger ist erstmal die Zeit dafür zu finden...

Gruß
René

liftboy · November 25, 2014, 17:46:36 NACHMITTAGS

Hallo René,

ha ha, Paraffin.... da brauchst Du dann aber noch ein Wasserbad, einen Wärmeschrank. und und und.
Ich habs aufgegeben; zum Einbettungsaufwand (Zeit und Geld) kannst Du mal Ronald Schulte oder Bodo Braunstorfinger fragen.
Vielleicht kommst Du ja nächstes Jahr zum Dörnbergtreffen, da kann man sich mal austauschen (und schnippeln).

Grüße
Wolfgang

Creep · November 25, 2014, 17:52:17 NACHMITTAGS

Hallo Wolfgang,

wenn es zeitlich paßt - gern! Bis dahin kann ich dann wenigstens etwas mitreden. Und hoffentlich nicht nur reden.

Ich probier gern immer wieder Neues aus - und laß es dann bleiben, wenn es zu aufwendig oder langweilig ist. Das Schöne bei der Mikroskopie ist, daß wohl jeder sein Gebiet finden kann und man auch mit wenig Aufwand Neues entdecken kann. Steigerung nach oben ist immer möglich. Jedenfalls werde ich sicher lieber Pflanzenzeile zersäbeln und Mikroben bewundern als ganze Mäuse in Streifen zu schneiden.

Gruß
René